藜麥蛋白的提取與超濾分離

唐子簫,李俊華,朱曉軍,楊嚴(yán)俊*

1(食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué)) 江蘇 無錫,214122)2(國家功能食品工程技術(shù)研究中心(江南大學(xué)) 江蘇 無錫,214122)3(江南大學(xué) 食品學(xué)院,江蘇 無錫,214122)4(中藜農(nóng)業(yè)科技(江蘇)有限公司 江蘇 南通,226000)

藜麥原產(chǎn)于南美洲,是聯(lián)合國糧農(nóng)組織認(rèn)可的最適宜于人類食用的“全營養(yǎng)食品”之一[1],也被國際營養(yǎng)學(xué)家稱之為“營養(yǎng)黃金”、“超級(jí)谷物”、“未來食品”[2]。同時(shí)由于藜麥可以生長在高原、海邊、鹽堿地區(qū)等惡劣條件下[3],近些年也已經(jīng)被很多自然條件較差的亞洲國家引進(jìn)并推廣種植。藜麥的營養(yǎng)價(jià)值超過任何一種傳統(tǒng)的糧食作物,除了豐富的鈣、鐵、鋅、硒以及維生素等微量營養(yǎng)元素外,其蛋白質(zhì)含量可以達(dá)到13.1%～16.7%,高于大米、大麥和玉米,且蛋白質(zhì)品質(zhì)不亞于肉源蛋白與奶源蛋白[4],包含了人體所需全部必需氨基酸,比例適當(dāng),數(shù)量充足。除了含有人體所需的9種必需氨基酸,特別是多數(shù)作物中第一限制性氨基酸——賴氨酸[5],還含有許多非必需氨基酸。因此,藜麥蛋白無論是作為植物基奶源,還是植物肉原料都具有十分廣闊的應(yīng)用前景。

然而,作為一種新興的植物資源,目前對(duì)藜麥蛋白制備方法的研究還較為缺乏。近年來,堿提酸沉法因其操作簡(jiǎn)單、成本低、可以大規(guī)模生產(chǎn)等特性,成為工業(yè)中最常用的制備藜麥蛋白的方式[6-7]。但調(diào)節(jié)pH需要使用大量酸堿,造成污染同時(shí)也會(huì)使得蛋白變性。酶法制備蛋白以其條件溫和、耗時(shí)短、操作簡(jiǎn)便[8]等特點(diǎn),引起了一些學(xué)者的關(guān)注,但是酶法制備蛋白往往后續(xù)分離困難,純度較低。超濾作為一種近年發(fā)展起來的新興膜分離技術(shù),具備操作簡(jiǎn)單、能耗低、條件相對(duì)溫和等優(yōu)勢(shì)[9],在蛋白制備領(lǐng)域發(fā)揮越來越大的作用。且使用超濾的方法制備藜麥蛋白的相關(guān)研究尚未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)以脫皮藜麥為原料,探索利用堿液提取、超濾純化藜麥蛋白的工藝條件,并對(duì)膜法制備藜麥蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)組成分析與營養(yǎng)價(jià)值評(píng)估,以期為未來藜麥蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫皮藜麥,中藜農(nóng)業(yè)科技公司；NaOH、酒石酸鉀鈉、蒽酮、H2SO4、Na2SO4、CuSO4·5 H2O、鹽酸、溴甲酚綠、甲基紅、硼酸,均為分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

800Y型高速多功能粉碎機(jī),武義海納電器有限公司；GZX-9146MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱,上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；AB204-N型分析天平、EL20型pH計(jì),METTLER TOLEDO(上海)公司；AAH44212K型恒溫水浴搖床,韓國杰奧特公司；UH5300紫外分光光度計(jì),日本日立公司；K9840型微量凱氏定氮儀,濟(jì)南海能儀器股份有限公司；5430R型冷凍離心機(jī),德國Eppendrof公司；SD-1500型立式噴霧干燥機(jī),上海沃迪科技有限公司；1260自動(dòng)氨基酸分析儀,美國Agilent公司；GST-3-1200型馬弗爐,上海廣樹機(jī)電有限公司；RNF0 460-016型多功能卷式膜設(shè)備、PE50(切割分子量50 kDa)型和PE5(切割分子量5 kDa)型卷式膜,無錫海思瑞公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 藜麥蛋白的制備工藝

