固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定湘派豆干老鹵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)變化

尹樂(lè)斌，楊瑩，陳浩，趙良忠，岳子堅(jiān)

(1.邵陽(yáng)學(xué)院 食品與化學(xué)工程學(xué)院，湖南 邵陽(yáng) 422000；2.豆制品加工與安全控制湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 邵陽(yáng) 422000；3.邵陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)所，湖南 邵陽(yáng) 422000)

湘派鹵汁品質(zhì)主要包括顏色、滋味、氣味等特性，其中由于香辛料有色成分的溶入以及美拉德、焦糖化等反應(yīng)產(chǎn)物的生成，具有“藥鹵”、“浸漬”、“香辣”等特點(diǎn)[1]。鹵汁顏色較深、呈醬黑色，人眼及現(xiàn)有儀器很難判別其變化，另外，湘派鹵汁辣味較重，感官及儀器區(qū)分也較難，當(dāng)前對(duì)于風(fēng)味的評(píng)價(jià)主要依靠感官指標(biāo)，其缺點(diǎn)是評(píng)價(jià)人的主觀因素影響太大。秉承“老鹵是珍寶”的傳統(tǒng)理念，生產(chǎn)所使用的鹵汁往往是循環(huán)使用的，在反復(fù)鹵煮過(guò)程中，來(lái)自豆干和各種香料中的風(fēng)味物質(zhì)不斷積累，如游離氨基酸、醛類(lèi)、醇類(lèi)等[2]，增強(qiáng)鹵制相關(guān)特有風(fēng)味，這也成為諸多企業(yè)以“百年老鹵”作為宣傳的噱頭。豆干中脂肪含量較高，且不飽和脂肪酸含量較高，加工過(guò)程中易分解氧化產(chǎn)生低級(jí)醛、酮和脂肪酸甲酯等化合物，因此，一般認(rèn)為由脂肪氧化生成的揮發(fā)性化合物在農(nóng)產(chǎn)品的風(fēng)味形成過(guò)程中有重要作用[3]。湘派鹵汁多使用八角、桂皮、茴香等藥食同源的香辛料[4]，配以豬大骨熬煮成鹵汁，因此，鹵汁揮發(fā)性風(fēng)味主要來(lái)自于香辛料揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的釋放與轉(zhuǎn)移以及脂質(zhì)熱氧化、美拉德等反應(yīng)的產(chǎn)物，在鹵制過(guò)程中，豆干及豬大骨頭等輔料溶入到鹵汁中的氨基酸、碳水化合物等可溶性成分在高溫的催化下反應(yīng)而發(fā)生各種揮發(fā)性成分，與香辛料固有的揮發(fā)性風(fēng)味成分相互滲透、相互交融，隨著鹵汁循環(huán)使用時(shí)間的增加，逐漸形成獨(dú)特的香味，賦予豆干獨(dú)特的香味。

本文采用GC-MS/MS分析鹵汁循環(huán)使用中揮發(fā)性成分種類(lèi)及含量變化規(guī)律，確定主體揮發(fā)性成分，明確鹵汁品質(zhì)控制的客觀指標(biāo)，為更好地研究復(fù)鹵工藝對(duì)鹵豆干風(fēng)味的形成提供了科學(xué)依據(jù)，對(duì)鹵豆干的品質(zhì)的控制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本試驗(yàn)所用原料湘派鹵汁：來(lái)自產(chǎn)學(xué)研合作企業(yè)湖南某食品有限公司。該公司所使用的湘派休閑豆干生產(chǎn)線為自動(dòng)化機(jī)械作業(yè)，生產(chǎn)流程為：大豆→浸泡(去雜)→二次漿渣共熟制漿→豆清發(fā)酵液點(diǎn)漿→蹲腦→壓榨→切片→干燥→浸漬鹵制→湘派調(diào)味→預(yù)包裝→殺菌→產(chǎn)品，其中鹵制的工藝參數(shù)為溫度70 ℃、時(shí)間40 min、次數(shù)2次，采用的鹵汁是由茴香、桂皮、山奈、甘草、香葉、良姜、白蔻、八角、白芷、干辣椒等20余種香辛料反復(fù)熬煮成鹵湯，輔以食鹽、味精、肉膏等調(diào)味料配制而成，批次進(jìn)樣前補(bǔ)充新鹵汁，確保鹵汁濃度約為28 °Brix[5]。

