HPLC 測定甲基硫菌靈可濕性粉劑中有效成分的方法研究*

李建兵，喬海清，劉 黎，李世全，王曉濱

（1.青島市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，山東 青島 266101；2.國家海洋精細(xì)化工及其生物制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，山東 青島 266101；3.青島市黃島區(qū)檢驗(yàn)檢測中心，山東 青島 266555）

農(nóng)藥是確保農(nóng)業(yè)高收豐產(chǎn)的重要農(nóng)資之一，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)離不開農(nóng)藥[1]。我國是農(nóng)藥生產(chǎn)和使用大國，也是農(nóng)藥出口大國。農(nóng)藥產(chǎn)品質(zhì)量事關(guān)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全、農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全和生態(tài)環(huán)境安全，然而農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公布的近3 年農(nóng)藥產(chǎn)品質(zhì)量總體合格率為88.7%，不合格產(chǎn)品主要集中于有效成分不合格和隱性農(nóng)藥的添加[2]。農(nóng)藥有效成分及含量的監(jiān)管面臨著嚴(yán)峻的考驗(yàn)，關(guān)鍵在于農(nóng)藥中有效成分和隱性成分的準(zhǔn)確定量測定。

各類農(nóng)藥及其制劑產(chǎn)品中有效成分的液相色譜檢測方法大多選用甲醇或者甲醇水作為溶劑，可濕性粉劑在加工過程中一般會加入載體和助劑，甲基硫菌靈的測定一般用甲醇提取[3,4]，外標(biāo)法具有操作簡單，分析快速的優(yōu)點(diǎn)，但在復(fù)雜組分中可能存在基質(zhì)效益的影響；標(biāo)準(zhǔn)加入法能夠有效消除基質(zhì)干擾，但操作略為復(fù)雜，結(jié)果更加準(zhǔn)確[5]。本文選取常見的甲基硫菌靈可濕性粉劑為研究對象，采用高效液相色譜法進(jìn)行分析，采用外標(biāo)法和標(biāo)準(zhǔn)加入法兩種定量測定方法進(jìn)行比較研究，為在以后的農(nóng)藥產(chǎn)品仲裁檢驗(yàn)、產(chǎn)品復(fù)檢、標(biāo)準(zhǔn)制修訂時(shí)提供依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

1200 高 效 液 相 色 譜 儀（Agilent）；ML204T/02，0.1mg 電子天平（METTLER）。

甲醇（色譜純CNW 安譜）。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：甲基硫菌靈（Dr.Ehrenstorfer）。

1.2 液相色譜條件

Thermo Hypersil Gold C18柱（250mm×4.6mm，粒徑5μm），流動相甲醇∶水=60∶40，流速1.0mL·min-1，進(jìn)樣體積10μL，紫外檢測器，檢測波長269nm。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配置

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液 稱取0.1g（精確至0.0001g）甲基硫菌靈標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于50mL 容量瓶中，加入甲醇溶解，并定容至刻度線，配制成2mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)中間液 準(zhǔn)確移取5.0mL 1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液于50mL 容量瓶中，加入甲醇定容至刻度線，配制成0.2mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)中間液。

1.3.3 外標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)工作液 取1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液和

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)中間液用甲醇逐級稀釋成0.02～0.6mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4 樣品前處理

共選取3 個(gè)不同廠家甲基硫菌靈可濕性粉劑產(chǎn)品，標(biāo)稱濃度為70%。

1.4.1 外標(biāo)法前處理 分別稱取0.1、0.143、0.2、0.4g 樣品于50mL 容量瓶中，然后準(zhǔn)確移取5.0mL于50mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度線，稀釋10倍，過濾待測。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)加入法前處理 分別稱取0.1、0.143g 各3 組樣品于50mL 容量瓶中，加入甲醇溶解定容至刻度線。準(zhǔn)確移取5.0mL 于50mL 容量瓶中，第2、3 組樣品再準(zhǔn)確加入2.5 和5.0mL 0.2mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)使用液（1.3.2），用甲醇定容至刻度線。過濾待測。

2 結(jié)果與討論

2.1 外標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

外標(biāo)法配制0.02～0.6mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析，線性回歸方程為y=30916.4x+14.15。標(biāo)準(zhǔn)加入法曲線按照1.4.3 處理，以0 倍、1 倍、2 倍加標(biāo)量峰面積為縱坐標(biāo)，加標(biāo)量為橫坐標(biāo)擬合曲線并進(jìn)行樣品檢測。外標(biāo)法和標(biāo)準(zhǔn)加入法曲線線性相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99，結(jié)果表明，在所測定濃度范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好。

2.2 方法精密度

取其中一個(gè)70%甲基硫菌靈可濕性粉劑樣品連續(xù)測定8 次，外標(biāo)法和標(biāo)準(zhǔn)加入法精密度分別為0.83%和1.49%（見圖1），表明外標(biāo)法和標(biāo)準(zhǔn)加入法精密度良好。

