• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    非洲豬瘟病毒Pig/HLJ/2018株CP2475L編碼蛋白pp220的生物信息學(xué)分析

    2021-08-10 08:08:22曹乾大戴碧紅曹雪蓮
    豬業(yè)科學(xué) 2021年7期
    關(guān)鍵詞:表位豬瘟抗原

    曹乾大 ,戴碧紅 ,曹雪蓮 ,楊 旸

    (1.富順縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,四川 自貢 643200;2.內(nèi)江職業(yè)技術(shù)學(xué)院,四川 內(nèi)江 641200;3.雁江區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,四川 資陽(yáng) 641300)

    非洲豬瘟自2018年傳入中國(guó)以來,以極快的速度在國(guó)內(nèi)傳播,給中國(guó)生豬養(yǎng)殖業(yè)造成了數(shù)千億元的經(jīng)濟(jì)損失,并且這一數(shù)字隨著疫情形勢(shì)在進(jìn)一步擴(kuò)大,對(duì)整個(gè)養(yǎng)殖環(huán)境的沖擊和經(jīng)濟(jì)的深遠(yuǎn)影響非常之大。非洲豬瘟病毒的生存能力很強(qiáng),一旦在一個(gè)區(qū)域出現(xiàn),將會(huì)形成定植,所以如何防止、凈化、根除非洲豬瘟是我國(guó)動(dòng)物疫情防控的重中之重。非洲豬瘟的病原是非洲豬瘟病毒(Africa Swine Fever virus,ASFV),CP2475L 基 因 是非洲豬瘟病毒基因組中最大的一個(gè)基因,它是參與病毒核衣殼形成的重要基因,其編碼蛋白為pp220蛋白(polyprotein 220,多聚蛋白),經(jīng)裂解加工后形成病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋 白 p150、p37、p34和 p14, 抑制CP2475L基因的表達(dá)將會(huì)導(dǎo)致病毒核衣殼和DNA的部分缺失,推測(cè)CP2475L基因可能具有銜接病毒核衣殼和囊膜的功能,pp220可能作為一個(gè)蛋白支架的作用,連接核衣殼和外部包膜[1-2]。pp220對(duì)ASFV另一個(gè)多聚蛋白前體pp62的加工有重要作用,pp62的加工需要pp220表達(dá)的核心產(chǎn)物參與才能進(jìn)行,而pp220和pp62這兩個(gè)前體的加工又依賴于ASFV主要衣殼蛋白p72的表達(dá),當(dāng)p72的表達(dá)被敲除后,pp62和pp220會(huì)形成一個(gè)拉鏈狀細(xì)長(zhǎng)的膜結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu),而pp220和pp62經(jīng)加工之后的成熟產(chǎn)物共占ASFV粒子蛋白質(zhì)量的30%左右,是核衣殼的重要組成部分,因此,多聚蛋白pp220和pp62對(duì)ASFV組裝成熟有重要作用[3-4]。目前對(duì)CP2475L基因編碼蛋白pp220的研究數(shù)據(jù)較少,文章以非洲豬瘟病毒Pig/HLJ/2018中國(guó)分離株為對(duì)象,從生物信息學(xué)角度對(duì)CP2475L基因編碼的pp220多聚蛋白進(jìn)行分析,為非洲豬瘟病毒的研究補(bǔ)充一些基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 基因獲取

    Pig/HLJ/2018株非洲豬瘟病毒CP2475L基因位于病毒基因組117 290 bp~124 720 bp,其編碼蛋白為pp220,蛋白序列獲取于NCBI,GB ID為QBH90580.1。

    1.2 分析方法

    1.2.1 pp220蛋白理化性質(zhì)分析

    利用ExPASy在線分析工具ProtParam[5](https://web.expasy.org/protparam/)對(duì)pp220的蛋白分子量、等電點(diǎn)、氨基酸結(jié)構(gòu)、原子數(shù)、疏水性等理化性質(zhì)進(jìn)行分析。

    1.2.2 蛋白跨膜區(qū)和信號(hào)肽分析

    通 過 TMHMM-2.0[6](https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0)在線服務(wù)器分析蛋白跨膜區(qū),SignalP-5.0[7](https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0)在線服務(wù)器分析蛋白信號(hào)肽。

    1.2.3 蛋白抗原指數(shù)、親水性、表面可及性、滴定曲線分析

    采用Lasergene7.0 Protean模塊對(duì)蛋白抗原指數(shù)、親水性、表面可及性、滴定曲線進(jìn)行分析。

    1.2.4 pp220優(yōu)勢(shì)B、T細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)

