高溫濕熱處理對大豆分離蛋白的結(jié)構(gòu)及其功能特性的影響

劉紫薇,朱明明,王鳳新,趙強*,熊華

1(食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室(南昌大學(xué)),江西 南昌,330047) 2(江西人之初營養(yǎng)科技股份有限公司,江西 南昌,330052)

大豆蛋白是優(yōu)質(zhì)植物蛋白的代表,兼具高營養(yǎng)價值和多種功能性質(zhì),在食品中的應(yīng)用十分廣泛[1]。大豆蛋白在市場上有3種常見形式,即大豆粉、大豆?jié)饪s蛋白、大豆分離蛋白。其中大豆分離蛋白(soy protein isolate,SPI)是以低溫脫脂豆粕為原料,進一步除去非蛋白質(zhì)成分后得到的、蛋白質(zhì)含量達90%(干基)以上的一種全價蛋白[2]。在SPI的生產(chǎn)及相關(guān)制品應(yīng)用過程中,熱處理是不可避免的環(huán)節(jié),通常會出現(xiàn)大豆蛋白結(jié)構(gòu)展開,發(fā)生不可逆的熱聚集，即熱變性現(xiàn)象,引起蛋白功能性質(zhì)的明顯改變,從而影響其應(yīng)用[3]。陶汝青等[4]研究了熱處理對大豆蛋白結(jié)構(gòu)及其凝膠性質(zhì)的影響,發(fā)現(xiàn)處理時間相同的條件下,隨著加熱溫度的升高,SPI的β-折疊含量下降,無規(guī)卷曲含量增加,形成凝膠的強度也隨之增強。王健等[5]研究了熱處理對大豆蛋白柔性和結(jié)構(gòu)的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)對樣品的熱處理溫度>80 ℃時,蛋白的柔性與溫度和處理時間呈正相關(guān),其起泡性和乳化性也隨著溫度的升高和處理時間的延長而提高。齊寶坤等[6]研究了熱處理對大豆11S球蛋白溶解性和二級結(jié)構(gòu)的影響,結(jié)果表明,80 ℃熱處理會導(dǎo)致11S球蛋白的α-螺旋轉(zhuǎn)化為β-折疊和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu),其溶解度明顯降低；90和100 ℃熱處理后,11S球蛋白會形成可溶性聚集體,其溶解度升高。SIRISON等[7]發(fā)現(xiàn)90 ℃處理顯著提高了大豆蛋白的溶解度,從42%增加到85%。目前實驗室條件下對SPI的熱處理主要集中在不高于100 ℃的常壓熱處理,實際上工業(yè)生產(chǎn)中如噴射蒸煮溫度最高可達154 ℃,高于154 ℃的高溫濕熱處理對SPI結(jié)構(gòu)及功能是否會產(chǎn)生影響,相關(guān)研究文獻報道較少[8]。

本文以SPI為研究對象,選取SPI的2個玻璃化轉(zhuǎn)變溫度附近的70與90 ℃[9]以及120、150、170、200 ℃下分別濕熱處理30 min,研究高溫濕熱處理對SPI結(jié)構(gòu)與功能的影響,為大豆蛋白及其制品在生產(chǎn)中的改性應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂豆粕,哈高科大豆食品有限責(zé)任公司；1-苯胺基-8-萘磺酸(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid,ANS)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA),Sigma公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris)、福林酚試劑、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)、NaOH、Na2HPO4、NaH2PO4、鹽酸、異辛烷、異丙醇、甲醇、硫氰酸銨、BaCl2、三氯乙酸等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

T18高速分散機、RH Basic I磁力攪拌器,德國IKA公司；聚四氟乙烯高壓反應(yīng)釜(50 mL),鄭州博科儀器有限公司；F—7000熒光分光光度計,日本日立公司；Nicolet 5700傅里葉變換紅外光譜儀,美國Thermo Fisher公司；Mini-PROTEAN電泳儀,美國伯樂公司；新世紀(jì)T6紫外-可見光分光光度計,北京普析通用儀器有限公司；Zetasizer Nano粒度電位儀,英國馬爾文公司；Synergy H1酶標(biāo)儀,美國BioTek公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 SPI的制備

