高效陰離子交換色譜-脈沖安培法分析嗜熱鏈球菌胞外多糖的單糖組成

聶彩清,艾連中,熊智強(qiáng),張匯

(上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院,上海食品微生物工程技術(shù)研究中心,上海,200093)

嗜熱鏈球菌胞外多糖(exopolysaccharides,EPS)是嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中向細(xì)胞壁外分泌的一種糖類化合物[1]。EPS可以改善發(fā)酵乳制品的流變性、質(zhì)構(gòu)、持水性等品質(zhì)[2-4],還具有抗氧化和抗菌[5-6]、抗腫瘤[7]、修復(fù)腸道生理屏障[8]等生理活性。EPS的功能與結(jié)構(gòu)密切相關(guān),對(duì)其結(jié)構(gòu)的闡明是研究其功能性的基礎(chǔ)。單糖組成分析是解析碳水化合物結(jié)構(gòu)的重要過(guò)程之一。然而,嗜熱鏈球菌EPS產(chǎn)量低(50～400 mg/L)[9],結(jié)構(gòu)復(fù)雜且難與培養(yǎng)基、菌體等分離,直接測(cè)定難度較大,通常需進(jìn)行分離純化處理,其中,除蛋白是純化EPS的基礎(chǔ)。目前,反復(fù)凍融法、三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)法和酶法是除蛋白的常用方法[10]。

現(xiàn)有研究表明,嗜熱鏈球菌EPS是由不同單糖組成的雜多糖,單糖的主要類型包括葡萄糖、半乳糖和鼠李糖,此外,還發(fā)現(xiàn)有巖藻糖、核糖、葡萄糖醛酸、N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰氨基葡萄糖等[1,3]。因此,嗜熱鏈球菌EPS單糖組成的分析,需要實(shí)現(xiàn)多種單糖同時(shí)在線檢測(cè)。高效陰離子交換色譜(high performance anion exchange chromatography,HPAEC)法具有無(wú)需衍生、高靈敏度、線性范圍寬、色譜柱分離高效等特點(diǎn),并可實(shí)現(xiàn)多種單糖同時(shí)在線檢測(cè)[11],因此被越來(lái)越多地應(yīng)用于復(fù)雜多糖的單糖組成分析。如樂(lè)勝鋒等[12]考察了色譜柱和淋洗液梯度,建立了蘆薈多糖中巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖和木糖的測(cè)定方法;FELZ等[13]通過(guò)HPAEC法實(shí)現(xiàn)了對(duì)組成好氧污泥顆粒中EPS的單糖組成的分析。

HPAEC法通常以NaOH溶液為淋洗液,不同陰離子與OH-競(jìng)爭(zhēng)固定相的結(jié)合位點(diǎn)的能力不同,導(dǎo)致保留時(shí)間不同,從而得到分離。糖類化合物在陰離子交換分離柱上的保留主要取決于糖類化合物所帶的電荷數(shù)、分子大小、組成和結(jié)構(gòu)[14]。目前,已有許多文獻(xiàn)報(bào)道了HPAEC測(cè)定單糖組成的優(yōu)化條件,主要集中在多糖樣品水解條件(酸的種類和濃度、水解時(shí)間、水解溫度等)[12,15-16]、色譜分析條件等[12,16-17]的優(yōu)化。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)優(yōu)化淋洗液的濃度,試圖實(shí)現(xiàn)12種單糖同時(shí)在線檢測(cè)；在此基礎(chǔ)上,比較了反復(fù)凍融法、TCA法和酶法除蛋白對(duì)嗜熱鏈球菌EPS的單糖組成分析的影響,以期建立穩(wěn)定可靠的嗜熱鏈球菌發(fā)酵液中EPS單糖組成的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株：嗜熱鏈球菌AR333,上海理工大學(xué)上海食品微生物工程技術(shù)研究中心(專利保藏號(hào)：CGMCC 10262)；嗜熱鏈球菌JMCC0003,君樂(lè)寶乳業(yè)；嗜熱鏈球菌YZST072,揚(yáng)大康源乳業(yè)；嗜熱鏈球菌CN,光明乳業(yè),4株菌分別標(biāo)記為S1、S2、S3、S4。