本研究選擇公司生產(chǎn)較為穩(wěn)定的4月～10月份為采樣時(shí)段，以公司全新配制鹵汁、加料投入生產(chǎn)的第1天為采樣起點(diǎn)，每隔7 d取樣一次，連續(xù)采樣8次；連續(xù)生產(chǎn)8周后，再每隔7 d取樣一次，連續(xù)采樣8次。采樣當(dāng)日，隨機(jī)在鹵槽選3個(gè)采樣點(diǎn)(間隔不小于1 m)，每個(gè)采樣點(diǎn)在豎直方向3個(gè)不同高度分別取100 mL，合并，攤涼，置于低溫冰箱中存儲(chǔ)備用。

續(xù) 表

續(xù) 表

續(xù) 表

試驗(yàn)試劑：正己烷(色譜純)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

單面雙人超凈工作臺(tái) 愛(ài)來(lái)寶(濟(jì)南)醫(yī)療科技有限公司；DH-360AB電熱恒溫干燥箱 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；TQ8040三重四級(jí)桿氣質(zhì)聯(lián)用儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 揮發(fā)性風(fēng)味成分的提取

采用靜態(tài)頂空固相微萃取的方法進(jìn)行鹵汁中揮發(fā)性成分的提取，具體參照文獻(xiàn)[6]。

1.3.2 揮發(fā)性風(fēng)味成分的鑒定

利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)進(jìn)行鹵汁風(fēng)味成分的測(cè)定。

1.3.2.1 色譜條件

HP-5MS型石英毛細(xì)管色譜柱(30.0 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣為高純氦氣；進(jìn)樣口操作模式為不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣口溫度設(shè)定為200 ℃；程序起始溫度設(shè)定為40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升至120 ℃，保持10 min，然后以10 ℃/min升至230 ℃，保持5 min。

1.3.2.2 質(zhì)譜條件

電子電離源(Electron Ionization，EI)；電子能量為70 eV；離子源溫度為230 ℃；接口溫度為230 ℃；掃描范圍為45～500 m/z。

1.3.2.3 定性方法

利用計(jì)算機(jī)比對(duì)測(cè)試樣品對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)(National Institute of Standards and Technology,NIST)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行成分鑒定，僅報(bào)道相似指數(shù)(Similar Index)和反相似指數(shù)(Reverse Similar Index)均大于800的物質(zhì)。

1.3.2.4 定量方法

化合物相對(duì)含量按總離子圖峰面積歸一化計(jì)算。

1.4 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

每次試驗(yàn)重復(fù)3次，用SPSS 12.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 湘派鹵豆干鹵汁循環(huán)使用揮發(fā)性成分種類(lèi)

根據(jù)湘派鹵豆干鹵汁循環(huán)使用過(guò)程中的總離子圖，利用計(jì)算機(jī)比對(duì)測(cè)試樣品和系統(tǒng)自帶的NIST的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行成分鑒定，湘派鹵豆干鹵汁在循環(huán)使用過(guò)程中可定性的揮發(fā)性成分共128種，其中包含44種醇類(lèi)、5種酮類(lèi)、15種醛類(lèi)、13種酯類(lèi)、27種烴類(lèi)、8種酸類(lèi)、10種芳香族類(lèi)、5種雜環(huán)類(lèi)和1種含氮類(lèi)化合物(見(jiàn)表1)。湘派鹵豆干鹵汁不同循環(huán)使用天數(shù)下，各類(lèi)揮發(fā)性成分的種類(lèi)數(shù)量及相對(duì)含量見(jiàn)圖1。

表1 GC-MS/MS法檢測(cè)豆干鹵汁中的揮發(fā)性成分及其相對(duì)含量Table 1 The volatile components and their relative content in dried tofu brine determined by GC-MS/MS

圖1 湘派豆干鹵汁循環(huán)使用過(guò)程中主要揮發(fā)性成分種類(lèi)主要揮發(fā)性成分種類(lèi)Fig.1 The types of main volatile components during the reuse of Xiangpai dried tofu brine

