溫和條件下熒光硅納米顆粒的制備及其在食品中莧菜紅的檢測應(yīng)用

楊福霞,馬曉彤,韓舜愈

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅 蘭州,730070)

莧菜紅[1-(4′-磺酸基-1′-萘偶氮)-2-萘酚-3,6-二磺酸三鈉鹽]是一種水溶性偶氮合成染料,與天然染料相比,其具有對(duì)光、氧和pH穩(wěn)定性高，且具有顏色均勻、微生物污染低、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn),已作為食品著色劑在飲料和食品中廣泛使用,以增加產(chǎn)品外觀和吸引力[1-2]。然而,由于其具有高遺傳毒性、細(xì)胞毒性、抑制細(xì)胞生長的作用,過量食用莧菜紅已成為一個(gè)有損人體健康的問題[3-5]。出于食品安全考慮,糧農(nóng)聯(lián)合組織和世界衛(wèi)生組織食品添加劑專家委員會(huì)建議莧菜紅的每日允許攝入量應(yīng)在0～0.5 mg/kg[6-7],我國《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB 2760—2011)嚴(yán)格規(guī)定食品中莧菜紅最大使用限量為0.05 g/kg。但是,仍有一些非法商業(yè)食品生產(chǎn)商在其產(chǎn)品中添加過量的莧菜紅。因此,嚴(yán)格控制食品中莧菜紅的含量對(duì)人類健康和食品安全至關(guān)重要。

迄今為止,已報(bào)道了很多莧菜紅的檢測方法,常用的方法有毛細(xì)管電泳法[8-9]、電化學(xué)方法[10-11]、分光光度法[12-13]、高效液相色譜法[14-15],薄層色譜法[16]。其中,分光光度法、毛細(xì)管電泳法的靈敏度較低、線性范圍較窄、檢出限較高；高效液相色譜法雖靈敏度高,對(duì)含復(fù)雜組分的樣品分析優(yōu)勢較明顯,但樣品的前處理時(shí)間較長,并且操作者需要具備一定的技術(shù)積累,同時(shí)所需的儀器價(jià)格比較昂貴。因此,發(fā)展快速、靈敏、簡單、高效的檢測莧菜紅的方法具有極其重要的意義。

近年來,熒光納米顆粒由于發(fā)光顏色可調(diào)、激發(fā)波長獨(dú)立、發(fā)射窄、長期光穩(wěn)定性和高量子產(chǎn)率等一些優(yōu)良的特性而被用于構(gòu)建靈敏度高、選擇性好、操作簡單等優(yōu)異性能的熒光檢測傳感器[17-18]。熒光納米顆粒在生物醫(yī)學(xué)和化學(xué)分析領(lǐng)域受到越來越多的關(guān)注,常用于金屬離子[19]、藥物殘留[20]和污染物分析[21]等,卻鮮見于有關(guān)食品安全分析的報(bào)道。其中,熒光硅納米顆粒(silicon nanoparticles,SiNPs)不僅水溶性好、光穩(wěn)定性強(qiáng)、無毒,且擁有較高的熒光量子產(chǎn)率和豐富的硅源,在分析檢測、生物成像和藥物傳遞等領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊[22-26]。

本研究建立一種無毒、快速和靈敏的熒光SiNPs探針檢測莧菜紅。以3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基-三甲氧基硅烷為硅源,抗壞血酸為還原劑制備水溶性的熒光SiNPs,所制備的SiNPs熱穩(wěn)定性高,鹽穩(wěn)定性和水溶性良好。建立的測定莧菜紅的熒光分析方法具有快速、靈敏、高選擇性,并用于測定實(shí)際樣品中莧菜紅的含量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