LM17液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨5 g、大豆蛋白胨5 g、牛肉浸出粉5 g、酵母浸出粉2.5 g、β-磷酸甘油二鈉19 g、MgSO4·7H2O 0.25 g、乳糖20 g,加蒸餾水至1 000 mL,115 ℃滅菌20 min,所用試劑購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司。

單糖標(biāo)準(zhǔn)品：L-巖藻糖(Fuc)、D-半乳糖胺(GalN)、L-鼠李糖(Rha)、D-阿拉伯糖(Ara)、D-葡糖胺(GlcN)、D-半乳糖(Gal)、D-葡萄糖(Glc)、D-木糖(Xyl)、D-甘露糖(Man)、D-核糖(Rib)、D-半乳糖醛酸(GalA)、D-葡萄糖醛酸(GlcA),Sigma-Aldrich化學(xué)公司；質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的NaOH溶液、無(wú)水乙酸鈉(純度>99.9%),美國(guó)Thermo公司；TCA(AR級(jí)),上海展云化工有限公司；木瓜蛋白酶(酶活力≥ 6 000 U/mg),國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

Avanti JXN-26高速冷凍離心機(jī),美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；752型紫外可見分光光度計(jì),上海光譜儀器有限公司；ICS-5000+離子交換色譜系統(tǒng),美國(guó)Thermo公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色譜分析條件

高效陰離子交換色譜串聯(lián)脈沖安培檢測(cè)器系統(tǒng)：串聯(lián)有CarboPac PA20保護(hù)柱(3 mm×30 mm)和CarboPac PA20分析柱(3 mm×150 mm)；工作電極為Au,參比電極為Ag/AgCl；淋洗液：A.H2O、B.25 mmol/L NaOH溶液、C.1 mol/L NaOAc溶液、D.200 mmol/L NaOH溶液,通過(guò)改變不同淋洗液的比例,優(yōu)化多種單糖同時(shí)在線檢測(cè)的洗脫程序,實(shí)現(xiàn)最佳分離效果；流速 0.5 mL/min；進(jìn)樣體積 25 μL；柱溫 30 ℃。

以分離度評(píng)價(jià)色譜峰之間的分離效果,通過(guò)公式(1)計(jì)算分離度：

(1)

式中：t1和w1、t2和w2分別為相鄰色譜峰的保留時(shí)間(min)和峰寬(min)。

1.3.2 單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

單標(biāo)配制：分別準(zhǔn)確稱取約10 mg各種單糖標(biāo)品,加超純水充分溶解后,轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶定容,配制成質(zhì)量濃度約為1 mg/mL的單糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

混標(biāo)配制：分別移取適量各單糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于100 mL容量瓶中,超純水定容,得到混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,其中Fuc、GalN、Rha、Ara、GlcN、Gal、Glc、Xyl、Man、Rib、GalA、GlcA的質(zhì)量濃度分別為14.56、8.40、42.18、19.04、9.20、26.88、29.16、29.50、70.20、15.90、9.00、7.84 mg/L。上述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液再稀釋成系列質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.3 胞外多糖樣品的制備

將活化后的S1、S2、S3和S4以體積分?jǐn)?shù)為3%的接菌量分別接種于LM17培養(yǎng)基,40 ℃厭氧培養(yǎng)24 h。EPS的提取參考REN等[18]的方法。將發(fā)酵液沸水浴10 min,冷卻至室溫后于4 ℃離心(10 000×g,20 min),在上清液中緩慢加入3倍體積無(wú)水乙醇,4 ℃靜置12 h后離心(10 000×g,20 min),用適量無(wú)水乙醇洗滌沉淀2次后,揮發(fā)乙醇,加適量去離子水復(fù)溶,8 k～14 kDa截留分子質(zhì)量的透析袋透析3 d,離心后凍干上清液得到粗EPS。

選用S1菌株產(chǎn)EPS的樣品(BS1),研究不同脫蛋白方法對(duì)EPS的影響。用適量超純水溶解BS1,配成4 mg/mL的溶液,分別采用下列方法處理多糖溶液：