    采用NetSurfP-2.0在線服務(wù)器[8](https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetSurfP-2.0)、PSRSM在 線 服 務(wù) 器[9-10](http://210.44.144.20:82/protein_PSRSM/default.aspx)分析蛋白序列二級(jí)結(jié)構(gòu),對(duì)2種方法分析結(jié)果進(jìn)行綜合,去除α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角等不易形成抗原表位的區(qū)域,篩選出易形成抗原表位的區(qū)域即為潛在優(yōu)勢(shì)表位區(qū)域。采用在線分析工具BepiPred1.0[11](http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred-1.0)、IEDB[12]( http://tools.iedb.org/bcell/)分析序列B細(xì)胞抗原表位區(qū)域,兩種方法分析結(jié)果綜合得出B細(xì)胞抗原表位區(qū)域。采用NetMHC 4.0 在線服務(wù)器[13-14](http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/)、NetMHCpan-4.1 在線服務(wù) 器[15](https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetMHCpan-4.1)分析序列T細(xì)胞抗原表位區(qū)域,物種選擇豬,MHC種類的SLA-10401、SLA-20401和 SLA-30401,肽段長(zhǎng)度選擇9aa,其他參數(shù)為默認(rèn),Rank%值越低表示肽段親和力越強(qiáng),綜合結(jié)果得到T細(xì)胞抗原表位區(qū)域。綜合蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)易形成抗原表位區(qū)域和B、T細(xì)胞抗原表位分析結(jié)果,篩選出優(yōu)勢(shì)B、T細(xì)胞抗原表位。

    1.2.5 基于HLJ/2018株非洲豬瘟病毒pp220蛋白的進(jìn)化樹構(gòu)建

    通過NCBI BlastP程序獲取序列。使用Clustal X 1.83對(duì)選取的序列進(jìn)行比對(duì)。使用MEGA 5.05(Molecular Evolutionary Genetics Analysis)繪制進(jìn)化樹,Bootstrap設(shè)置為1 000次,選擇泊松模型驗(yàn)證。

    2 分析結(jié)果

    2.1 pp220理化性質(zhì)

    根據(jù)ProtParam分析結(jié)果,pp220蛋白共2 476 aa,分子質(zhì)量為28.121 905 kDa,其中亮氨酸(10.7%)、天冬氨酸(7.7%)、谷氨酸(6.6%)的占比最高,其他的組分氨基酸占比為0.3%~6.3%不等。理論等電點(diǎn)為6.13,分子式為C12548H19910N3458O3741S67,總共有39 724個(gè)原子組成。帶負(fù)電荷的氨基酸(酸性)總數(shù)為282,帶正電荷的氨基酸(堿性)總數(shù)為262。預(yù)測(cè)280 nm消光系數(shù)為235 050~235 550 M-1cm-1之間(取決于半胱氨酸形成胱氨酸的程度)。在哺乳動(dòng)物體外網(wǎng)狀細(xì)胞中的半衰期為30 h,在酵母中的半衰期大于20 h,在大腸桿菌中半衰期大于10 h。不穩(wěn)定指數(shù)為43.30。脂肪族氨基酸指數(shù)為97.02,總平均親水性為-0.296,屬于親水穩(wěn)定蛋白。