由圖1可知，鹵汁在循環(huán)使用過(guò)程中，檢出的揮發(fā)性化合物有醇類(lèi)、酮類(lèi)、醛類(lèi)、酯類(lèi)、烴類(lèi)、酸類(lèi)、芳香族類(lèi)、雜環(huán)類(lèi)和含氮類(lèi)化合物，雜環(huán)類(lèi)和含氮類(lèi)化合物含量較低且種類(lèi)較少。揮發(fā)性成分種類(lèi)數(shù)量變化主要分為4個(gè)階段：先上升，再下降，再上升，再下降。

2.2 湘派鹵豆干鹵汁循環(huán)使用揮發(fā)性成分的相對(duì)含量

鹵汁在循環(huán)使用過(guò)程中，循環(huán)天數(shù)對(duì)鹵汁揮發(fā)性成分含量的影響較大，且各成分變化復(fù)雜，可能與各成分之間的復(fù)雜反應(yīng)相關(guān)。湘派鹵豆干鹵汁循環(huán)使用主要的揮發(fā)性成分有4類(lèi)：醇類(lèi)、醛類(lèi)、烴類(lèi)和芳香族類(lèi)化合物，其中烴類(lèi)化合物相對(duì)百分含量先上升后下降，最終趨于平緩的趨勢(shì)，且在烴類(lèi)物質(zhì)中，大多以不飽和烴為主，飽和烷烴含量相對(duì)較少；醛類(lèi)化合物和醇類(lèi)化合物相對(duì)百分含量變化趨勢(shì)相同，但與烴類(lèi)物質(zhì)相對(duì)百分含量變化趨勢(shì)相反，呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)；芳香族類(lèi)化合物呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢(shì)，酮類(lèi)、酯類(lèi)和酸類(lèi)這3類(lèi)化合物在揮發(fā)性成分中所占比例較小，雜環(huán)類(lèi)和含氮類(lèi)這兩類(lèi)化合物幾乎可忽略不計(jì)(見(jiàn)圖2)。鹵制循環(huán)過(guò)程中，隨著循環(huán)使用時(shí)間的增加，鹵汁品質(zhì)趨于穩(wěn)定，醛類(lèi)和芳族香類(lèi)這兩類(lèi)化合物大量產(chǎn)生，并成為鹵汁中最主要的揮發(fā)性成分，其中以醛類(lèi)占主要部分，可作為一個(gè)評(píng)價(jià)鹵汁風(fēng)味品質(zhì)成熟的客觀指標(biāo)。循環(huán)使用天數(shù)對(duì)豆干鹵汁中揮發(fā)性成分影響較大，對(duì)鹵汁風(fēng)味品質(zhì)的影響較大。

圖2 豆干鹵汁循環(huán)使用過(guò)程中風(fēng)味成分含量變化Fig.2 The changes in the content of flavor components during the reuse of dried tofu brine

飽和醇感覺(jué)閾值高，一般對(duì)鹵汁總體風(fēng)味沒(méi)有太大影響，但獨(dú)立存在時(shí)，較長(zhǎng)碳鏈的飽和醇可表現(xiàn)為青香、木香、花脂香特征[7-8]。不飽和醇閾值較低，可能對(duì)風(fēng)味起主要作用，通常具有植物香味[9]。豆干鹵汁在循環(huán)使用過(guò)程中，烴類(lèi)化合物相對(duì)百分含量較高，對(duì)鹵汁風(fēng)味貢獻(xiàn)大。在循環(huán)使用過(guò)程中均有檢測(cè)到的是1-辛烯-3-醇、4-萜烯醇、桉葉油醇和芳樟醇，這些均可能來(lái)自于配制鹵汁的香辛料中。4-萜烯醇呈現(xiàn)胡椒香和泥土香，天然4-萜烯醇主要存在于肉豆蔻、芫荽、小豆蔻和迷迭香中。桉葉油醇呈現(xiàn)樟腦氣息和草藥味，存在于迷迭香油、樟腦香油中。芳樟醇具有玲蘭香氣和香檸檬香味。1-辛烯-3-醇又稱(chēng)蘑菇醇，可能通過(guò)脂質(zhì)的酶解反應(yīng)產(chǎn)生，是豆腥味的重要物質(zhì)[10]。在百里香和鮮蘑菇中存在天然的蘑菇醇，具有蘑菇香，對(duì)風(fēng)味起重要作用[11-12]。