SPI的制備采用堿提酸沉法[8]并稍作改動。稱取適量脫脂大豆粉,按料液比1∶10(g∶mL)加入去離子水,用1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH至8.0,室溫下機械攪拌2 h,離心(8 000×g,20 min),重復(fù)提取殘渣1次,合并上清液待用。用2 mol/L 的HCl溶液將上清液pH調(diào)至4.5,靜置0.5 h后再次離心(5 000×g,20 min),所得沉淀經(jīng)水洗2次后,再次離心(5 000×g,20 min),向所得殘渣中加入適量去離子水,所得分散體在去離子水中透析24 h(透析袋截留分子質(zhì)量：8 k～14 kDa),隔6 h換1次水。經(jīng)冷凍干燥后,置于-18 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。樣品?jīng)凱氏定氮儀測定大豆蛋白純度為95%(干基,N%×6.25)。

1.3.2 高溫濕熱處理

配制質(zhì)量濃度為1 g/100 mL的SPI溶液,用1 mol/L HCl溶液及1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0,取10 mL樣品置于50 mL聚四氟乙烯高壓反應(yīng)釜中,分別在70、90、120、150、170、200 ℃條件下處理30 min,樣品分別命名為SPI-70、SPI-90、SPI-120、SPI-150、SPI-170、SPI-200,未經(jīng)處理的樣品命名為Native作為對照。取出后立即冰浴,冷卻至室溫后冷凍干燥待用。

1.3.3 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)

參考文獻[10-11]的方法稍作修改。樣品溶解于含二硫蘇糖醇(DTT)的上樣緩沖液(2 mg/mL),沸水浴10 min后離心(8 000×g)10 min。上樣量為10 μL,采用5%的濃縮膠和12%的分離膠,并在恒定電流條件下進行電泳,濃縮膠電流為20 mA,分離膠電流為25 mA。結(jié)束電泳后采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%的考馬斯亮藍R-250染色液染色1 h,再采用含有甲醇和乙酸的混合液[V(甲醇)∶V(乙酸)∶V(水)=50∶75∶875]脫色12 h。

1.3.4 色氨酸熒光光譜測定

稱取適量處理前后的SPI樣品分散于0.01 mol/L,pH 7.0磷酸鹽緩沖溶液中,配制成濃度為1 mg/mL的蛋白溶液。采用熒光分光光度計在激發(fā)波長為290 nm條件下,以20 nm/s的掃描速度得到300～400 nm的發(fā)射光譜。其中激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫寬均為5 nm。

1.3.5 傅里葉紅外(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)光譜測定

將凍干的SPI樣品與KBr進行干燥處理,取5 mg樣品粉末與200 mg KBr混合,研磨均勻,然后壓片,通過FTIR記錄每個樣品在4 000～400 cm-1的透過率光譜圖,分辨率 4 cm-1,掃描32次。譜圖采用Omnic 8.0和Peakfit 4.12軟件進行分析,包括在酰胺Ι帶(1 700～1 600 cm-1)范圍內(nèi)進行兩點基線校正、平滑處理、去卷積、作二階導(dǎo)數(shù)同時采用Gaussian法進行多次曲線擬合,使殘差R2最?。蛔詈髮M合出的子峰歸屬給蛋白的4種二級結(jié)構(gòu),并通過計算各子峰面積百分比推導(dǎo)蛋白樣品的二級結(jié)構(gòu)組成。各子峰與二級結(jié)構(gòu)對應(yīng)關(guān)系：1 660～1 650 cm-1為α-螺旋;1 640～1 610 cm-1為β-折疊;1 700～1 661 cm-1為β-轉(zhuǎn)角;1 650～1 640 cm-1為無規(guī)卷曲[6]。

