高壓氧對(duì)糖尿病足創(chuàng)面組織中VEGF、EGF表達(dá)水平的影響

何明杰 甘忠貴 鄭愛(ài)甜 黃 慶 吳標(biāo)良

糖尿病足是糖尿病患者的重要并發(fā)癥之一，也是糖尿病患者致殘、致死的主要原因之一。研究數(shù)據(jù)顯示，糖尿病患者在其一生中罹患糖尿病足的風(fēng)險(xiǎn)高達(dá)25%以上，罹患糖尿病足的患者年死亡率高達(dá)11%，而因糖尿病足截肢的患者死亡率高達(dá)22%［1］。糖尿病足患者因合并下肢血管或周圍神經(jīng)病變，局部組織營(yíng)養(yǎng)狀況及免疫力較差，易導(dǎo)致創(chuàng)面遷延不愈而發(fā)展為慢性潰瘍。目前，臨床主要采用局部清創(chuàng)、血管介入、負(fù)壓封閉引流、高壓氧等方法治療糖尿病足，且近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)高壓氧可通過(guò)改善局部動(dòng)脈血流和組織供氧、減輕炎癥反應(yīng)、刺激生長(zhǎng)因子釋放等促進(jìn)糖尿病足創(chuàng)面的愈合，在糖尿病足的治療中取得了較好的臨床療效［2］。筆者鑒于血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）等細(xì)胞因子與創(chuàng)面的愈合密切相關(guān)［3］，于本研究中對(duì)比觀察了高壓氧對(duì)糖尿病足患者創(chuàng)面組織內(nèi)VEGF、EGF表達(dá)水平的影響，以進(jìn)一步指導(dǎo)高壓氧在糖尿病足治療中的應(yīng)用，并為其提供理論支持。

1 臨床資料

1.1 一般資料

選取2016年3月至2019年6月右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院收治的48例Wagner 1～2級(jí)糖尿病足患者作為研究對(duì)象，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)法將其隨機(jī)分為研究組與對(duì)照組，每組24例。兩組患者性別、年齡等一般資料對(duì)比，P均＞0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性（表1）。本研究經(jīng)右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且所有患者均簽署了知情同意書(shū)。

表1 兩組糖尿病足患者一般資料對(duì)比Table 1 Comparison of general data of patients with diabetic foot between the two groups

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：符合Wagner 1～2級(jí)糖尿病足的診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］；對(duì)本研究知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：入選前30 d內(nèi)接受過(guò)生長(zhǎng)因子或高壓氧等治療；合并創(chuàng)面嚴(yán)重感染或全身感染；合并有嚴(yán)重心、肝、腎等重要臟器功能障礙；合并有惡性腫瘤或其他免疫系統(tǒng)疾??；合并有溝通障礙性疾病或有精神病病史；長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、抗生素等藥物。

2 方法

2.1 基礎(chǔ)治療

兩組患者入院后均予以積極治療基礎(chǔ)疾?。崭寡强刂圃?～8 mmol／L，餐后2 h血糖控制在12 mmol／L以下，血壓控制在130／80 mmHg左右）、改善微循環(huán)、根據(jù)創(chuàng)面分泌物病原學(xué)檢查及藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果使用敏感抗生素抗感染、營(yíng)養(yǎng)支持等對(duì)癥支持治療。

2.2 局部治療

對(duì)照組：局部創(chuàng)面于生理鹽水沖洗、壞死組織清除后，采用碘伏常規(guī)消毒創(chuàng)面及創(chuàng)周皮膚，并覆蓋無(wú)菌敷料包扎，根據(jù)創(chuàng)面滲出情況每天換藥1～2次。

研究組：在對(duì)照組常規(guī)清創(chuàng)換藥治療的基礎(chǔ)上聯(lián)合應(yīng)用高壓氧治療，患者進(jìn)入高壓氧艙后，勻速加壓20 min，使壓力達(dá)到并維持在0.2 MPa；壓力穩(wěn)定后，患者戴面罩吸氧20 min，間隔5 min，重復(fù)循環(huán)吸氧3次；繼而，勻速減壓20 min至常壓狀態(tài)，結(jié)束治療，每天1次，每周連續(xù)治療5 d，共治療2周。