(1)反復(fù)凍融法：將多糖溶液于-20 ℃冷凍24 h后,于常溫解凍,4 ℃下10 000×g離心20 min去除沉淀,重復(fù)上述過(guò)程7次,將最后一次離心后的上清液凍干,得到樣品FS1；

(2)TCA法：加800 g/L的TCA溶液至終質(zhì)量濃度為40 g/L,邊加邊攪拌,4 ℃放置7 h后,10 000×g離心20 min,上清液用1.0 mmol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.0,透析(8 k～14 kDa截留分子質(zhì)量)、凍干,得到樣品TS1；

(3)酶法：用適量超純水溶解木瓜蛋白酶,配成6 000 U/mL的溶液,在多糖溶液中加入木瓜蛋白酶溶液使酶的終濃度為60 U/mL,于40 ℃下反應(yīng)1 h后,煮沸10 min,于4 ℃下10 000×g離心20 min,上清液透析(8 k～14 kDa截留分子質(zhì)量)、凍干,得到樣品ES1。

1.3.4 脫蛋白效果評(píng)價(jià)

采用苯酚-硫酸法[19]測(cè)定多糖樣品BS1、FS1、TS1和ES1的總糖含量(以D-葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)),考馬斯亮藍(lán)法[20]測(cè)定蛋白含量(以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)),并通過(guò)公式(2)、(3)、(4)分別計(jì)算總糖含量提高率、總糖質(zhì)量損失率和蛋白含量脫除率,并評(píng)價(jià)3種方法的脫蛋白效果：

(2)

(3)

(4)

式中：p1,BS1中總糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù),%；q1,BS1中蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù),%；m1,BS1質(zhì)量,mg；p2,脫蛋白后樣品中總糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù),%；q2,脫蛋白后樣品中蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù),%；m2,脫蛋白后樣品質(zhì)量,mg。

1.3.5 多糖樣品水解液的制備

分別稱取各多糖樣品約10 mg,冰浴條件下加0.5 mL 12 mol/L H2SO4溶液,室溫下攪拌反應(yīng)30 min,緩慢向其中加水,將H2SO4溶液稀釋至2 mol/L,混勻后于100 ℃的油浴中水解2 h,取出迅速冷水冷卻,水解液經(jīng)超純水適當(dāng)稀釋后,用0.22 μm微孔膜過(guò)濾,進(jìn)樣分析。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)平行測(cè)量3次,數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS statistics 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及多重比較分析,P<0.05為差異顯著,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。應(yīng)用Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 淋洗液濃度的優(yōu)化

常見單糖的電離常數(shù)(pKa)為12～14,HPAEC法依據(jù)pKa值的細(xì)微差異,采用陰離子交換色譜柱,以堿性溶液為淋洗液對(duì)不同單糖進(jìn)行分離[21]。然而,部分單糖pKa值相近,需要優(yōu)化色譜柱和淋洗液濃度來(lái)實(shí)現(xiàn)有效分離。

本研究通過(guò)改變淋洗液的NaOH濃度,優(yōu)化了12種單糖(Fuc、GalN、Rha、Ara、GlcN、Gal、Glc、Xyl、Man、Rib、GalA、GlcA)的洗脫條件,并通過(guò)分離度評(píng)價(jià)色譜峰之間的分離效果,分離度>1.5時(shí),色譜峰的分離程度達(dá)到99.7%,認(rèn)為基線分離。從圖1可知,NaOH濃度為1～5 mmol/L時(shí),Fuc、GlcN、Gal、Glc、Rib、GalA和GlcA均可得到基線分離,NaOH濃度的變化對(duì)其無(wú)顯著影響。而GalN和Rha 較難分離,NaOH濃度為5 mmol/L時(shí)完全重合,降低NaOH濃度,GalN和Rha的分離度先增大后減小,在NaOH濃度為1.75 mmol/L時(shí),GalN和Rha的分離效果最好,分離度為0.9。Rha和Ara的分離度隨著NaOH濃度的增大而增大,NaOH濃度為5 mmol/L時(shí),Rha和Ara的分離度>1.5,實(shí)現(xiàn)基線分離。Xyl和Man的pKa值相近,分別為12.15和12.08[11],NaOH濃度越大,Xyl和Man的分離效果越差,在NaOH濃度為3.75 mmol/L時(shí)完全重合。綜合考慮12種單糖的分離,最終確定最適NaOH濃度為1.75 mmol/L,梯度洗脫程序見表1。

a-5 mmol/L NaOH；b-3.75 mmol/L NaOH；c-3 mmol/L NaOH；d-1.75 mmol/L NaOH；e-1 mmol/L NaOH