1.3.6 表面疏水性測定

參考KATO等[12]的方法采用ANS熒光探針法測定蛋白的表面疏水性,稍作修改。將未處理和濕熱處理后的SPI樣品溶解于0.01 mol/L,pH為7.0的磷酸鹽緩沖液中,最終質(zhì)量濃度范圍為0.1～2.0 mg/mL。取樣品液2 mL,加入50 μL,8 mmol/L的ANS溶液振蕩,黑暗處靜置5 min。設(shè)定激發(fā)波長為360 nm,通過熒光分光光度計記錄在480 nm處的熒光強度,其中激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm。通過熒光強度對蛋白質(zhì)濃度作線性回歸分析,曲線初始階段的斜率即為蛋白質(zhì)的表面疏水性指數(shù)。

1.3.7 溶解度的測定

蛋白質(zhì)溶解度依照ZHAO等[13]的方法,稍作修改。常溫下,取0.2 g樣品分散在20 mL去離子水中,攪拌30 min后調(diào)節(jié)pH至中性,再攪拌30 min,離心(5 000×g,10 min)后取適量上清液稀釋,以BSA為標(biāo)準(zhǔn)蛋白,用Lowry法測定上清液中蛋白質(zhì)量。按公式(1)計算溶解度:

(1)

1.3.8 粒徑及電位的測定

采用粒度電位儀對SPI樣品進行粒徑及Zeta電位測定。材料折射率為1.450,分散介質(zhì)設(shè)定為水。用去離子水將樣品稀釋至1 mg/mL,在25 ℃下平衡120 s后開始測試。

1.3.9 濁度的測定

參考LIU等[14]的方法測定樣品濁度,略作改動。用去離子水將樣品稀釋為5 mg/mL,將200 μL待測樣品滴加到96孔板中,利用酶標(biāo)儀在波長600 nm下測定吸光度值,用去離子水作為空白對照。A600值即為濁度值。

1.3.10 乳化性及乳化穩(wěn)定性的測定

采用比濁法測定乳化性及乳化穩(wěn)定性。在圓底離心管中加入16 mL蛋白質(zhì)量濃度為1 mg/mL的樣品溶液和4 mL大豆油,用高速分散機以12 000 r/min高速剪切1 min,隨即從距底部0.5 cm處取50 μL乳狀液,加入5 mL SDS(1 g/L)溶液進行稀釋,渦旋振蕩混勻。采用紫外分光光度計在500 nm處測定吸光值A(chǔ)0,10 min后再次移取50 μL混勻的乳狀液,用SDS溶液稀釋后測定其吸光值A(chǔ)10,同時做空白。按公式(2)、(3)計算乳化性及乳化穩(wěn)定性:

(2)

(3)

式中：ρ,形成溶液前樣品溶液質(zhì)量濃度,g/mL；D,稀釋倍數(shù)；φ,油相所占體積分?jǐn)?shù),0.20。

1.3.11 統(tǒng)計分析

樣品測試均進行3組平行實驗。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示,采用OriginPro 2020軟件作圖及ANOVA Tukey分析實驗數(shù)據(jù),圖表中不同字母表示顯著性差異(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SDS-PAGE分析

7S球蛋白和11S球蛋白占比超過大豆蛋白總量的80%,是其重要組成部分。7S球蛋白由3個亞基通過非共價作用組成,α亞基(67 kDa),α′亞基(71 kDa)和β亞基(50 kDa)。11S球蛋白是由6個不同亞基組成的六聚體,每個亞基由1個分子質(zhì)量約為35 kDa的酸性亞基A(酸性pI)和1個分子質(zhì)量約為20 kDa的堿性亞基B(堿性pI)通過二硫鍵連接而成[1]。