藜麥蛋白的制備工藝如圖1所示。

圖1 工藝流程圖

1.3.2 藜麥蛋白浸提工藝優(yōu)化

將脫皮藜麥?zhǔn)褂檬覝刈詠硭逑?次以去除雜質(zhì),于45 ℃烘箱中烘干后粉碎。藜麥粉末通過60目篩后備用。

1.3.2.1 料液比

精確稱取3 g藜麥粉末加入50 mL離心管中,按照堿液質(zhì)量濃度1.25 g/L,振蕩速率120 r/min,浸提時(shí)間3 h,浸提溫度25 ℃,控制料液比分別為1∶4、1∶6、1∶8、1∶10和1∶12(g∶mL)在水浴搖床中進(jìn)行蛋白浸提。

1.3.2.2 堿液濃度

精確稱取3 g藜麥粉末加入50 mL離心管中,按照料液比1∶10(g∶mL),振蕩速率120 r/min,浸提時(shí)間3 h,浸提溫度25 ℃,分別控制堿液質(zhì)量濃度0.5、0.75、1.00、1.25和1.5 g/L在水浴搖床中進(jìn)行蛋白浸提。

1.3.2.3 浸提時(shí)間

精確稱取3 g藜麥粉末加入50 mL離心管中,按照料液比1∶10(g∶mL),振蕩速率120 r/min,浸提時(shí)間3 h,浸提溫度25 ℃,在水浴搖床中分別提取1、2、3、4和5 h。

1.3.2.4 浸提溫度

精確稱取3 g藜麥粉末加入50 mL離心管中,按照料液比1∶10(g∶mL),堿液質(zhì)量濃度1 g/L,振蕩速率120 r/min,分別控制浸提溫度25、30、35、40、45 ℃,在水浴搖床中提取3 h。

1.3.3 藜麥蛋白的超濾濃縮

1.3.3.1 超濾工藝流程

超濾工藝流程如圖2所示。

圖2 超濾工藝流程

1.3.3.2 超濾膜的選擇

藜麥蛋白提取液依據(jù)1.3.2 藜麥蛋白浸提工藝優(yōu)化方案制備,在溫度25 ℃,壓強(qiáng)0.2 MPa,循環(huán)流量5 L/min條件下,分別測(cè)試PES50型與PES5型卷式超濾膜各項(xiàng)性能指標(biāo),選擇濃縮蛋白工藝膜組件。

1.3.3.3 超濾工藝選擇

藜麥蛋白提取液依據(jù)1.3.2 藜麥蛋白浸提工藝優(yōu)化方案制備,在溫度25 ℃,壓強(qiáng)0.2 MPa,循環(huán)流量5 L/min條件下,將提取液濃縮為原有體積一半后,兌水恢復(fù)至原有體積,重復(fù)這一過程記錄每一階段初始與末尾膜通量。

1.3.4 測(cè)定方法

1.3.4.1 基本組成成分的測(cè)定

脫皮藜麥的蛋白質(zhì)測(cè)定參照GB/T 5009.5—2016使用凱氏定氮法；脂肪含量測(cè)定參照GB 5009.6—2016使用索氏提取法；淀粉含量測(cè)定參照GB 5009.9—2016；膳食纖維含量測(cè)定參照GB 5009.88—2014；水分含量測(cè)定參照GB 5009.3—2016；灰分含量測(cè)定參照GB 5009.4—2016。

1.3.4.2 蛋白濃度的測(cè)定

蛋白濃度的測(cè)定使用雙縮脲法[10]。

1.3.4.3 總糖濃度的測(cè)定

總糖濃度的測(cè)定使用硫酸蒽酮法[11]。

1.3.4.4 蛋白浸出率的測(cè)定

蛋白浸出率按公式(1)計(jì)算:

(1)

1.3.4.5 截留率的測(cè)定

截留率是膜分離技術(shù)的一項(xiàng)重要指標(biāo),指膜截留的特定溶質(zhì)占溶液總特定溶質(zhì)的比率,在一定條件下,被截住物質(zhì)的最小分子質(zhì)量即為膜的截留分子量。為了獲得更高的蛋白得率,同時(shí)分離糖等小分子雜質(zhì),本課題使用截留率R表征膜的分離能力,截留率R按公式(2)計(jì)算:

(2)

式中：ρ1,透過液的總糖或蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度,mg/L；ρ2,進(jìn)料液的總糖或蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度,mg/L。

1.3.4.6 膜通量的測(cè)定

膜通量為單位時(shí)間內(nèi)通過單位有效膜面積的流量,其單位一般為L/(m2·h),高膜通量意味著可以用更短的時(shí)間在更小的膜面積下達(dá)成過濾效果。膜通量J按公式(3)計(jì)算：

(3)

式中：V,取樣體積,L；t,取樣時(shí)間,h；A,膜面積,m2。

1.3.4.7 溶液固形物含量的測(cè)定

固形物含量測(cè)定參考石磊等[12]使用的折光法。取超濾截留液、透過液,快速于折光儀上讀數(shù),依據(jù)溫度計(jì)讀數(shù)進(jìn)行溫差補(bǔ)償,每個(gè)樣品取3次分別讀數(shù)并計(jì)算固形物含量(%)平均值。

1.3.4.8 蛋白得率的計(jì)算

蛋白得率按公式(4)計(jì)算:

蛋白得率/%=蛋白浸出率×R蛋白×100

(4)

1.3.5 噴霧干燥

將濃縮蛋白樣品以進(jìn)風(fēng)溫度180～190 ℃,出風(fēng)溫度70～80 ℃進(jìn)行噴霧干燥。

1.3.6 凝膠電泳分析

參照王棐等[6]的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)方法,并稍作修改。分離膠濃度為12%,濃縮膠濃度為4%。使用20 g/L SDS,100 g/L甘油,50 g/L β-巰基乙醇和0.2 g/L溴酚藍(lán)溶于0.01 mol/L pH 7.4的Tris-HCl緩沖液,配制2 mg/mL的蛋白溶液,沸水加熱5 min后點(diǎn)樣,上樣量為10 μL。濃縮膠階段使用電壓80 V,分離膠階段使用電壓120 V。電泳結(jié)束使用考馬斯亮藍(lán)R-250染色。

1.3.7 氨基酸分析

稱取0.5 mL樣品至水解管中,加入8 mL 6 mol/L HCl溶液,充氮密封后,120 ℃水解22 h后,加入4.8 mL 10 mol/L NaOH溶液中和,然后用去離子水定容至25 mL,過濾,離心(10 000 r/min,30 min),取上清液,使用0.22 μm濾膜過濾。另外取相同樣品進(jìn)行堿水解后測(cè)定色氨酸。使用氨基酸分析儀進(jìn)行分析檢測(cè)。

1.3.8 營養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)

營養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)采用氨基酸評(píng)分(amino acid score,AAS)、化學(xué)評(píng)分(chemical score,CS)、必需氨基酸指數(shù)(essential amino acid index,EAAI)進(jìn)行,分別按公式(5)(6)(7)計(jì)算：

(5)

(6)

(7)

式中：n,比較的氨基酸個(gè)數(shù)；a,b,…,h分別為藜麥每種必需氨基酸的含量,g/100 g (蛋白質(zhì))；ae,be,…,he分別為雞蛋蛋白質(zhì)的每種必需氨基酸的含量,g/100 g (蛋白質(zhì))。

1.3.9 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)作圖采用Origin 17.0。數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 堿提取工藝優(yōu)化