2.3 觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

對(duì)比觀察兩組患者創(chuàng)面組織形態(tài)學(xué)及VEGF、EGF表達(dá)水平變化情況。治療第3、7、12天，隨機(jī)取足部創(chuàng)面組織2份，1份采用福爾馬林固定后石蠟包埋、切片、HE染色，顯微鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)變化；1份常規(guī)石蠟包埋、切片后，采用免疫組化SABC法檢測(cè)VEGF、EGF表達(dá)水平。免疫組化SABC法：將切片置于溫箱內(nèi)孵育30 min后，二甲苯脫蠟、乙醇梯度水化，繼而置于高壓蒸汽中加熱行抗原修復(fù)，并對(duì)內(nèi)源性過(guò)氧化物酶進(jìn)行封閉；加入羊血清常溫孵育1 h后，分別加入兔抗人VEGF、EGF多克隆抗體（1∶200），4℃冰箱內(nèi)過(guò)夜；經(jīng)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的廣譜二抗孵育1 h后，置于4℃冰箱內(nèi)保存30 min；二氨基聯(lián)苯胺溶液顯色后，脫水、透明、封片。每例標(biāo)本隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野（×400）進(jìn)行觀察，采用免疫反應(yīng)積分法（immunoreactive score，IRS）［5］統(tǒng)計(jì)VEGF、EGF表達(dá)情況：胞漿或胞核內(nèi)顆粒呈棕褐色為強(qiáng)陽(yáng)性3分，棕黃色為陽(yáng)性2分，淡黃色為弱陽(yáng)性1分，未著色為陰性0分；陽(yáng)性細(xì)胞百分比＞75%為4分，51%～75%為3分，26%～50%為2分，≤25%為1分；IRS積分＝染色強(qiáng)度積分×陽(yáng)性細(xì)胞百分比積分，兩次IRS積分均值作為最終結(jié)果。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)或百分比表示，采用卡方檢驗(yàn)；符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；均以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 兩組患者創(chuàng)面組織形態(tài)學(xué)變化情況

治療第3天，對(duì)照組患者創(chuàng)面組織可見(jiàn)明顯水腫；研究組患者創(chuàng)面組織可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)與少量成纖維細(xì)胞分布。治療第7天，對(duì)照組患者創(chuàng)面組織仍有水腫，可見(jiàn)炎癥細(xì)胞和少量成纖維細(xì)胞；研究組患者創(chuàng)面組織內(nèi)可見(jiàn)新生血管明顯增多且排列整齊。治療第12天，對(duì)照組患者創(chuàng)面組織內(nèi)可見(jiàn)較多成纖維細(xì)胞，新生血管增多但排列仍較紊亂；研究組患者創(chuàng)面組織內(nèi)可見(jiàn)大量成纖維細(xì)胞和排列整齊的新生血管。創(chuàng)面組織形態(tài)學(xué)典型圖片見(jiàn)圖1－6。

3.2 兩組患者創(chuàng)面組織內(nèi)VEGF、EGF表達(dá)情況

免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，VEGF表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞胞漿內(nèi)（圖7－12），EGF表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及炎癥細(xì)胞胞漿內(nèi)（圖13－18）。

圖1 －3 對(duì)照組患者治療第3、7、12天創(chuàng)面組織HE染色典型圖（×200）；圖4－6 研究組患者治療第3、7、12天創(chuàng)面組織HE染色典型圖（×200）Fig.1－3 Typical graphs of HE staining of wound tissues of patients in the control group on day 3，7 and 12 of treatment（×200）； Fig.4－6 Typical graphs of HE staining of wound tissues of patients in the study group on day 3，7 and 12 of treatment（×200）

圖7 －9 對(duì)照組患者治療第3、7、12天創(chuàng)面組織VEGF免疫組化典型圖（×400）；圖10－12 研究組患者治療第3、7、12天創(chuàng)面組織VEGF免疫組化典型圖（×400）；圖13－15 對(duì)照組患者治療第3、7、12天創(chuàng)面組織EGF免疫組化典型圖（×400）；圖16－18 研究組患者治療第3、7、12天創(chuàng)面組織EGF免疫組化典型圖（×400）Fig.7－9 Typical immunohistological graphs of VEGF in the wound tissues of patients in the control group on day 3，7 and 12 of treatment（×400）； Fig.10－12 Typical immunohistological graphs of VEGF in the wound tissues of patients in the study group on day 3，7 and 12 of treatment（×400）； Fig.13－15 Typical immunohistological graphs of EGF in the wound tissues of patients in the control group on day 3，7 and 12 of treatment（×400）； Fig.16－18 Typical immunohistological graphs of EGF in the wound tissues of patients in the study group on day 3，7 and 12 of treatment（×400）