圖1為經(jīng)過不同溫度濕熱處理后的SPI電泳圖。電泳圖譜顯示,熱處理溫度超過90 ℃,分離膠條帶,尤其是低分子質(zhì)量條帶(75 k、63 k、48 k、35 kDa)的顏色逐漸加深,濃縮膠和分離膠交界處的聚集體的量也隨之增加。當(dāng)熱處理溫度>150 ℃時,觀察到各亞基的條帶顏色較淺,與文獻觀察到的結(jié)果一致[15],說明熱處理后亞基可能參與聚集體的形成,其中可溶性聚集物形成與酸性亞基A、α亞基和α′亞基相互作用有關(guān),不可溶聚集物與堿性亞基B和β亞基有關(guān)[7]。除此之外,SPI的亞基組成無顯著變化,說明不同溫度的處理對SPI的一級結(jié)構(gòu)影響較小,這與射頻加熱得到的結(jié)果類似[16]。

1-未經(jīng)處理的樣品Native；2-SPI-70；3-SPI-90；4-SPI-120；5-SPI-150；6-SPI-170；7-SPI-200

2.2 色氨酸熒光光譜分析

色氨酸(Trp)殘基對微環(huán)境的變化十分敏感,因此蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光光譜通常用于研究蛋白分子三級結(jié)構(gòu)的變化及蛋白質(zhì)間的相互作用。激發(fā)波長290 nm下,SPI發(fā)射的內(nèi)源熒光主要來自于Trp[17]。高溫濕熱處理對SPI內(nèi)源熒光的影響如圖2所示,高溫濕熱處理導(dǎo)致SPI的最大熒光發(fā)射強度顯著降低,最大發(fā)射波長(λmax)從337 nm紅移至351.8 nm,其中200 ℃高溫濕熱處理的紅移程度遠大于其他溫度,表明SPI在此條件下三級結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化。未處理的SPI最大發(fā)射波長(λmax)在337.8 nm處且熒光強度最大,表明色氨酸殘基位于SPI的內(nèi)部疏水區(qū)域,這與DUFOUR等[18]的研究結(jié)果一致。隨著溫度的提高,蛋白質(zhì)的變性程度愈大,暴露在表面的Trp殘基愈多,發(fā)色團電子躍遷所需能量減少,熒光量子產(chǎn)率降低,導(dǎo)致熒光強度的降低。高溫濕熱處理使Trp殘基從蛋白內(nèi)部疏水區(qū)域轉(zhuǎn)移至親水區(qū)域,暴露在極性的微環(huán)境中,從而發(fā)射波長λmax發(fā)生紅移[19]。

圖2 不同高溫濕熱條件處理的SPI內(nèi)源熒光光譜圖

2.3 傅里葉紅外光譜分析

圖3為高溫濕熱處理前后SPI的FTIR圖譜。3 600～3 300 cm-1位置的峰強度通?？梢员硎維PI分子內(nèi)部及其分子間氫鍵、O—H、C—H鍵伸縮振動的強度[20]。隨著溫度不斷升高,在2 932 cm-1位置的峰幾乎沒有變化,這說明高溫濕熱處理對SPI分子內(nèi)的C—H鍵產(chǎn)生的影響較小[21]。

圖3 不同高溫濕熱條件處理的SPI紅外光譜圖

表1 通過紅外光譜結(jié)果計算的高溫濕熱處理的和未經(jīng)過處理的SPI的二級結(jié)構(gòu)含量 單位：%

2.4 表面疏水性

高溫濕熱處理對SPI的表面疏水性有明顯的影響,如圖4所示。未經(jīng)處理的SPI的表面疏水性為96.74,當(dāng)處理溫度為70～90 ℃時,SPI的疏水性逐漸增強,在90 ℃時達到最大,與顧龍建等[24]的研究結(jié)果一致。β-折疊結(jié)構(gòu)易存在于蛋白質(zhì)聚集體的內(nèi)部[25],由二級結(jié)構(gòu)含量可知,此溫度下樣品的β-折疊結(jié)構(gòu)含量最低,表明熱處理溫度的提高加劇了蛋白質(zhì)的變性,更多的疏水基團暴露,從而導(dǎo)致表面疏水性的提高。隨著加熱溫度進一步上升至200 ℃,SPI基團中的亞基間形成更多的聚集體,疏水基團被隱藏至蛋白內(nèi)部,導(dǎo)致表面疏水性發(fā)生一定程度的下降[6]。200 ℃高溫濕熱處理和未處理樣品的疏水性無顯著性差異。