    2.2 蛋白跨膜區(qū)和信號(hào)肽分析結(jié)果

    經(jīng)分析,pp220蛋白不存在跨膜區(qū)(圖1),信號(hào)肽分析結(jié)果的可能性為0.002 1,即不存在信號(hào)肽(圖2)。

    圖1 pp220跨膜區(qū)預(yù)測(cè)結(jié)果

    圖2 信號(hào)肽分析結(jié)果

    2.3 蛋白抗原指數(shù)、親水性、表面可及性、滴定曲線分析結(jié)果

    抗原指數(shù)、親水性、表面可及性分析結(jié)果見圖3,由圖3可見pp220蛋白抗原指數(shù)分布較寬,區(qū)域相對(duì)集中、連續(xù),并且大部分區(qū)域顯示為親水區(qū)域,疏水氨基酸占比35.54%,這與ProtParam蛋白理化性質(zhì)分析結(jié)果一致。蛋白表面可及性分析結(jié)果顯示,露出表面的序列位置主要集中在4-14、27-34、44-49、84-89、96-106、113-116、204-207、223-230、245-256、308-327、350-358、366-387、394-408、454-463、476-487、504-513、549-554、561-576、591-600、632-640、681-686、740-745、824-829、845-850、874-881、925-928、962-967、984-992、1011-1017、1023-1027、1034-1037、1043-1050、1062-1071、1088-1092、1098-1103、1106-1113、1131-1138、1184-1188、1205-1209、1250-1255、1261-1267、1288-1294、1298-1303、1326-1331、1352-1355、1371-1379、1392-1400、1420-1429、1437-1442、1449-1461、1473-1478、1498-1509、1517-1520、1527-1536、1539-1544、1560-1567、1592-1600、1606-1611、1626-1635、1649-1656、1705-1709、1741-1745、1795-1803、1815-1824、1868-1871、1878-1888、1911-1914、1924-1928、1943-1948、1957-1963、1973-1988、2014-2020、2034-2047、2054-2065、2108-2113、2127-2136、2145-2151、2182-2186、2195-2206、2213-2220、2230-2237、2281-2291、2326-2335、2359-2366、2373-2381、2394-2397、2402-2410、2431-2435、2460-2471,共89個(gè)區(qū)域。蛋白滴定曲線分析結(jié)果見圖4。

    圖3 蛋白抗原指數(shù)、親水性、表面可及性分析結(jié)果

    圖4 pp220蛋白滴定曲線

    2.4 pp220優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞抗原表位分析結(jié)果

    綜合蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果及B細(xì)胞表位分析結(jié)果,選取二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果中去除α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角等不易形成抗原表位的區(qū)域之外與B細(xì)胞抗原表位分析結(jié)果重合區(qū)域的肽段,作為備選的優(yōu)勢(shì)抗原,通過整合結(jié)果,得到53條優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞抗原序列,詳見表1。

    表1 pp220優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞抗原表位分析結(jié)果統(tǒng)計(jì)

    2.5 pp220優(yōu)勢(shì)T細(xì)胞抗原表位分析結(jié)果

    綜合蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果及T細(xì)胞表位分析結(jié)果,選取二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果中去除α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角等不易形成抗原表位的區(qū)域之外與T細(xì)胞抗原表位分析結(jié)果重合區(qū)域的肽段,作為備選的優(yōu)勢(shì)抗原,再篩選強(qiáng)親和力(strong binding,SB)的肽段,得到23條優(yōu)勢(shì)T細(xì)胞抗原序列,詳見表2。

    表2 pp220優(yōu)勢(shì)T細(xì)胞抗原表位分析結(jié)果統(tǒng)計(jì)

    2.6 基于HLJ/2018株非洲豬瘟病毒pp220的進(jìn)化關(guān)系分析結(jié)果

    通過NCBI BlastP程序搜索pp220蛋白序列,選取與pp220蛋白長(zhǎng)度相近的豬源非洲豬瘟病毒pp220蛋白序列作為分析序列,篩選出其余14條序列進(jìn)行進(jìn)化關(guān)系分析。結(jié)果顯示, HLJ株pp220蛋白與格魯吉亞2007/1、2008/1株同屬一個(gè)分支,為基因Ⅱ型。從進(jìn)化樹上也可以看出,贊比亞主要流行基因Ⅰ型,肯尼亞流行IX、X型,并且烏干達(dá)2015年分離的病毒也屬基因IX型,剛果2019年分離的病毒屬于基因X型。

    3 討論

    CP2475L基因是非洲豬瘟病毒基因組中的一個(gè)大基因,其編碼pp220多聚蛋白前體,共含有2 476個(gè)氨基酸,pp220蛋白前體經(jīng)酶解后加工形成病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白p150、p37、p34和 p14,對(duì)病毒的組裝成熟有重要作用[3]。

    文章通過生物信息學(xué)手段分析了CP2475L基因編碼蛋白pp220的基礎(chǔ)信息,結(jié)果表明pp220為帶負(fù)電的酸性親水穩(wěn)定蛋白,抗原指數(shù)分布較寬,不存在跨膜區(qū)和信號(hào)肽。Andres G.等[1]的研究推測(cè)pp220可能作為一個(gè)蛋白支架作用,連接核衣殼和外部包膜,但生物信息學(xué)分析結(jié)果表明pp220蛋白不存在跨膜區(qū)和信號(hào)肽,由此推測(cè)pp220可能更多地作為蛋白支架作用,維持病毒粒子完整,而CP2475L基因的抑制表達(dá)導(dǎo)致的病毒DNA的部分缺失可能是由于pp220蛋白經(jīng)酶解加工后的產(chǎn)物與其他基因的編碼蛋白相互作用導(dǎo)致的。

