肝纖維化大鼠肝郁病證結(jié)合模型的建立與評(píng)價(jià)

李鑫 王權(quán) 陳思源 張逢 余曦明

摘要：目的 通過構(gòu)建肝纖維化大鼠肝郁病證結(jié)合的模型，為相關(guān)研究提供模型參考依據(jù)和臨床治療提供診療思路。方法 將30只SD大鼠隨機(jī)分成2組，即空白組和模型組，每組15只。模型組大鼠每天定期皮下注射四氯化碳（carbon tetrachloride，CCL4）+ 橄欖油，自第5周起每日加用夾尾進(jìn)行刺激，每次30min，3次/天;空白組大鼠每天定期皮下注射橄欖油，2組均連續(xù)給藥8周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后記錄動(dòng)物和肝臟重量，收集肝臟組織制作石蠟切片染色后觀察其病理變化，用ELISA法檢測血清中AST和ALT相關(guān)活力指標(biāo)。結(jié)果 （1）與空白組比較，模型組肝臟重量明顯增加（P<0.05），血清中AST和ALT的活力顯著升高（P<0.05或P<0.01）。（2）形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示：模型組大鼠肝臟出現(xiàn)了典型的肝纖維化病理改變，主要表現(xiàn)為肝組織內(nèi)纖維結(jié)締組織增生，脂肪空泡形成及相關(guān)炎性細(xì)胞浸潤等。結(jié)論 采用此種方法造?？缮叽笫笱宓腁ST和ALT活力，肝臟呈纖維化改變，成功建立了肝纖維化大鼠模型，是較為理想的造模方法。

關(guān)鍵詞：肝纖維化;大鼠;模型;肝功能

中圖分類號(hào)：R575 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B 文章編號(hào)：1007-2349（2021）06-0066-04

【Abstract】Objective： To provide a model reference basis and clinical treatment ideas for related research by constructing a model combining liver depression and syndromes in rats with liver fibrosis. Methods： 30 SD rats were randomly divided into 2 groups， namely the blank group and the model group， 15 rats per group. The rats in the model group were given regular subcutaneous injections of carbon tetrachloride （CCL4） + olive oil every day， and starting from the 5th week， the tail clamp was added every day for stimulation， 30 minutes each time， 3 times a day. The rats in the blank group were given subcutaneous injection of olive oil every day. Both groups were given continuous administration for 8 weeks. After the experiment， the weight of the animals and liver was recorded. The liver tissues were collected to make paraffin sections and stained to observe the pathological changes. ELISA method was used to detect the AST and ALT related vitality indicators in the serum. Results： （1） Compared with that of the blank group， the liver weight of the model group was significantly increased （P<0.05）， and the activity of AST and ALT in the serum was significantly increased （P<0.05 or P<0.01）. （2） The morphological results showed that the liver of the model group showed typical pathological changes of liver fibrosis， which were mainly manifested as the hyperplasia of fibrous connective tissue in the liver tissue， the formation of fatty vacuoles and the infiltration of related inflammatory cells. Conclusion： Modeling with this method can increase the activity of AST and ALT in rat serum， and the liver shows fibrotic changes. The successful establishment of a rat model of liver fibrosis is an ideal method for modeling.

【Key words】Liver fibrosis; Rat; Model; Liver Function

肝纖維化（1iver fibrosis，LF）是對(duì)各種慢性肝臟損傷的一種代償性反應(yīng)，是“慢性肝炎-肝纖維化-肝硬化”發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。目前，肝纖維化的形成被認(rèn)為是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程，涉及復(fù)雜的細(xì)胞和分子機(jī)制，導(dǎo)致組織修復(fù)機(jī)制的慢性激活。如果慢性損傷持續(xù)存在，炎癥和纖維化可能發(fā)展成肝硬化，最終導(dǎo)致器官衰竭和死亡[1]。由此可見，肝纖維化是絕大多數(shù)慢性肝病的共同病理基礎(chǔ)，同時(shí)也是多種慢性肝病向肝硬化發(fā)展的共同病理組織學(xué)基礎(chǔ)。各種肝病多數(shù)經(jīng)肝纖維化最后發(fā)展為晚期的肝硬化成為肝病死亡的主要原因。肝纖維化是嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一，但到目前為止，關(guān)于肝纖維化的治療方面，暫無理想的治療方法與治療策略，抗肝纖維化治療成了目前世界級(jí)醫(yī)學(xué)難題。針對(duì)此種情況，筆者及所在團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)通過采用大鼠皮下注射CCL4，并創(chuàng)新性的采用中醫(yī)肝郁病癥結(jié)合的干預(yù)方法，來構(gòu)建能夠模擬人體肝纖維化甚至肝硬化過程的大鼠肝纖維化動(dòng)物模型。通過檢測肝功能指標(biāo)，HE和Masson染色來追蹤肝纖維化的發(fā)病進(jìn)程，為相關(guān)實(shí)驗(yàn)提供一種較為可靠的模型參考依據(jù)，同時(shí)對(duì)肝纖維化的早期診斷、藥物干預(yù)治療方面以及改善肝硬化病情和預(yù)后方面提供了良好的思路。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用SPF級(jí)SD大鼠30只，雌雄各半，140～160 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有公司，合格證號(hào)SCXK（湘）2016-0002，飼養(yǎng)在湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，許可證號(hào)SYXK（湘）2019-0009，環(huán)境溫度20～26℃，濕度40%～60%，每天光照10h，自由飲水，喂以顆粒飼料。