圖4 不同高溫濕熱條件對SPI表面疏水性的影響

2.5 溶解度

溶解度是蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的一個重要指標(biāo),同時決定了蛋白眾多其他功能特性如乳化性等。高溫濕熱處理對SPI溶解性的影響如圖5所示。未處理的蛋白溶解性為70%,SPI被高溫濕熱處理后,其溶解性得到了顯著的提升,且在90 ℃時達到最高為86%。這可能是由于當(dāng)SPI受熱時,不溶的蛋白聚集體發(fā)生解聚,使得溶解性增加,或者是由于加熱處理使得蛋白多肽鏈展開,肽鏈間形成了可溶性的聚集[26-27]。凝膠電泳結(jié)果中低分子質(zhì)量條帶的加深和熒光結(jié)果色氨酸微環(huán)境極性的增加都表明了高溫?zé)崽幚硪鸬鞍讟?gòu)象的變化,引起溶解性的變化。當(dāng)處理溫度升至120 ℃時,其溶解度約為59.67%,溶解度明顯降低,過高的加熱溫度使蛋白發(fā)生變性,導(dǎo)致蛋白質(zhì)的聚集和疏水作用提高,從而導(dǎo)致溶解度下降,這與WENG等[26]的研究結(jié)果一致。

圖5 不同高溫濕熱條件處理對SPI溶解度的影響

處理溫度進一步提高至200 ℃,其溶解度快速升高；在高溫處理樣品時,可以發(fā)現(xiàn)溶液呈均一狀,且無聚集體析出,可能的原因是高溫下SPI內(nèi)部的7S和11S球蛋白發(fā)生結(jié)構(gòu)重組,2類蛋白亞基間發(fā)生相互作用形成可溶性聚集體,從而保持較好的溶解性[28]。以上結(jié)果表明,SPI的溶解度受溫度影響較大。

2.6 電位

圖6是不同高溫濕熱條件處理后SPI的Zeta電位。SPI是典型的兩性電解質(zhì),在中性pH值時,所有SPI樣品的Zeta電位均為負值,說明蛋白質(zhì)表面存在凈負電荷[29]。隨著濕熱處理溫度的升高,SPI的Zeta電位絕對值呈減小趨勢。這表明SPI表面的帶負電殘基隨著高溫濕熱處理逐漸掩埋,靜電排斥減少,溶液穩(wěn)定性降低,這將有利于體系中蛋白分子形成聚集體。

圖6 不同高溫濕熱條件處理的SPI的Zeta電位圖

2.7 粒徑

圖7是不同高溫濕熱處理下SPI的平均粒徑,高溫濕熱處理會對SPI平均粒徑產(chǎn)生顯著影響(P<0.05)。70～150 ℃高溫濕熱處理顯著降低SPI的平均粒徑,另一方面,170～200 ℃高溫濕熱處理顯著增大SPI的平均粒徑。周麟依等[30]認(rèn)為蛋白質(zhì)粒徑的變化主要與蛋白質(zhì)分子的交聯(lián)與聚集有關(guān),蛋白的平均粒徑較大說明蛋白分子之間相互聚集形成較多聚集體,反之則蛋白間形成較少聚集體。

圖7 不同高溫濕熱條件處理的SPI平均粒徑圖

170、190 ℃高溫濕熱處理形成了3 500～4 000 nm左右的聚集體(P<0.05),表明在較高溫度的濕熱處理下體系發(fā)生了明顯的聚集,與在這2個溫度下SPI濁度明顯更高的結(jié)果一致。