    文章分別通過兩種分析方法對(duì)pp220蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和B、T細(xì)胞抗原表位進(jìn)行綜合分析,避免了單種分析方法的缺陷和不準(zhǔn)確性,經(jīng)過篩選,pp220蛋白有53條優(yōu)勢(shì)的B細(xì)胞抗原表位序列,并篩選到了23條強(qiáng)結(jié)合的優(yōu)勢(shì)T細(xì)胞抗原表位區(qū)域。優(yōu)勢(shì)T細(xì)胞抗原表位區(qū)域相對(duì)較少,由此推測(cè)單獨(dú)通過pp220構(gòu)建表位疫苗能夠激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生高水平的抗體,但是通過細(xì)胞免疫殺死病毒的能力相對(duì)較弱。通過Protean模塊分析的蛋白表面可及性表明,蛋白有89個(gè)區(qū)域有連續(xù)暴露在外的氨基酸序列,與篩選出來的優(yōu)勢(shì)B、T細(xì)胞抗原表位結(jié)果一致,這些區(qū)域可作為靶向藥物、表位疫苗篩選的對(duì)象。

    圖5 pp220進(jìn)化關(guān)系分析結(jié)果

    基于HLJ/2018株非洲豬瘟病毒pp220蛋白構(gòu)建的進(jìn)化樹顯示,HLJ株與格魯吉亞流行株同屬一個(gè)分支,均為基因Ⅱ型,目前報(bào)道的非洲豬瘟病毒至少有24個(gè)基因型,歐洲主要流行基因Ⅰ型和Ⅱ型,亞洲流行主要基因Ⅱ型。但中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所對(duì)2020年國(guó)內(nèi)采集的樣品分析結(jié)果顯示,中國(guó)已經(jīng)有自然變異的毒株出現(xiàn),分離到的22株病毒均有不同程度的變異,包括核苷酸突變、缺失、插入或短片段替換等,其中11株病毒存在核苷酸突變或缺失:HLJ/HRB1/20病毒在EP402R基因的第43-67位缺失25個(gè)核苷酸;9株病毒存在G131A突變;3株湖北分離株還存在G178A和G242A突變;HeB/Q3/20存在C301T突變,變異毒株表現(xiàn)趨勢(shì)為低致死率、低毒力,臨床癥狀進(jìn)一步弱化,水平傳播能力增強(qiáng),這對(duì)我國(guó)非洲豬瘟的防控是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)[16]。

    文章對(duì)HLJ/2018豬非洲豬瘟病毒pp220蛋白進(jìn)行了一系列的基礎(chǔ)生物信息學(xué)分析,分析結(jié)果進(jìn)一步充實(shí)了非洲豬瘟病毒的基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù),以期能夠?yàn)榉侵挢i瘟的防控提供基礎(chǔ)信息和方向。