酮類(lèi)化合物在豆干鹵汁中檢出種類(lèi)較少，相對(duì)百分含量較低，對(duì)鹵汁風(fēng)味貢獻(xiàn)不大。酮類(lèi)化合物主要呈現(xiàn)奶油香味、青香氣味或果香[13-14]，一般來(lái)源于美拉德反應(yīng)或者脂質(zhì)的降解和氧化等。4-甲基-2-戊酮在鹵汁循環(huán)使用過(guò)程中均有檢出，可能來(lái)自β-酮酸脫羧作用或飽和脂肪酸β-氧化作用的產(chǎn)物[15]。

醛類(lèi)化合物在鹵汁循環(huán)使用過(guò)程中，檢出的相對(duì)百分含量較高，感覺(jué)閾值較低，對(duì)鹵汁風(fēng)味貢獻(xiàn)較大[16-17]，不僅能夠?yàn)辂u汁提供香氣成分，還能發(fā)生羰氨反應(yīng)，生成生香前體物質(zhì)[18]，其一般由亞油酸和亞麻酸被脂肪氧化酶分解產(chǎn)生[19]，不飽和脂肪醛類(lèi)化合物具有雞肉特征風(fēng)味[20]。豆干鹵汁在循環(huán)使用過(guò)程中，均有檢測(cè)到的醛類(lèi)物質(zhì)包括己醛、辛醛、壬醛和苯甲醛，己醛閾值低，具有青草香及蘋(píng)果香[21]；壬醛具有強(qiáng)烈的脂肪氣息，低濃度的壬醛呈現(xiàn)橙子及玫瑰香味，它們都是不飽和脂肪酸氧化產(chǎn)生的；己醛來(lái)自于w-6不飽和脂肪酸的氧化[22-24]；辛醛具有脂肪和水果氣味；低濃度的苯甲醛具有令人愉悅的堅(jiān)果香和水果香、櫻桃或杏仁味[25]。

酯類(lèi)化合物在豆干鹵汁中檢出種類(lèi)較少，相對(duì)百分含量較低，對(duì)鹵汁風(fēng)味貢獻(xiàn)不大，一般由酯化反應(yīng)或者脂質(zhì)代謝產(chǎn)生，具有酒香、花香和水果香[26]。

烴類(lèi)化合物在鹵汁循環(huán)使用過(guò)程中檢出的相對(duì)百分含量較高，烴類(lèi)感覺(jué)閾值較高，對(duì)鹵汁風(fēng)味的影響大，但部分烯烴除外[27]。豆干鹵汁在循環(huán)使用過(guò)程中均有檢測(cè)到的是茴香腦和月桂烯，其中天然茴香腦可從八角茴香中提取到，常帶有茴香和干草氣味，而天然月桂烯存在于月桂油中，具有甜橙味和香脂氣。因此，茴香腦和月桂烯可能主要來(lái)自于配制鹵汁時(shí)所用的香辛料中。

酸類(lèi)化合物在豆干鹵汁中檢出種類(lèi)較少，相對(duì)百分含量較低，對(duì)鹵汁風(fēng)味貢獻(xiàn)不大。且隨著循環(huán)使用天數(shù)的增加，酸類(lèi)化合物相對(duì)百分含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，代表酸類(lèi)化合物不斷溶入到鹵汁中，這可能是導(dǎo)致鹵汁總酸含量升高的原因。

芳香族類(lèi)化合物隨著苯環(huán)側(cè)鏈上取代基碳數(shù)的增加，氣味隨之發(fā)生改變，由果香、清香到脂肪臭的方向轉(zhuǎn)變，直至嗅感完全消失[28]。隨著鹵汁循環(huán)使用天數(shù)的增加，芳香族類(lèi)化合物相對(duì)百分含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，使得鹵汁的氣味逐漸改變，對(duì)鹵汁風(fēng)味有較大影響，其中1-(1,5-二甲基-4-己烯)-4-甲基-苯是鹵汁中檢測(cè)到含量最高的芳香族類(lèi)化合物。

雜環(huán)類(lèi)化合物和含氮類(lèi)化合物在鹵汁中相對(duì)百分含量比較少，故對(duì)鹵汁風(fēng)味貢獻(xiàn)不大，呋喃、酰胺、吡啶等雜環(huán)類(lèi)化合物可能來(lái)源于美拉德反應(yīng)或焦糖化反應(yīng)[29]。