碳酸飲料和水果糖購自當(dāng)?shù)爻校?-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基-三甲氧基硅烷,上海阿拉丁生化科技有限公司；L-抗壞血酸鈉、NaCl,天津市大茂化學(xué)試劑廠；葡萄糖、苯甲酸鈉,天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；山梨酸鉀,天津市百世化工有限公司；檸檬酸,上海中秦化學(xué)試劑有限公司；抗壞血酸、檸檬黃,天津益仁達(dá)化工有限公司；莧菜紅,上海源葉生物科技有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Tecnai G2F30型透射電子顯微鏡,FEI公司；FTIR-650型傅里葉紅外光譜儀,天津港東科技股份有限公司；F-4700型熒光分光光度計(jì),日立高新技術(shù)公司；TU-1810紫外可見分光光度計(jì),北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；KO-500E超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司；18100摩爾超純水機(jī),上海摩勒科學(xué)儀器有限公司；Smart 140B智能磁力攪拌器,上海司樂儀器有限公司；Nova NanoSem 450型場發(fā)射掃描電子顯微鏡,上海禹重實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 SiNPs的制備

SiNPs的制備參考江仁庭等[27]的方法并稍作修改：在4.0 mL去離子水中加入0.3 mL 3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基-三甲氧基硅烷,50 ℃水浴攪拌5 min,然后加入0.084 g抗壞血酸繼續(xù)水浴攪拌6 h,形成SiNPs溶液。將所制備的SiNPs溶液透析(分子質(zhì)量截留：1 000 Da)16 h,然后儲(chǔ)存在4 ℃下供后續(xù)使用。

1.3.2 熒光測定

分別在2.0 mL pH 6.0的PBS緩沖液中加入1 mL上述SiNPs溶液,再加入不同濃度莧菜紅溶液,充分混合后放置90 s,在激發(fā)波長390 nm下測定其熒光光譜(激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為10 nm)。根據(jù)F0/F與莧菜紅濃度c繪制工作曲線(F0和F分別代表未加入和加入莧菜紅時(shí)的熒光強(qiáng)度)。實(shí)驗(yàn)均在室溫下進(jìn)行。

1.3.3 條件優(yōu)化

為了得到更靈敏的SiNPs,采用控制變量法對(duì)反應(yīng)體系的抗壞血酸的量及反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度進(jìn)行了優(yōu)化：選擇抗壞血酸的質(zhì)量為0.02、0.042、0.063、0.084、0.105、0.126 mg；反應(yīng)時(shí)間設(shè)置為2、4、6、8和10 h;反應(yīng)溫度20、30、50、60、70 ℃。

1.3.4 穩(wěn)定性測定

制備濃度梯度為0、50、100、200、300、400、500、800和1 000 mmol/L的NaCl溶液,向SiNPs溶液中各加入800 μL上述NaCl溶液,混合均勻后在激發(fā)波長390 nm和發(fā)射波長500 nm下測定其熒光強(qiáng)度(激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為10 nm)。

設(shè)置水浴溫度為25、35、45、55、65、75、85和95 ℃,SiNPs溶液在各水浴溫度中進(jìn)行水浴15 min達(dá)到設(shè)置溫度后,測定其熒光強(qiáng)度。

配制系列PBS緩沖液pH為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12,向1 mL SiNPs溶液中分別加入上述2.5 mL PBS緩沖液,混合均勻后測定其熒光強(qiáng)度。

1.3.5 選擇性測定

配制18 μg/mL莧菜紅和1.8 mg/mL的檸檬酸、苯甲酸鈉、山梨酸鉀、葡萄糖、抗壞血酸、Mg2+、Ca2+、Na+、K+溶液,各取3 mL加入到含有1 mL SiNPs溶液和2.5 mL pH 6的PBS緩沖液的試管中,搖勻并反應(yīng)90 s后進(jìn)行熒光檢測。