在工業(yè)生產(chǎn)中,高料液比會(huì)使用更多的水,意味著需要更大的罐體,這不僅造成設(shè)備成本上升,并且使蛋白濃度較低,也會(huì)使得濃縮成本變大。而在低料液比下,由于膳食纖維等多糖類物質(zhì)吸水膨脹[13],使得反應(yīng)體系黏度大,傳質(zhì)困難,降低了浸出率。如圖3-a所示,隨著料液比增加,蛋白的浸出率逐漸上升,并在料液比1∶10(g∶mL)時(shí)趨于穩(wěn)定,繼續(xù)增加料液比并不能使蛋白浸出率上升,反而會(huì)因?yàn)樘崛∫旱鞍诐舛鹊?造成后續(xù)蛋白濃縮困難加大。因此,浸提的料液比在1∶10(g∶mL)較為合適。

堿液濃度會(huì)影響蛋白提取率和純度[14],從圖3-b觀察到,在堿液質(zhì)量濃度0.5～1.25 g/L范圍內(nèi),蛋白質(zhì)的浸出率會(huì)持續(xù)升高,這是因?yàn)榈入婞c(diǎn)偏離增加了蛋白質(zhì)溶解性。同時(shí),堿液可以破壞纖維素[15],使得藜麥的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)疏松,進(jìn)一步提高藜麥堿溶性物質(zhì)的析出率。堿液濃度升高不僅會(huì)造成蛋白變性,而且會(huì)導(dǎo)致后續(xù)產(chǎn)品含鹽量過高。因此選擇1 g/L的堿液質(zhì)量濃度進(jìn)行浸提。

工業(yè)生產(chǎn)過程中總是希望提取時(shí)間能夠保持在一個(gè)合適的范圍,提取時(shí)間過短時(shí)蛋白浸出率不足,過長則會(huì)導(dǎo)致資源浪費(fèi)和微生物污染等問題。從圖3-c可知,藜麥蛋白的浸出率在3 h已經(jīng)達(dá)到了最大。

溫度對(duì)蛋白浸出率的影響如圖3-d所示,在35 ℃時(shí),藜麥蛋白浸出率最大。先前已有研究表明藜麥蛋白在溫度較高時(shí)溶解度會(huì)下降[6],這可能是因?yàn)檗见湹鞍鬃陨硖匦院娃见湹矸酆贵w系黏度增大導(dǎo)致的。堿性條件下,藜麥淀粉受熱更容易發(fā)生溶脹和糊化現(xiàn)象,阻礙蛋白析出。綜合考慮,藜麥蛋白的提取條件選擇35 ℃下以1∶10(g∶mL)的料液比于1 g/L的NaOH溶液中提取3 h。

a-料液比；b-堿液質(zhì)量濃度；c-提取時(shí)間；d-溫度

2.2 超濾膜的選擇

超濾濃縮藜麥蛋白使用膜前壓強(qiáng)0.2 MPa進(jìn)行,溫度使用夾套水浴控制于25 ℃下進(jìn)行,膜表面流速設(shè)定為5 L/min。對(duì)比PES50與PES5的膜通量變化,結(jié)果如圖4所示。2種膜的膜通量在超濾前期均下降較快,隨后逐漸穩(wěn)定。PES50超濾膜的膜通量一直高于PES5。膜通量下降可能是由于膜污染和濃差極化現(xiàn)象導(dǎo)致[16-17]。在膜分離過程中,溶液體系中存在的懸浮粒子會(huì)在跨膜壓強(qiáng)差作用下不斷地堆積、吸附于膜的表面,堵塞膜孔降低膜通量；同時(shí)一些低于膜的切割分子質(zhì)量的小分子蛋白也會(huì)吸附于膜通道內(nèi)側(cè)。這種膜通量的下降可以通過膜清洗恢復(fù)。