表1 優(yōu)化后的HPAEC梯度洗脫程序

2.2 不同單糖的線性、檢出限和定量限分析

在優(yōu)化的洗脫條件下,考察12種單糖濃度與峰面積的線性關(guān)系,建立峰面積(nC·min)-單糖標(biāo)品質(zhì)量濃度(mg/L)校準(zhǔn)曲線,并使用最小二乘法對(duì)所得曲線進(jìn)行線性回歸。表2顯示回歸方程和相關(guān)系數(shù),12種單糖成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)均>0.99。分別以3倍和10倍信噪比(S/N)時(shí)的質(zhì)量濃度計(jì)算檢出限和定量限,結(jié)果列于表2。

表2 HPAEC測(cè)定不同單糖的線性、檢出限及定量限結(jié)果

2種氨基糖(GalN和GlcN)的檢出限結(jié)果均最低,為2.5 μg/L,GlcN的檢測(cè)線性范圍較窄,為0.18～2.76 mg/L；2種糖醛酸(GalA和GlcA)在NaOH-NaOAc淋洗液中洗脫,檢測(cè)線性范圍、檢出限和定量限結(jié)果相近,質(zhì)量濃度約為3 μg/L時(shí)即可被檢出,低于劉曉瑩等[15]和ALYASSIN等[22]的測(cè)定結(jié)果；Man的檢測(cè)線性范圍寬,為1.40～21.06 mg/L,而檢出限和定量限較高,需在較高濃度范圍才能被檢測(cè)；其余中性糖的檢出限為3.8～12.6 μg/L,定量限為14.1～47.3 μg/L,其中Ara、Gal、Glc和Xyl的檢出限和定量限均低于ALYASSIN等[22]和DE SOUZA等[23]的測(cè)定結(jié)果。以上結(jié)果表明該法有效提高了12種單糖的檢測(cè)靈敏度,擴(kuò)大樣品檢測(cè)濃度范圍,有利于微量樣品的分析。但是,隨著樣品檢測(cè)濃度的降低,受樣品雜質(zhì)干擾愈加明顯,故需要保證樣品較高的純度,避免雜質(zhì)對(duì)目標(biāo)分析物信號(hào)的干擾。

2.3 不同單糖的加標(biāo)回收率、精密度及重現(xiàn)性分析

回收率可用于評(píng)估方法的準(zhǔn)確性,將3種已知質(zhì)量濃度的單糖混合標(biāo)準(zhǔn)溶液添加到樣品溶液中,對(duì)加標(biāo)樣品進(jìn)行定量分析,通過(guò)計(jì)算得到每種單糖的平均回收率,確定該色譜方法的測(cè)定結(jié)果與真實(shí)值(加入量)的差異,從而確認(rèn)該方法是否可以獲得準(zhǔn)確的測(cè)試結(jié)果。表3結(jié)果表明,12種單糖的平均回收率在77.3%～118.5%,其中2種糖醛酸(GalA和GlcA)的加標(biāo)回收率接近100%,GlcN的回收率最低為77.3%,Rha、Ara和Xyl較難得到基線分離,但其加標(biāo)回收率仍在78.2%～86.6%。

表3 HPAEC測(cè)定不同單糖的加標(biāo)回收率和精密度結(jié)果

表3結(jié)果說(shuō)明該法測(cè)得的結(jié)果準(zhǔn)確性較好,滿足方法學(xué)的定量要求。精密度實(shí)驗(yàn)參照XIE等[24]方法,通過(guò)測(cè)定混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中每種單糖的峰面積的重復(fù)性(日內(nèi)變化和日間變化)來(lái)確定方法的精密度。方法的精確度計(jì)算為每種單糖連續(xù)3次進(jìn)樣的變異系數(shù),并用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)表示,日內(nèi)精度在同一天以4 h為間隔執(zhí)行,日間精度在連續(xù)3 d內(nèi)執(zhí)行,結(jié)果如表3所示。Rib的日內(nèi)峰面積的RSD最大,GalA的日內(nèi)峰面積的RSD最小為0.35%；Xyl的日間峰面積的RSD最大,GlcN的日間峰面積的RSD最小,為1.39%；12種單糖日內(nèi)峰面積的RSD<2.72%,日間峰面積的RSD<4.21%。表明該方法重現(xiàn)性良好,可滿足單糖組成的定性和定量分析要求。