1.2 藥物及主要儀器 CCL4，500 mL，分析純，由廣東光華科技股份有限公司提供，批號(hào)：20181020;橄欖油由品渥食品有限公司提供;血清AST/ALT試劑盒購自南京建成生物科技有限公司。

FA100L1電子天平：上海天平儀器總廠;TGL16型高速冷凍離心機(jī)：長沙英泰儀器有限公司;CElL-DYN3700型血液自動(dòng)分析儀：美國 Avbbott.CO;KH2002半自動(dòng)生化分析儀：濟(jì)南金浩峰技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組 將30只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2天后，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為2組：空白組和模型組，每組15只。

2.2 CCL4肝纖維化模型的建立 模型組：將CCL4與橄欖油按4∶6比例配成40%油劑，按0.3 mL/100 g劑量皮下注射，2次/周，持續(xù)8周;空白組：皮下注射橄欖油，2次/周，持續(xù)8周。

2.3 肝纖維化肝郁病證結(jié)合模型的建立 運(yùn)用中醫(yī)“怒傷肝”中醫(yī)基礎(chǔ)理論，模型組第5周開始加用慢性夾尾激怒造模：用止血鉗夾住攻擊鼠的尾巴，每次刺激30 min，3次/d，令其與其它大鼠撕打以激怒全籠大鼠，持續(xù)至第8周。

2.4 指標(biāo)測定 給藥8周后，戊巴比妥鈉麻醉后處死大鼠，取肝組織稱重，計(jì)算肝臟指數(shù)（肝臟指數(shù)100%=肝臟濕重/末次體重×100%）。剪取各組相同部位組織置于4%的多聚甲醛進(jìn)行固定，48h后脫水，石蠟包埋，切片厚度約5μm，烘片12h，肝組織病理變化采用HE染色觀察肝組織炎癥、細(xì)胞變性和肝纖維化情況，采用改良Masson染色判斷肝組織纖維增生情況。腹主動(dòng)脈采血，分離血清，ELISA法檢測血清中肝功能指標(biāo)ALT、AST的水平。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用spss22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x2±s）表示。組間差異比較用單因素方差分析，方差齊性時(shí)，采用 LSD 方法進(jìn)行組間多重比較;方差不齊時(shí)，采用 Dunnett's T3方法進(jìn)行組間多重比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠一般狀態(tài) 空白組大鼠毛色有光澤，飲食飲水正常，活動(dòng)正常，體質(zhì)量逐漸增加，生長發(fā)育狀態(tài)良好且無死亡。模型組大鼠給藥后狀態(tài)逐漸轉(zhuǎn)差，并且隨著給藥時(shí)間的延長，精神萎靡，飲水減少，食欲下降，活動(dòng)減少，被毛蓬亂無光，體質(zhì)量減輕，給藥5周后開始出現(xiàn)個(gè)別死亡。

3.2 各組大鼠肝臟指數(shù)的水平比較 如表1所示：與空白組比較，模型組肝臟指數(shù)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3.3 各組大鼠血清肝功能指標(biāo)活力的表達(dá)比較 大鼠的肝功能指標(biāo)主要體現(xiàn)在AST和ALT活力的表達(dá)，如表2所示：與空白組比較，模型組的大鼠血清AST和ALT的活力水平均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3.4 各組大鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)的變化 肝組織HE染色顯示：空白組肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)完整，界限清晰;中央靜脈旁有放射狀排列的肝細(xì)胞索;肝細(xì)胞呈多邊形，邊界清晰，胞漿豐富;匯管區(qū)結(jié)構(gòu)清晰（圖1）。模型組呈現(xiàn)出典型的肝纖維化表現(xiàn)，正常肝小葉結(jié)構(gòu)破壞;肝細(xì)胞排列紊亂，有部分出現(xiàn)變性腫脹壞死;胞內(nèi)有多量不規(guī)則的脂肪空泡形成，且中央靜脈周圍可見炎性細(xì)胞浸潤，纖維結(jié)締組織增生，甚至形成纖維間隔和假小葉（圖2）。改良Masson染色顯示：空白組肝小葉結(jié)構(gòu)清楚，未見到明顯肝纖維化表現(xiàn)（圖3）。模型組可見肝組織內(nèi)膠原纖維數(shù)量增多，有較多的纖維間隔形成（圖4）。