圖4 膜通量變化

堿提過程中,會(huì)有一些糖類、色素等雜質(zhì)伴隨蛋白一同析出,而大部分這些水溶性雜質(zhì)可以穿過超濾膜。但膜截留過程是復(fù)雜的物理化學(xué)過程,既包含了機(jī)械截留效應(yīng),也存在架橋現(xiàn)象,因此膜截留效果不僅僅取決于膜的孔徑。圖5對(duì)比了PES50型與PES5型超濾膜對(duì)蛋白和總糖的截留效果,兩者對(duì)蛋白質(zhì)的截留率相近,分別達(dá)到了97.41%(PES5)和95.58%(PES50),對(duì)總糖截留率分別是20.6%(PES5)與13.2%(PES50),但是由于PES50的膜通量大幅度高于PES5。這和江連洲等[18]利用1 k、3 k和5 kDa的超濾膜濃縮大豆蛋白的結(jié)果相似。

圖5 不同超濾膜截留率對(duì)比

綜上,為了降低生產(chǎn)成本、增加產(chǎn)量,綜合評(píng)估,選擇PES50膜進(jìn)行超濾方式研究。

2.3 超濾方式的選擇

張曉平等[19]在利用超濾濃縮燕麥蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn),單次連續(xù)濃縮方式會(huì)使得膜通量大幅度下降,濃縮效率低。本實(shí)驗(yàn)使用等體積兌水的方式對(duì)藜麥蛋白多次濃縮純化,結(jié)果如圖6所示,隨著兌水次數(shù)上升,蛋白占固形物的含量也不斷地上升,其中第1次濃縮增長幅度最大,由44.21%提至60.12%,這和周大寨等[20]兌水超濾蕓豆蛋白質(zhì)的研究結(jié)果相似。在兌水階段,截留液固形物含量基本維持不變,而透過液固形物含量則持續(xù)下降。在第4次兌水時(shí),透過液固形物含量下降到0.28%,蛋白質(zhì)占截留液固形物含量的69.99%,可推測(cè)此時(shí)影響蛋白純度的雜質(zhì)多為大分子雜質(zhì),已經(jīng)很難通過膜處理的方式持續(xù)提高純度。

圖6 等體積兌水對(duì)超濾效果的影響

等體積兌水對(duì)膜通量的變化影響如圖7所示,可以觀察到,每一次濃縮液兌水稀釋之后膜通量都會(huì)大幅度恢復(fù),在濃縮后期又會(huì)下降。這表明了在藜麥蛋白濃縮過程中,最主要的阻礙作用就是濃差極化現(xiàn)象。這種現(xiàn)象產(chǎn)生原因是蛋白浸出液中,溶液在壓強(qiáng)差存在下透過膜,而大分子物質(zhì)無法透過膜,會(huì)在膜表面區(qū)域形成一個(gè)具有明顯濃度梯度差的區(qū)域。在高濃度區(qū)域的溶質(zhì)會(huì)以濃度差為驅(qū)動(dòng)力,持續(xù)向低濃度區(qū)域擴(kuò)散,并形成邊界層。這個(gè)邊界層會(huì)阻礙壓強(qiáng)差驅(qū)動(dòng)的膜傳質(zhì)過程,降低膜通量。

圖7 等體積兌水對(duì)膜通量的影響

2.4 膜濃縮蛋白分析

使用濃縮2倍的藜麥蛋白進(jìn)行噴霧干燥后對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行分析,成分分析如表1所示。利用堿提膜濃縮方式生產(chǎn)藜麥蛋白得率達(dá)到了81.24%,顯著高于王棐等[6]利用堿提酸沉法得率為67.13%和田格等[8]利用酶法制備藜麥蛋白的得率為76.82%。同時(shí)堿提膜濃縮可以顯著提高藜麥蛋白純度,但仍然低于ALUKO等[21]報(bào)道的65.52%。由于藜麥蛋白的超濾制備研究較少,對(duì)比其他谷物類蛋白超濾濃縮研究[9],本實(shí)驗(yàn)?zāi)しㄖ苽滢见湹鞍椎闹竞枯^高。這極有可能是因?yàn)闆]有對(duì)藜麥原料進(jìn)行脫脂處理,在浸提階段,脂肪會(huì)與蛋白質(zhì)乳化形成脂肪球,離心無法使得油相與水相分離。同時(shí)這些脂肪球也無法通過超濾膜,最終導(dǎo)致膜制備藜麥蛋白的純度不高。