    猜你喜歡
    表位豬瘟抗原
    H3N2流感病毒HA保守Th表位對(duì)CD4+T細(xì)胞活化及分化的影響
    豬瘟爆發(fā),豬肉還敢吃嗎?
    幸福(2019年12期)2019-05-16 02:27:44
    豬瘟病毒感染的診治
    聯(lián)合T、B細(xì)胞表位設(shè)計(jì)多肽疫苗的研究進(jìn)展①
    淺談豬瘟防治
    梅毒螺旋體TpN17抗原的表達(dá)及純化
    小反芻獸疫病毒化學(xué)合成表位多肽對(duì)小鼠的免疫效果研究
    結(jié)核分枝桿菌抗原Lppx和MT0322人T細(xì)胞抗原表位的多態(tài)性研究
    APOBEC-3F和APOBEC-3G與乙肝核心抗原的相互作用研究
    鹽酸克倫特羅人工抗原的制備與鑒定
    国产精品野战在线观看| 日本精品一区二区三区蜜桃| a级毛片免费高清观看在线播放| 哪里可以看免费的av片| 极品教师在线免费播放| 在线观看午夜福利视频| 久久99热6这里只有精品| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 中文字幕高清在线视频| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 久久久久亚洲av毛片大全| 在线国产一区二区在线| 亚洲人成伊人成综合网2020| 久久久久精品国产欧美久久久| 99热这里只有是精品50| 老司机深夜福利视频在线观看| 又黄又爽又免费观看的视频| 中文字幕av成人在线电影| 欧美bdsm另类| 午夜福利免费观看在线| 欧美成人a在线观看| 一级毛片久久久久久久久女| 国产精品久久视频播放| 欧美黑人巨大hd| 亚洲五月天丁香| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 中文字幕免费在线视频6| 日韩大尺度精品在线看网址| 又黄又爽又免费观看的视频| 日韩欧美国产一区二区入口| www.999成人在线观看| 听说在线观看完整版免费高清| 日本一二三区视频观看| 亚洲av不卡在线观看| 人人妻人人看人人澡| 亚洲人成伊人成综合网2020| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 欧美不卡视频在线免费观看| 亚洲精品亚洲一区二区| 国产精品日韩av在线免费观看| 毛片女人毛片| 九色国产91popny在线| 欧美+日韩+精品| 成人永久免费在线观看视频| 国产爱豆传媒在线观看| 亚洲av美国av| 性插视频无遮挡在线免费观看| av女优亚洲男人天堂| 亚洲欧美精品综合久久99| 成人一区二区视频在线观看| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 老司机深夜福利视频在线观看| 动漫黄色视频在线观看| 亚洲精品成人久久久久久| 国产欧美日韩精品亚洲av| 精品免费久久久久久久清纯| 国内精品久久久久久久电影| 高清在线国产一区| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 一进一出抽搐gif免费好疼| 91av网一区二区| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| av天堂在线播放| 亚洲欧美精品综合久久99| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 免费搜索国产男女视频| 久久久精品欧美日韩精品| 久久中文看片网| 国产精品一区二区性色av| 国产精品98久久久久久宅男小说| 网址你懂的国产日韩在线| 18+在线观看网站| 麻豆一二三区av精品| 国产真实乱freesex| 国内精品久久久久久久电影| 美女 人体艺术 gogo| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 桃色一区二区三区在线观看| 老司机午夜十八禁免费视频| 国产真实乱freesex| 一区二区三区免费毛片| 亚洲av电影在线进入| 亚洲av电影在线进入| 制服丝袜大香蕉在线| 一个人观看的视频www高清免费观看| 国产黄a三级三级三级人| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 欧美3d第一页| 亚洲欧美精品综合久久99| 淫妇啪啪啪对白视频| 久久久久久久久中文| .国产精品久久| 国产精品一区二区性色av| 国内精品美女久久久久久| 一个人看的www免费观看视频| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 精品国内亚洲2022精品成人| 精品久久久久久久久久免费视频| 国产大屁股一区二区在线视频| 一本精品99久久精品77| 亚洲av成人精品一区久久| 国产精品久久电影中文字幕| 久久这里只有精品中国| 一a级毛片在线观看| 午夜a级毛片| 亚洲精品日韩av片在线观看| 少妇人妻一区二区三区视频| 亚洲精品成人久久久久久| 亚洲美女视频黄频| 波多野结衣高清无吗| 在线天堂最新版资源| 欧美激情久久久久久爽电影| 在线国产一区二区在线| av视频在线观看入口| 亚洲成人精品中文字幕电影| 午夜福利成人在线免费观看| 美女cb高潮喷水在线观看| 一进一出抽搐动态| 99精品久久久久人妻精品| 久9热在线精品视频| 91久久精品国产一区二区成人| a在线观看视频网站| 欧美一区二区亚洲| 一级a爱片免费观看的视频| 两个人的视频大全免费| 国产午夜精品论理片| 在线观看舔阴道视频| 啦啦啦韩国在线观看视频| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 高清在线国产一区| 美女 人体艺术 gogo| 