1.3.6 樣品處理及其熒光測定

將飲料加熱以除去CO2,水果糖研細(xì)。稱取水果糖粉8.0 g用熱的超純水溶解,待冷卻后加水稀釋定容至25.0 mL,并于10 000 r/min下離心10 min,收取上清液備用。取制備好的各樣品溶液3.0 mL,加入到含有1 mL SiNPs溶液和2.5 mL pH 6的PBS緩沖液的試管中,搖勻并反應(yīng)90 s后進(jìn)行熒光檢測。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Office Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)的整理,并用Origin 9.0軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 條件優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)對(duì)SiNPs的合成條件包括抗壞血酸質(zhì)量、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化。圖1-a顯示了SiNPs的熒光強(qiáng)度隨著抗壞血酸用量的變化情況,隨著抗壞血酸質(zhì)量的增加,熒光強(qiáng)度先逐漸增高后基本保持不變,當(dāng)抗壞血酸質(zhì)量為0.084 g時(shí),SiNPs溶液的熒光強(qiáng)度最大。如圖1-b所示,在2～6 h內(nèi),隨著反應(yīng)時(shí)間的增加,SiNPs溶液的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng),在6～10 h內(nèi),隨著反應(yīng)時(shí)間的增加,熒光強(qiáng)度逐漸減弱,當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為6 h時(shí),SiNPs溶液的熒光強(qiáng)度最高。如圖1-c所示,SiNPs溶液的熒光強(qiáng)度隨反應(yīng)溫度的增加而先增強(qiáng)后減弱,當(dāng)反應(yīng)溫度為50 ℃時(shí),SiNPs溶液的熒光強(qiáng)度最高。綜上所述,本實(shí)驗(yàn)選擇0.084 g、6 h和50 ℃作為合成SiNPs的最佳還原劑用量、反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度。

圖1 不同抗壞血酸質(zhì)量(a),不同反應(yīng)時(shí)間(b)和不同反應(yīng)溫度(c)對(duì)SiNPs熒光強(qiáng)度的影響

2.2 表征

本實(shí)驗(yàn)利用透射電鏡圖對(duì)SiNPs溶液的形態(tài)進(jìn)行了表征。如圖2-a所示,實(shí)驗(yàn)制備的SiNPs似球形、分散性較好。利用能量色散X射線光譜(energy dispersive X-ray spectroscopy,EDS)對(duì)SiNPs進(jìn)行了元素分析,如圖2-b所示,SiNPs含有C、N、O、Si元素。圖2-c為SiNPs溶液的紅外光譜圖,3 002 cm-1處的峰為—OH的伸縮振動(dòng)峰；1 630 cm-1處的峰為N—H鍵彎曲振動(dòng)峰；1 120 cm-1處的峰為Si—O—Si的伸縮振動(dòng)。結(jié)果表明,通過水熱法可以簡單有效合成粒徑較為均一SiNPs,而且SiNPs表面含有大量的氨基基團(tuán),這些官能團(tuán)的存在極大地提高了SiNPs的水溶性。圖2-d為SiNPs溶液的紫外可見光譜圖和熒光光譜圖,由紫外吸收光譜可以看出,SiNPs的最大吸收波長為319 nm,從熒光光譜圖可知,當(dāng)SiNPs的激發(fā)波長為390 nm時(shí),發(fā)射波長為500 nm。圖2-e為SiNPs溶液在不同激發(fā)波長時(shí)的熒光發(fā)射譜圖,改變SiNPs的激發(fā)波長時(shí)熒光發(fā)射峰位置基本保持不變,表明SiNPs的熒光發(fā)射峰不具有激發(fā)波長依賴性[28]。

2.3 穩(wěn)定性

如圖3-a所示,由NaCl濃度從0～1 000 mmol/L變化時(shí),SiNPs溶液的熒光強(qiáng)度保持較穩(wěn)定的狀態(tài),表明該SiNPs溶液具有較強(qiáng)的抗鹽性能；如圖3-b所示,當(dāng)溫度從25 ℃升高到95 ℃時(shí),SiNPs的熒光強(qiáng)度幾乎沒有變化,這表明SiNPs表現(xiàn)出良好的熱穩(wěn)定性。此外,在圖3-c中,隨著pH值從2.0增加到6.0,SiNPs的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng),pH值從6.0增加到12.0,SiNPs的熒光強(qiáng)度逐漸減弱。