圖1 外標(biāo)法和標(biāo)準(zhǔn)加入法精密度Fig.1 Precision of external standard method and standard addition method

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是農(nóng)藥測定時(shí)不可忽視的一個(gè)重要問題，采用t 檢驗(yàn)比較外標(biāo)法和標(biāo)準(zhǔn)加入法標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率來考察甲基硫菌靈可濕性粉劑的基質(zhì)效應(yīng)。標(biāo)準(zhǔn)加入法與外標(biāo)法斜率比較的t 值根據(jù)公式（1）計(jì)算。標(biāo)準(zhǔn)加入法與外標(biāo)法斜率統(tǒng)計(jì)量t 值為96.24（＞t（11）0.05臨界值=2.20）。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，對于甲基硫菌靈可濕性粉劑，標(biāo)準(zhǔn)加入法的斜率與外標(biāo)法的斜率存在顯著差異（置信水平α=0.05）。標(biāo)準(zhǔn)加入法的斜率遠(yuǎn)小于外標(biāo)法斜率，這表明，甲基硫菌靈可濕性粉劑的基質(zhì)效應(yīng)為強(qiáng)的抑制效應(yīng)，標(biāo)準(zhǔn)加入法定量甲基硫菌靈可濕性粉劑的檢測結(jié)果更可靠。

式中 t：標(biāo)準(zhǔn)加入法與外標(biāo)法斜率的統(tǒng)計(jì)量；X：標(biāo)準(zhǔn)加入法斜率平均值；μ：外標(biāo)法斜率；σX：標(biāo)準(zhǔn)加入法斜率標(biāo)準(zhǔn)差；n：標(biāo)準(zhǔn)加入法斜率測定次數(shù)。

2.4 外標(biāo)法及標(biāo)準(zhǔn)加入法的檢出限和定量限

以3 倍和10 倍信噪比作為外標(biāo)法和標(biāo)準(zhǔn)加入法的檢出限和定量限。外標(biāo)法檢出限和定量限分別為4mg·kg-1和14mg·kg-1，標(biāo)準(zhǔn)加入法檢出限和定量限23mg·kg-1和78mg·kg-1。外標(biāo)法和標(biāo)準(zhǔn)加入法的檢出限和定量限差別較大可能是由于標(biāo)準(zhǔn)加入法的抑制基質(zhì)效應(yīng)產(chǎn)生的。

2.5 外標(biāo)法和標(biāo)準(zhǔn)加入法的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

依照1.4 樣品處理和1.2 液相色譜條件，對3 個(gè)不同廠家的產(chǎn)品分別用外標(biāo)法和標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行了檢測，3 個(gè)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)加入法定量結(jié)果分別為70.09%、70.11%、70.91%；外標(biāo)法定量結(jié)果分別為73.34%、73.73%、74.11%。采用F 檢驗(yàn)對標(biāo)準(zhǔn)加入法和外標(biāo)法定量結(jié)果進(jìn)行比較，標(biāo)準(zhǔn)加入法與外標(biāo)法（p<0.001）有顯著差異（見表1）。對任意兩種不同定量方法測試結(jié)果的一致性采用t 檢驗(yàn)方法進(jìn)行比較，有顯著差異的兩種定量方法，采用異方差假設(shè)的t 檢驗(yàn)方式。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)加入法與外標(biāo)法檢測結(jié)果間存在顯著差異（顯著性水平α=0.05）；而標(biāo)準(zhǔn)加入法檢測的結(jié)果更接近企業(yè)按照配方生產(chǎn)的甲基硫菌靈可濕性粉劑的標(biāo)稱濃度，間接說明標(biāo)準(zhǔn)加入法檢測的結(jié)果更加準(zhǔn)確和可靠。

表1 甲基硫菌靈可濕性粉劑兩種定量方法測定結(jié)果（采用F 檢驗(yàn)）Tab.1 F test of two different quantitative methods of thiophanate-methyl in wettable powder

表2 甲基硫菌靈可濕性粉劑兩種定量方法測定結(jié)果（采用t-檢驗(yàn)）Tab.2 t-test of two different quantitative methods of thiophanate-methyl in wettable powder

3 結(jié)論

本文利用HPLC 法對不同的70%甲基硫菌靈可濕性粉劑農(nóng)藥產(chǎn)品進(jìn)行測定，通過對外標(biāo)法和標(biāo)準(zhǔn)加入法分別定量分析比較，兩種方法線性好，精密度高，外標(biāo)法測定甲基硫菌靈可濕性粉劑時(shí)存在基質(zhì)效應(yīng)，F(xiàn)-檢驗(yàn)和t-檢驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)標(biāo)準(zhǔn)加入法和外標(biāo)法在測定甲基硫菌靈可濕性粉劑時(shí)存在顯著差異，在實(shí)際檢測中建議采用標(biāo)準(zhǔn)加入法獲得更加準(zhǔn)確可靠的結(jié)果。