欧美乱妇无乱码| 久久久色成人| 91在线精品国自产拍蜜月| 一个人免费在线观看的高清视频| 国产伦人伦偷精品视频| 给我免费播放毛片高清在线观看| 久久久久精品国产欧美久久久| 一个人看视频在线观看www免费| 午夜免费成人在线视频| 午夜福利免费观看在线| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 亚洲欧美日韩东京热| 97碰自拍视频| 亚洲国产欧美人成| 一本一本综合久久| 人妻久久中文字幕网| 亚洲欧美精品综合久久99| 亚洲av.av天堂| 免费看光身美女| 精品欧美国产一区二区三| 一二三四社区在线视频社区8| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 国产黄a三级三级三级人| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 午夜福利免费观看在线| 国产黄色小视频在线观看| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 最近中文字幕高清免费大全6 | 国产成人aa在线观看| 真人一进一出gif抽搐免费| 99在线视频只有这里精品首页| 在线免费观看不下载黄p国产 | 九色国产91popny在线| 人妻夜夜爽99麻豆av| 我要看日韩黄色一级片| av黄色大香蕉| 中文亚洲av片在线观看爽| 波多野结衣高清作品| 热99re8久久精品国产| 特级一级黄色大片| 亚州av有码| 老司机午夜十八禁免费视频| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 精品久久久久久久久av| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 国产精品一及| av女优亚洲男人天堂| 亚洲一区二区三区不卡视频| 在线免费观看的www视频| 国产成人av教育| 伊人久久精品亚洲午夜| 亚洲熟妇熟女久久| 色综合欧美亚洲国产小说| av福利片在线观看| 久久精品综合一区二区三区| 99在线视频只有这里精品首页| 99久久无色码亚洲精品果冻| 欧美一区二区亚洲| 成人性生交大片免费视频hd| 观看免费一级毛片| 看十八女毛片水多多多| 国产男靠女视频免费网站| 一个人免费在线观看的高清视频| 中国美女看黄片| 久99久视频精品免费| 别揉我奶头 嗯啊视频| 国产熟女xx| 黄色一级大片看看| 亚洲美女黄片视频| www.999成人在线观看| 国产精品久久视频播放| 久久草成人影院| 99精品在免费线老司机午夜| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 日本成人三级电影网站| 一级a爱片免费观看的视频| 丰满乱子伦码专区| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 性欧美人与动物交配| 中文字幕久久专区| 亚洲专区国产一区二区| 色在线成人网| 深夜精品福利| 欧美成人a在线观看| 欧美潮喷喷水| 国产精品久久久久久精品电影| 成人av在线播放网站| 亚洲最大成人中文| 亚洲最大成人av| 午夜两性在线视频| 一二三四社区在线视频社区8| 国产精品亚洲av一区麻豆| 亚洲欧美日韩东京热| 波多野结衣高清作品| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 午夜福利在线观看吧| 看片在线看免费视频| 美女免费视频网站| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 亚洲国产精品久久男人天堂| 国产午夜福利久久久久久| 精品免费久久久久久久清纯| 国产成人欧美在线观看| 国产探花极品一区二区| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 老司机福利观看| 一区二区三区高清视频在线| 毛片一级片免费看久久久久 | 精品久久久久久成人av| 亚洲中文字幕日韩| 啪啪无遮挡十八禁网站| 成人永久免费在线观看视频| 欧美一区二区国产精品久久精品| 日本一本二区三区精品| 久久99热这里只有精品18| 精品无人区乱码1区二区| 欧美区成人在线视频| 国产精品三级大全| av在线老鸭窝| 亚洲片人在线观看| 免费看日本二区| 欧美日韩黄片免| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 国产综合懂色| 一a级毛片在线观看| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| or卡值多少钱| 高潮久久久久久久久久久不卡| 丁香欧美五月| 国产日本99.免费观看| 成年女人看的毛片在线观看| 国产伦人伦偷精品视频| 十八禁国产超污无遮挡网站| av国产免费在线观看| 欧美成狂野欧美在线观看| 搞女人的毛片| 国内揄拍国产精品人妻在线| 听说在线观看完整版免费高清| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 一区二区三区高清视频在线| 天堂动漫精品| 99久久无色码亚洲精品果冻| 中出人妻视频一区二区| 色5月婷婷丁香| 色在线成人网| 制服丝袜大香蕉在线| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 久久久国产成人精品二区| 麻豆一二三区av精品| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产欧美日韩一区二区三| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 色综合欧美亚洲国产小说| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 