治療第3、7、12天，兩組患者創(chuàng)面組織內(nèi)VEGF、EGF表達(dá)水平均逐漸升高，除治療第3天兩組患者創(chuàng)面組織內(nèi)VEGF表達(dá)水平無(wú)顯著差異外，治療第7、12天研究組患者創(chuàng)面組織內(nèi)VEGF表達(dá)水平及各時(shí)間點(diǎn)EGF表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組（P均＜0.05），詳見(jiàn)表2。

表2 兩組糖尿病足患者創(chuàng)面組織內(nèi)VEGF、EGF表達(dá)水平對(duì)比（±s）Table 2 Comparison of expression levels of VEGF and EGF in the wound tissue of patients with diabetic foot between the two groups（±s）

表2 兩組糖尿病足患者創(chuàng)面組織內(nèi)VEGF、EGF表達(dá)水平對(duì)比（±s）Table 2 Comparison of expression levels of VEGF and EGF in the wound tissue of patients with diabetic foot between the two groups（±s）

注：VEGF為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、EGF為表皮生長(zhǎng)因子；研究組患者采用常規(guī)清創(chuàng)換藥聯(lián)合高壓氧治療，對(duì)照組患者采用常規(guī)清創(chuàng)換藥治療Note：VEGF－vascular endothelial growth factor，EGF－epidermal growth factor.Patients in the study group were treated with the conventional debridement and dressing change combined with hyperbaric oxygen therapy，whereas patients in the control group were treated only with the conventional debridement and dressing change

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4 討論

創(chuàng)面愈合包括炎癥反應(yīng)期、肉芽組織增生期、瘢痕形成期3個(gè)階段，由多種細(xì)胞因子、炎癥因子共同參與［6］。相關(guān)研究顯示，糖尿病足創(chuàng)面遷延不愈與創(chuàng)面組織細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)因子及其受體相對(duì)或絕對(duì)缺乏密切相關(guān)［7］。VEGF作為唯一作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性促血管生成因子，能夠通過(guò)促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移參與新生血管的形成；EGF可通過(guò)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的新生、增殖而加快創(chuàng)面的再生修復(fù)。因此，有效提高糖尿病足患者創(chuàng)面組織內(nèi)VEGF、EGF的表達(dá)水平對(duì)促進(jìn)創(chuàng)面愈合具有重要意義。

相關(guān)研究顯示，高壓氧可通過(guò)提高血液含氧量而促進(jìn)糖尿病足創(chuàng)面的愈合，還可通過(guò)提高內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合酶的活性，增加一氧化氮的合成及分泌，促進(jìn)新生血管的生成而加速創(chuàng)面愈合。本研究結(jié)果顯示，高壓氧治療的研究組患者在治療第7、12天時(shí)創(chuàng)面組織內(nèi)VEGF表達(dá)水平及治療第3、7、12天時(shí)EGF表達(dá)水平均明顯高于常規(guī)清創(chuàng)換藥治療的對(duì)照組，肉芽組織及新生血管形成明顯早于對(duì)照組，與劉艷萍等［8－10］的研究結(jié)果基本一致。目前，有研究學(xué)者認(rèn)為巨噬細(xì)胞M1亞型產(chǎn)生的高水平氧化代謝產(chǎn)物和腫瘤壞死因子?α、白細(xì)胞介素?6等促炎細(xì)胞因子可損傷健康組織細(xì)胞，而巨噬細(xì)胞M2亞型可通過(guò)上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞分泌VEGF及抑炎因子白細(xì)胞介素?8的水平加快血管的再生和基質(zhì)的重塑，而高壓氧可促使M1型巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化，減輕創(chuàng)面炎癥反應(yīng)，提高VEGF的表達(dá)水平，加快創(chuàng)面組織的再生修復(fù)［11－12］。且有研究顯示，高壓氧還可在抑制氧自由基生成的同時(shí)，提高超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶等的活性，加快氧自由基的清除，減輕創(chuàng)面炎癥反應(yīng)程度，且此過(guò)程中活性氧的大量生成還可上調(diào)EGF等生長(zhǎng)因子的表達(dá)水平，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞的新生，加快創(chuàng)面組織的修復(fù)［13－15］。

綜上所述，高壓氧可通過(guò)上調(diào)創(chuàng)面組織內(nèi)VEGF、EGF的表達(dá)水平，促進(jìn)新生血管的生成，加快肉芽組織的生長(zhǎng)，進(jìn)而提高糖尿病足創(chuàng)面的愈合速度，值得臨床推廣應(yīng)用。