表1 脫皮藜麥和膜制備藜麥蛋白成分組成 單位：%

使用還原性SDS-PAGE分析藜麥超濾濃縮蛋白的結(jié)構(gòu)如圖8所示。膜濃縮藜麥蛋白的亞基組成和酸沉蛋白的亞基組成相似。藜麥膜濃縮蛋白的主要組成成分是11S球蛋白、7S球蛋白和2S白蛋白。其中藜麥的11S球蛋白是由6個(gè)分子質(zhì)量在22 k～26 kDa的堿性亞基和6個(gè)分子質(zhì)量在33 k～36 kDa的酸性亞基組成的六聚體結(jié)構(gòu)。11S球蛋白的分子質(zhì)量大約在320 kDa。60 kDa的條帶則對(duì)應(yīng)著7S球蛋白[22]。而藜麥的2S白蛋白主要是由8 k～9 kDa的多肽鏈構(gòu)成[23]。

圖8 藜麥蛋白電泳圖

氨基酸組成分析結(jié)果如表2所示,與NAVARRO-LISBOA等[24]研究結(jié)果不同,通過PES50型超濾膜制備藜麥蛋白,可以保持氨基酸組成相對(duì)穩(wěn)定。這可能是因?yàn)镻ES50型超濾膜的截留分子量遠(yuǎn)小于其研究使用的300 kDa陶瓷超濾膜,因此可以截留更多分子量較低的藜麥蛋白成分。

表2 氨基酸組成分析

膜制備藜麥蛋白的營養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)如表3所示,1991年FAO/WHO建議食物中蛋白質(zhì)必需氨基酸含量應(yīng)當(dāng)接近40%[25]。而藜麥蛋白的必需氨基酸占比為38.3%,非常接近這一標(biāo)準(zhǔn)。AAS反映了氨基酸所占比例與FAO/WHO推薦模式的接近程度,越接近100則越適合人類。結(jié)果顯示,盡管賴氨酸作為藜麥蛋白的第一限制性氨基酸,但評(píng)分依然達(dá)到了95,十分接近100。CS結(jié)果表明藜麥蛋白的第一限制性氨基酸為蛋氨酸與半胱氨酸。EAAI作為綜合評(píng)價(jià)食品蛋白質(zhì)質(zhì)量的指標(biāo),反映了食品蛋白質(zhì)與理想的全蛋蛋白質(zhì)之間的接近程度,目前被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)營養(yǎng)評(píng)價(jià)。藜麥濃縮蛋白的EAAI計(jì)算結(jié)果為78,這顯著高于小麥蛋白的EAAI(60)[26]。綜合來看,藜麥濃縮蛋白的氨基酸種類齊全,配比合理,是一種非常優(yōu)質(zhì)的蛋白資源。

表3 藜麥蛋白的營養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過利用堿提取工藝浸出藜麥蛋白,使用膜濃縮工藝對(duì)蛋白進(jìn)行提純。經(jīng)過工藝優(yōu)化,選擇堿提條件為35 ℃下,以1∶10(g∶mL)的料液比于1 g/L的NaOH溶液中提取3 h,膜濃縮使用PES50膜,在0.2 MPa工作壓強(qiáng)下,25 ℃循環(huán)濃縮2倍后噴干,最終藜麥蛋白的得率相較于其他研究中使用的堿提酸沉法高23.99%,達(dá)到了81.24%,純度為60.12%?？梢允褂妹撝に嚭投啻蝺端に?yán)^續(xù)提高蛋白純度。電泳結(jié)果表明藜麥濃縮蛋白主要是由球蛋白和白蛋白構(gòu)成。通過氨基酸分析和營養(yǎng)評(píng)價(jià),發(fā)現(xiàn)利用超濾濃縮藜麥蛋白,可以較大程度保持藜麥蛋白優(yōu)異的氨基酸組成模式。因此,膜方式生產(chǎn)藜麥蛋白是一種可行的方法。