2.8 濁度

濁度是表征蛋白質(zhì)聚集程度的關(guān)鍵指標(biāo),能夠側(cè)面反映蛋白在溶液中的分散狀態(tài)[31]。圖8是不同高溫濕熱處理后SPI的濁度。由測定結(jié)果可知,70～150 ℃高溫濕熱處理對SPI濁度無顯著影響,而170～200 ℃高溫濕熱處理后的樣品濁度顯著增大,CROMWELL等[32]認(rèn)為濁度的增加和蛋白分子聚集體形成有關(guān)。SPI-170、SPI-200濁度的顯著增加與其粒徑顯著增大的結(jié)果相互驗證,表明SPI經(jīng)高溫濕熱處理后形成了聚集體。另一方面,溶解度的測試結(jié)果表明在這2個溫度濕熱處理下SPI的可溶性仍然高達80%,這表明形成的聚集體是可溶的。

圖8 不同高溫濕熱處理對SPI濁度(A600)的影響

2.9 乳化性及乳化穩(wěn)定性

高溫濕熱處理后的SPI溶液乳化性及乳化穩(wěn)定性如圖9所示。由圖9-a可知,隨著處理溫度的升高,SPI溶液的乳化性呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢,90 ℃時乳化性最大。這是由于適當(dāng)?shù)臏囟忍幚砜墒筍PI發(fā)生熱變性,蛋白的結(jié)構(gòu)展開,β-折疊結(jié)構(gòu)被破壞,含量降低,逐漸轉(zhuǎn)化為α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu),故增加了SPI的柔性[5],更多的疏水性位點被暴露,從而促進其在界面的展開,進而增大了其乳化性。熱處理溫度為120、150、170、200 ℃時,分子熱運動加劇,相互作用的幾率增大,致使其乳化性降低[33]。

a-乳化性；b-乳化穩(wěn)定性

另一方面,高溫處理蛋白質(zhì)使其結(jié)構(gòu)過度展開,更多的疏水基團暴露,增強了分子間的相互作用,導(dǎo)致乳化性降低。

圖9-b顯示,隨著處理溫度的升高,大豆分離蛋白的乳化穩(wěn)定性逐漸升高,這是由于熱處理使得蛋白質(zhì)分子逐漸展開,分子形態(tài)逐漸松散,更多的疏水基團暴露,界面蛋白間疏水作用增強,界面膜厚度增加,油滴間比較穩(wěn)定,從而增加了體系的乳化穩(wěn)定性[34],200 ℃高溫濕熱處理的樣品乳化穩(wěn)定性最強。這表明高溫濕熱處理有利于改善大豆分離蛋白的乳化穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

高溫濕熱處理對SPI的結(jié)構(gòu)和功能特性影響顯著。高溫濕熱處理后的SPI一級結(jié)構(gòu)組分無較大的變化；經(jīng)過熱處理后的SPI結(jié)構(gòu)展開,發(fā)色團暴露出來,導(dǎo)致最大吸收波長發(fā)生紅移；相較于未處理的樣品,高溫處理的蛋白二級結(jié)構(gòu)中的各個組分的含量發(fā)生顯著變化,具體表現(xiàn)為β-折疊含量減少,α-螺旋含量增加。70～90 ℃處理SPI,其溶解度隨溫度升高而增大;SPI-90溶解度最大,SPI-120溶解度最小;SPI經(jīng)170～200 ℃高溫濕熱處理,溶解度又隨溫度的增高而增大；相較于其他樣品,SPI-170、SPI-200的平均粒徑及濁度顯著增大,SPI聚集程度較大,電位絕對值明顯降低。SPI的表面疏水性和乳化性呈先增加后降低趨勢,處理溫度為90 ℃時達到最大,而乳化穩(wěn)定性和溫度呈正相關(guān)。