国产爱豆传媒在线观看| 一本综合久久免费| 日韩免费av在线播放| 91av网一区二区| 99国产精品一区二区蜜桃av| 又爽又黄a免费视频| 黄色日韩在线| 亚洲乱码一区二区免费版| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 最近最新免费中文字幕在线| 国产69精品久久久久777片| 91在线观看av| 日本免费一区二区三区高清不卡| 90打野战视频偷拍视频| 国产精品亚洲av一区麻豆| 久久久久久久久久成人| 中文字幕av成人在线电影| 色综合站精品国产| 午夜精品在线福利| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 亚洲18禁久久av| 国产精品久久电影中文字幕| 一a级毛片在线观看| 国产视频内射| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 久久国产精品人妻蜜桃| 欧美bdsm另类| 午夜福利成人在线免费观看| 日韩欧美国产一区二区入口| 日韩欧美精品免费久久 | 高清毛片免费观看视频网站| 欧美潮喷喷水| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 中文在线观看免费www的网站| 美女大奶头视频| 国产日本99.免费观看| 两个人的视频大全免费| 欧美色视频一区免费| 看十八女毛片水多多多| 亚洲av第一区精品v没综合| 看黄色毛片网站| 黄片小视频在线播放| 亚洲久久久久久中文字幕| 亚洲自拍偷在线| 无人区码免费观看不卡| 好男人电影高清在线观看| 精品一区二区三区视频在线| av在线蜜桃| 18美女黄网站色大片免费观看| 9191精品国产免费久久| 国产精品精品国产色婷婷| 国产成人a区在线观看| 欧美三级亚洲精品| 老司机深夜福利视频在线观看| 日本 av在线| 毛片一级片免费看久久久久 | 日本一二三区视频观看| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 久久精品综合一区二区三区| 欧美成人免费av一区二区三区| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| or卡值多少钱| 国产久久久一区二区三区| 久久精品91蜜桃| 一a级毛片在线观看| 日韩 亚洲 欧美在线| 久久久精品大字幕| 麻豆久久精品国产亚洲av| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 成人亚洲精品av一区二区| 全区人妻精品视频| 极品教师在线免费播放| 免费黄网站久久成人精品 | 男人的好看免费观看在线视频| 美女被艹到高潮喷水动态| 一级a爱片免费观看的视频| 亚洲欧美日韩高清专用| 亚洲欧美日韩东京热| 成年女人永久免费观看视频| 老司机午夜福利在线观看视频| 伦理电影大哥的女人| 长腿黑丝高跟| 51国产日韩欧美| 色综合婷婷激情| 91狼人影院| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 如何舔出高潮| 男人舔奶头视频| 国产亚洲精品久久久com| 网址你懂的国产日韩在线| 听说在线观看完整版免费高清| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 国产麻豆成人av免费视频| 91九色精品人成在线观看| 欧美日韩黄片免| 日韩欧美精品免费久久 | 久久久久久大精品| 直男gayav资源| 精华霜和精华液先用哪个| 欧美日韩福利视频一区二区| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 欧美在线一区亚洲| 国产伦在线观看视频一区| 亚洲av电影在线进入| 欧美潮喷喷水| 久久精品国产清高在天天线| 日本三级黄在线观看| av天堂在线播放| 国产高清视频在线观看网站| 欧美3d第一页| 亚洲专区中文字幕在线| 久久久国产成人免费| 网址你懂的国产日韩在线| 天美传媒精品一区二区| 人人妻人人看人人澡| 国产不卡一卡二| 精品一区二区三区视频在线| 黄色配什么色好看| 舔av片在线| 午夜精品一区二区三区免费看| 亚洲精品日韩av片在线观看| 美女高潮的动态| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| а√天堂www在线а√下载| 国产精品久久久久久久久免 | 国产精品日韩av在线免费观看| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 久9热在线精品视频| 国产精品亚洲美女久久久| 丰满的人妻完整版| 精品无人区乱码1区二区| 国产亚洲精品久久久久久毛片| a级毛片免费高清观看在线播放| 五月玫瑰六月丁香| 岛国在线免费视频观看| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 国产一区二区在线观看日韩| 日韩有码中文字幕| 欧美最黄视频在线播放免费| 99热精品在线国产| 国产极品精品免费视频能看的| 国产一区二区在线av高清观看| 男人狂女人下面高潮的视频| 九九在线视频观看精品| 我要看日韩黄色一级片| 国产色婷婷99| 此物有八面人人有两片| 一夜夜www| 国产熟女xx| or卡值多少钱| 国产精品人妻久久久久久| 在线免费观看的www视频| 特大巨黑吊av在线直播| 亚洲乱码一区二区免费版| 国产成人av教育| 欧美+日韩+精品| www.999成人在线观看| 亚洲美女搞黄在线观看 | 男女之事视频高清在线观看| 美女被艹到高潮喷水动态| 精品人妻视频免费看| 天天躁日日操中文字幕| 