2.4 嗜熱鏈球菌EPS脫蛋白方法的優(yōu)化

通常,微生物的EPS在培養(yǎng)基中發(fā)酵提取獲得,而培養(yǎng)基或菌體本身均會(huì)對(duì)提取的EPS造成污染,如酵母提取物中的甘露糖蛋白殘留會(huì)造成測(cè)定的Man偏高,牛肉浸粉中的糖原也會(huì)對(duì)EPS的測(cè)定造成影響[25]。因此,微生物EPS研究過(guò)程中,需對(duì)其純化處理,排除其他物質(zhì)的干擾。本研究分別通過(guò)反復(fù)凍融法、TCA法和酶法處理BS1,得到樣品FS1、TS1和ES1,不同脫蛋白方法的結(jié)果列于表4。結(jié)果表明：與脫蛋白處理前相比,3種方法處理后樣品的總糖含量均顯著提高,蛋白含量顯著降低。其中,TS1樣品的總糖含量提高率和蛋白含量脫除率最高,分別為34.21%和57.41%,說(shuō)明相比于反復(fù)凍融法和酶法,TCA法可更有效地去除嗜熱鏈球菌EPS的雜質(zhì)蛋白。此外,還發(fā)現(xiàn)脫蛋白處理會(huì)對(duì)粗EPS的總糖質(zhì)量造成損失,TCA法最為顯著,總糖質(zhì)量損失率高達(dá)16.84%,原因可能是TCA法使部分EPS與蛋白質(zhì)共沉淀[26]。反復(fù)凍融法和酶法處理較為溫和,但也造成了約8.00%的總糖質(zhì)量損失。同時(shí)考慮蛋白脫除和總糖損失情況,TCA法的蛋白含量脫除率/總糖質(zhì)量損失率為3.14,顯著高于反復(fù)凍融法和酶法,因此,選擇TCA法為嗜熱鏈球菌EPS的最佳脫蛋白方法。

表4 不同脫蛋白方法處理對(duì)EPS性質(zhì)的影響

采用優(yōu)化后的單糖組成分析色譜條件,對(duì)TCA法脫蛋白樣品TS1進(jìn)行單糖組成分析,并與未脫蛋白的樣品BS1比較,考察脫蛋白前后EPS的單糖組成,結(jié)果見圖2。結(jié)果表明：BS1樣品中的中性糖保留時(shí)間較TS1的前移,蛋白質(zhì)酸水解產(chǎn)物(如精氨酸、賴氨酸、組氨酸)的競(jìng)爭(zhēng)性保留[27]可能是導(dǎo)致單糖保留時(shí)間變化的主要原因；在TCA法脫蛋白處理前后的多糖樣品中均檢測(cè)到GalN、Rha、GlcN、Gal、Glc、Man、GalA和GlcA,且8種單糖均可得到分離,TS1中GlcN和Gal的分離度為1.47,顯著高于BS1(分離度為1.00),因此,TS1水解后單糖的分離效果更好。與TS1的色譜分離結(jié)果相比,BS1在Man的色譜峰后,有較多未知的雜峰干擾,并且在溶劑峰左右出現(xiàn)更多未分離的色譜峰。除此之外,由于BS1的總糖含量顯著低于TS1,需水解更多質(zhì)量的粗EPS達(dá)到與TS1相同的響應(yīng)度結(jié)果,但同時(shí)考慮隨著粗EPS質(zhì)量的增大,可能導(dǎo)致水解不完全,不利于單糖組成的定量分析。綜上所述,通過(guò)HPAEC法對(duì)嗜熱鏈球菌EPS進(jìn)行單糖組成分析前,需要對(duì)提取的粗多糖進(jìn)行脫蛋白處理,以獲得更加可靠的定性及定量結(jié)果。