4 討論

中醫(yī)學(xué)中并無肝纖維化的病名記載。根據(jù)其病癥，基本當(dāng)屬于“脅痛”、“黃疸”、“鼓脹”等疾病范疇，而針對(duì)本病，中醫(yī)藥發(fā)揮多組分與多途徑的結(jié)合作用，取得了較好的臨床療效。多種動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及藥物臨床試驗(yàn)均表明，中醫(yī)藥在關(guān)于慢性肝病及抗肝纖維化的臨床療效評(píng)價(jià)、作用機(jī)制與物質(zhì)基礎(chǔ)的研究等方面取得長足進(jìn)步，并隨之出現(xiàn)一批抗肝纖維化的中藥新藥，初步建立中西結(jié)合抗肝纖維化診療指南，顯示中醫(yī)藥抗肝纖維化的治療優(yōu)勢。但在肝纖維化動(dòng)物模型方面仍沿用西醫(yī)的造模方法，采用單因素造模，模型具備肝纖維化病理?xiàng)l件，而無中醫(yī)證候特點(diǎn)，缺乏符合中醫(yī)基礎(chǔ)理論具有特異性、可靠性、重復(fù)性的動(dòng)物模型的造模方法。目前，國內(nèi)外建立肝纖維化大鼠模型的方法多種多樣，主要有以下幾種方法：（1）腹腔注射二甲基亞硝胺（dimethylnitrosaine，DMN）法：此種方法造模時(shí)間短，僅需要四周，動(dòng)物死亡率低，纖維化形成穩(wěn)定，但DMN是致癌物，實(shí)驗(yàn)過程要特別注意個(gè)人防護(hù)[2]。（2）乙醇灌胃法：持續(xù)時(shí)間12周，模型簡單易行，肝纖維化病變率高，能系統(tǒng)觀察和研究酒精性肝病早期纖維化的動(dòng)態(tài)變化，但缺點(diǎn)是造模時(shí)間長，會(huì)造成動(dòng)物產(chǎn)生厭食[3]，消疲而死亡。（3）免疫造模法：主要是腹腔注射一種血清或蛋白（豬血清、血吸蟲血清、人或牛血清白蛋白等），每周2次，連續(xù)8周。該模型特點(diǎn)是很少引起肝細(xì)胞損傷，穩(wěn)定性好，符合肝纖維化形成的慢性過程，且與人類肝纖維化的形成原因類似，適合長期慢性肝炎的臨床研究和免疫調(diào)控類藥物的篩選研究[4]。但該方法不能反映人體慢性肝炎發(fā)病機(jī)制中病毒反復(fù)復(fù)制持續(xù)攻擊人體的特點(diǎn)，與人肝纖維化的病理過程仍有很大差距。此外，該法模型復(fù)制時(shí)間長，動(dòng)物致死率較高。（4）膽總管結(jié)扎法：該復(fù)制模型機(jī)制與人的繼發(fā)性膽源性肝硬化機(jī)制相吻合，主要是通過造成肝外膽管阻塞，導(dǎo)致膽汁淤積，造成肝內(nèi)血管受壓，使肝細(xì)胞缺血、壞死。肝纖維增生延伸至膽管，包住肝小葉，引起肝纖維化。該法優(yōu)點(diǎn)是操作簡單，模型復(fù)制時(shí)間短，炎癥反應(yīng)輕，無毒，自發(fā)逆轉(zhuǎn)程度低，穩(wěn)定性良好[5]。但缺點(diǎn)是致死率高、結(jié)扎后大鼠性情暴躁、厭水厭食，不宜復(fù)制長期模型。

本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新性的根據(jù)五行理論，五志與五臟的對(duì)應(yīng)關(guān)系，采用了“怒傷肝”的中醫(yī)理論做為基礎(chǔ)，并與西醫(yī)現(xiàn)代肝纖維化造模方法結(jié)合，建立新的符合中醫(yī)證候的肝郁且符合肝纖維化診斷標(biāo)準(zhǔn)的動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組的肝臟指數(shù)、AST和ALT的活力均比空白組有明顯的升高，且肝臟組織病理特點(diǎn)與肝纖維化病理改變相似。我們認(rèn)為，此種將肝纖維化疾病與中醫(yī)證候相結(jié)合的方法是成功的，既能成功復(fù)制出與西醫(yī)肝纖維化病理特征相一致，又能體現(xiàn)中醫(yī)證候特點(diǎn)的病癥結(jié)合動(dòng)物模型，能夠?yàn)榕R床診療提供良好的思路，值得進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

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（收稿日期：2021-01-13）