看片在线看免费视频| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 久久久久久久精品吃奶| 国产精品电影一区二区三区| 在线观看免费视频日本深夜| 日本免费a在线| 精品久久久久久成人av| 丁香欧美五月| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 欧美三级亚洲精品| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 久久久久久久久久成人| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 成人精品一区二区免费| 色哟哟哟哟哟哟| 亚洲国产精品sss在线观看| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 精品乱码久久久久久99久播| 老鸭窝网址在线观看| 国产精品电影一区二区三区| 久久国产乱子免费精品| 午夜福利在线观看吧| 啦啦啦韩国在线观看视频| 男女那种视频在线观看| 国产免费一级a男人的天堂| 毛片女人毛片| 757午夜福利合集在线观看| 欧美激情在线99| 波多野结衣巨乳人妻| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 麻豆av噜噜一区二区三区| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 久久久色成人| 久久精品91蜜桃| 亚洲五月婷婷丁香| 麻豆成人av在线观看| 亚洲无线在线观看| 久久九九热精品免费| 在线观看免费视频日本深夜| 中国美女看黄片| 黄色配什么色好看| 国产精品女同一区二区软件 | 国产黄a三级三级三级人| 国产精品永久免费网站| 大型黄色视频在线免费观看| 麻豆国产av国片精品| 12—13女人毛片做爰片一| 国产欧美日韩一区二区精品| 精品一区二区三区人妻视频| 在线观看午夜福利视频| av天堂中文字幕网| 性色avwww在线观看| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 久久久久久国产a免费观看| 在线播放国产精品三级| 日本与韩国留学比较| 在线看三级毛片| 男人舔奶头视频| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 一区二区三区免费毛片| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 99riav亚洲国产免费| 久久国产精品影院| 欧美激情在线99| 在线观看66精品国产| 久久久久九九精品影院| 在线国产一区二区在线| 乱人视频在线观看| 国产伦一二天堂av在线观看| 制服丝袜大香蕉在线| 国产毛片a区久久久久| 欧美黑人巨大hd| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 18美女黄网站色大片免费观看| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 亚洲国产欧美人成| 看片在线看免费视频| 国产精品一区二区三区四区久久| 午夜精品一区二区三区免费看| or卡值多少钱| 18+在线观看网站| 我要看日韩黄色一级片| 国产精品99久久久久久久久| 久久久久久久精品吃奶| 白带黄色成豆腐渣| 日韩av在线大香蕉| 波野结衣二区三区在线| 岛国在线免费视频观看| av福利片在线观看| 欧美成狂野欧美在线观看| 身体一侧抽搐| 在现免费观看毛片| 日韩免费av在线播放| 最新在线观看一区二区三区| 日本 av在线| 亚洲第一电影网av| 亚洲美女视频黄频| 国产成人啪精品午夜网站| 亚洲自拍偷在线| 老司机福利观看| 亚洲综合色惰| 中文字幕久久专区| 国产私拍福利视频在线观看| 亚洲人成网站高清观看| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 色5月婷婷丁香| 日日干狠狠操夜夜爽| 欧美日韩国产亚洲二区| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 亚洲中文日韩欧美视频| 日本a在线网址| 久久久久久久久中文| 国产高清有码在线观看视频| 成人特级黄色片久久久久久久| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 最好的美女福利视频网| 99热这里只有精品一区| 五月伊人婷婷丁香| 桃红色精品国产亚洲av| 不卡一级毛片| 免费在线观看亚洲国产| 美女大奶头视频| 中文字幕免费在线视频6| 高清日韩中文字幕在线| 午夜视频国产福利| 一个人免费在线观看的高清视频| 欧美+日韩+精品| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 国产主播在线观看一区二区| 国产精品一区二区免费欧美| av国产免费在线观看| 免费黄网站久久成人精品 | 亚洲美女搞黄在线观看 | 在线天堂最新版资源| 日韩亚洲欧美综合| 深夜a级毛片| 熟女人妻精品中文字幕| 小说图片视频综合网站| 最近在线观看免费完整版| 一进一出抽搐gif免费好疼| 日韩 亚洲 欧美在线| 精品久久久久久,| 欧美极品一区二区三区四区| 国产免费av片在线观看野外av| 丁香六月欧美| 国产高清有码在线观看视频| 国产午夜福利久久久久久| 两人在一起打扑克的视频| 国产伦精品一区二区三区视频9| 淫妇啪啪啪对白视频| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| av专区在线播放| 91在线精品国自产拍蜜月| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 亚洲人成伊人成综合网2020|