2.3 鹵汁循環(huán)使用風(fēng)味物質(zhì)變化的主成分分析

鹵汁在循環(huán)使用過(guò)程中每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取的樣品均檢測(cè)到12種揮發(fā)性物質(zhì)，其中醛類(lèi)4種、烴類(lèi)2種、酮類(lèi)1種、醇類(lèi)4種、芳香族類(lèi)1種(見(jiàn)表2)，說(shuō)明這12類(lèi)的揮發(fā)性成分是湘派休閑豆干風(fēng)味形成的關(guān)鍵物質(zhì)，對(duì)其進(jìn)行主成分分析，各主成分的特征值和貢獻(xiàn)率見(jiàn)表2。

表2 各個(gè)主成分特征值和方差貢獻(xiàn)率Table 2 Each principal component eigenvalue and variance contribution rate

由表2可知，第一主成分、第二主成分、第三主成分和第四主成分對(duì)總體方差的貢獻(xiàn)率分別為40.686%、20.705%、17.687%和9.035%，4個(gè)主成分累積方差貢獻(xiàn)率為88.113%，能夠解釋鹵汁風(fēng)味變化的88.113%，反映出原鹵汁成分包含的信息，滿足了主成分指標(biāo)的選取要求。因此，各個(gè)主成分作為評(píng)價(jià)湘派鹵汁風(fēng)味成分變化的綜合指標(biāo)，對(duì)樣品進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，相應(yīng)的特征向量見(jiàn)表3。

表3 主成分的特征向量Table 3 Eigenvectors of principal components

由表3可知引起鹵汁揮發(fā)性成分變化的主要化合物，對(duì)第一主成分貢獻(xiàn)最大的是己醛，其次是芳香醇和茴香腦，可以確定第一主成分基本代表了己醛、芳香醇和茴香腦為組合的揮發(fā)性成分；壬醛、4-甲基-2-戊酮和1-辛烯-3-醇對(duì)第二主成分貢獻(xiàn)相當(dāng)，可以確定第二主成分代表了壬醛、4-甲基-2-戊酮和1-辛烯-3-醇為組合的揮發(fā)性成分；對(duì)第三主成分貢獻(xiàn)最大的是辛醛和1-(1,5-二甲基-4-己烯)-4-甲基-苯，可以確定第三主成分代表了辛醛和1-(1,5-二甲基-4-己烯)-4-甲基-苯為組合的揮發(fā)性成分；對(duì)第四主成分貢獻(xiàn)最大的是1-(1,5-二甲基-4-己烯)-4-甲基-苯、4-甲基-2-戊酮和月桂烯，可以確定第四主成分代表了1-(1,5-二甲基-4-己烯)-4-甲基-苯、4-甲基-2-戊酮和月桂烯為組合的揮發(fā)性成分。

3 結(jié)論

在循環(huán)使用的鹵豆干鹵汁中共定性128種揮發(fā)性成分，主要的揮發(fā)性成分有4類(lèi)，分別是醇類(lèi)、醛類(lèi)、烴類(lèi)和芳香族類(lèi)化合物。隨著循環(huán)使用時(shí)間的增加，鹵汁風(fēng)味品質(zhì)趨于穩(wěn)定，醛類(lèi)和芳香族類(lèi)化合物成為鹵汁中最主要的揮發(fā)性成分。循環(huán)天數(shù)對(duì)鹵豆干鹵汁中揮發(fā)性成分的種類(lèi)和含量影響較大，鹵豆干鹵汁中的主體揮發(fā)性成分為己醛、芳香醇、茴香腦、壬醛、4-甲基-2-戊酮、1-辛烯-3-醇、辛醛、1-(1,5-二甲基-4-己烯)-4-甲基-苯和月桂烯，代表了鹵豆干鹵汁的主成分。鹵豆干鹵汁在循環(huán)使用過(guò)程中酸類(lèi)物質(zhì)不斷升高，這可能是導(dǎo)致鹵豆干鹵汁總酸含量升高的原因。鹵豆干鹵汁中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類(lèi)及百分含量顯著，影響鹵汁品質(zhì)的穩(wěn)定性。通過(guò)提高醛類(lèi)化合物相對(duì)百分含量能促進(jìn)鹵汁風(fēng)味品質(zhì)成熟。