圖3 SiNPs在不同濃度的NaCl溶液(a)、不同溫度(b)、不同pH(c)下的熒光強(qiáng)度

2.4 SiNPs檢測莧菜紅

考慮到在實(shí)際檢測莧菜紅時(shí),可能需要在較短的時(shí)間并在現(xiàn)場進(jìn)行,本實(shí)驗(yàn)考察了SiNPs對(duì)莧菜紅的響應(yīng)時(shí)間。如圖3-c所示,SiNPs在pH為6.0～8.0時(shí)的熒光強(qiáng)度比較穩(wěn)定。因此,本實(shí)驗(yàn)選擇在pH為6.0的PBS緩沖溶液中進(jìn)行。如圖4-a所示,SiNPs對(duì)莧菜紅的響應(yīng)時(shí)間非常短,所以選擇90 s為SiNPs和莧菜紅的響應(yīng)時(shí)間。如圖4-b所示,向SiNPs中加入不同濃度的莧菜紅溶液后,SiNPs的熒光強(qiáng)度隨莧菜紅濃度的增大而逐漸減弱。如圖4-c所示,熒光猝滅效率F0/F與莧菜紅溶液在2～20 μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系,其檢測限(3σ/k)為0.022 μg/mL,低于食品中莧菜紅的允許添加量,說明該方法可用于食品中莧菜紅的安全檢測。

圖4 SiNPs與莧菜紅的響應(yīng)時(shí)間(a)、不同莧菜紅濃度對(duì)SiNPs的熒光影響(b)、F0/F與莧菜紅濃度的線性關(guān)系圖(c)

2.5 選擇性

為了將該熒光猝滅法用于糖果和碳酸飲料中莧菜紅含量的測定分析,首先考察了可能的共存物質(zhì)(山梨酸鉀、葡萄糖、苯甲酸鈉、抗壞血酸和檸檬酸)和金屬離子(K+、Na+、Mg2+和Ca2+)對(duì)該反應(yīng)體系的影響。如圖5所示,干擾物質(zhì)對(duì)SiNPs的熒光強(qiáng)度影響較小,而莧菜紅對(duì)SiNPs的熒光強(qiáng)度影響最大,說明該熒光猝滅方法具有良好的選擇。

圖5 莧菜紅和其他干擾物質(zhì)對(duì)SiNPs的熒光強(qiáng)度影響

2.6 響應(yīng)機(jī)理

實(shí)驗(yàn)對(duì)熒光猝滅機(jī)理進(jìn)行了考察。如圖6所示,SiNPs的熒光激發(fā)光譜和莧菜紅的紫外吸收光譜幾乎沒有有效重疊,表明熒光猝滅機(jī)理不是內(nèi)濾效應(yīng)[29]。隨后對(duì)熒光共振能量轉(zhuǎn)移進(jìn)行了研究。SiNPs的熒光發(fā)射光譜和莧菜紅的紫外吸收光譜具有較大的重疊面積,表明由莧菜紅引起的SiNPs溶液熒光猝滅作用是由于兩者間發(fā)生了能量轉(zhuǎn)移[30]。

圖6 莧菜紅的紫外-可見吸收光譜與SiNPs的熒光發(fā)射和激發(fā)光譜

2.7 樣品分析

采用標(biāo)準(zhǔn)加入法對(duì)碳酸飲料和水果糖中的莧菜紅含量進(jìn)行了測定。結(jié)果見表1,樣品回收率為92.0%～104.0%,根據(jù)實(shí)驗(yàn)測得碳酸飲料和水果糖中莧菜紅的含量低于GB 2760—2011《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》,表明食品中莧菜紅的含量符合食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。本方法準(zhǔn)確可靠,可以采用此方法來測定食品中莧菜紅的含量。

表1 莧菜紅的回收率測定

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用簡單的一步法快速合成了水溶性熒光SiNPs,該方法避免了材料的多步合成和耗時(shí)的修飾過程。所制備的熒光SiNPs具有良好的熱穩(wěn)定性、優(yōu)異的耐鹽性和pH穩(wěn)定性。利用SiNPs的優(yōu)異性能并依據(jù)莧菜紅能有效猝滅SiNPs熒光,建立了莧菜紅熒光檢測的快速有效方法,并應(yīng)用于食品中莧菜紅的含量測定。該方法以其優(yōu)異的選擇性和靈敏度為人們?cè)谑称钒踩袡z測色素添加劑提供了一種快速簡便的手段?；赟iNPs構(gòu)建的傳感器有望在食品安全監(jiān)測、環(huán)境樣品分析等方面得到更多應(yīng)用。