圖2 單糖混合標(biāo)準(zhǔn)品(HB)及樣品BS1、TS1的單糖組成色譜分離圖

2.5 樣品測(cè)定

為進(jìn)一步驗(yàn)證本研究建立的針對(duì)嗜熱鏈球菌EPS的單糖組成分析的方法,對(duì)4株嗜熱鏈球菌產(chǎn)的粗EPS進(jìn)行TCA法脫蛋白處理后,通過(guò)優(yōu)化的HPAEC條件分析單糖組成,結(jié)果如圖3和表5所示。

圖3 不同菌株胞外多糖的單糖組成結(jié)果

圖3結(jié)果表明,各單糖組分分離效果較好,4種EPS均檢出GalN、Rha、GlcN、Gal、Glc、Man及糖醛酸成分,不同EPS的單糖含量結(jié)果列于表5,表明嗜熱鏈球菌EPS是一種成分復(fù)雜的雜多糖。根據(jù)已有文獻(xiàn),李嘉文等[26]報(bào)道嗜熱鏈球菌NMG 115產(chǎn)的EPS主要由Ara、Gal、Glc、Man組成；XU等[4]報(bào)道嗜熱鏈球菌S-3產(chǎn)的EPS主要由GalN、Gal、Glc組成。本研究表明S1、S2和S3產(chǎn)的EPS中GalN、Gal、Glc和Man含量較高,這與文獻(xiàn)報(bào)道相符,不同的是,在S1和S2 產(chǎn)的EPS中還檢出較多GlcA,S3產(chǎn)的EPS中檢出較多GalA。此外,S4產(chǎn)的EPS中GalN、Rha、Glc、Man和GalA含量較高,PACHEKREPAPOL等[3]在嗜熱鏈球菌DGCC 7698產(chǎn)的EPS中同樣檢出較多的Rha。值得注意的是,S1菌株的EPS中GalN、Gal、Glc的摩爾比約為1.3∶1.6∶1.0,與之前的研究相比,嗜熱鏈球菌AR333在改良脫脂乳培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)生的EPS中GalN、Gal、Glc的摩爾比約為1∶3∶2[28],說(shuō)明不同培養(yǎng)基可能會(huì)影響嗜熱鏈球菌產(chǎn)生EPS的單糖組成,在后續(xù)研究中將對(duì)此展開系統(tǒng)分析。

表5 不同菌株胞外多糖樣品單糖組成及含量測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

本研究?jī)?yōu)化了NaOH溶液作為淋洗液的濃度,確定最佳的洗脫程序。Fuc、GlcN、Gal、Glc、Rib、GalA和GlcA 7種單糖可實(shí)現(xiàn)基線分離。同時(shí),GalN、Rha和Ara,Xyl和Man也可達(dá)到較好的分離效果。通過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證證明所建立的HPAEC-PAD法對(duì)于12種單糖的同時(shí)在線分離可以實(shí)現(xiàn)良好的線性,且這種方法準(zhǔn)確性和重復(fù)性好、靈敏度高。在此基礎(chǔ)上,通過(guò)比較反復(fù)凍融法、TCA法和酶法,最終確定了TCA法為嗜熱鏈球菌EPS最佳的脫蛋白方法。該法操作簡(jiǎn)單、快速,可實(shí)現(xiàn)57.41%的蛋白脫除率,使樣品達(dá)到陰離子交換色譜進(jìn)樣分析的要求。將優(yōu)化后的色譜條件及樣品處理方法應(yīng)用于4株嗜熱鏈球菌EPS的單糖組成定性及定量分析,發(fā)現(xiàn)不同菌株產(chǎn)EPS的單糖組成種類相似,但比例差異較大,與前人研究比較,發(fā)現(xiàn)EPS的單糖組成可能會(huì)受培養(yǎng)基的影響,但具體還需進(jìn)一步研究。綜上,本研究提供了一種可靠的分析嗜熱鏈球菌胞外多糖單糖組成的方法,并可將其應(yīng)用于其他微生物胞外多糖的研究中。