環(huán)狀RNA Hsa_circ_0046701在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及臨床價(jià)值

張 欽，田 博，李張珂

（1.海南省婦女兒童醫(yī)學(xué)中心神經(jīng)科學(xué)部神經(jīng)外科，海南 ?？?5 70300；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安710038；3.西安國(guó)際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安 7 10100）

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的原發(fā)性惡性腫瘤，死亡率、復(fù)發(fā)率高。當(dāng)今主流治療方案是手術(shù)切除，術(shù)后輔以放療、化療提高療效，相關(guān)治療近30年無(wú)突破性進(jìn)展。為提高手術(shù)療效、進(jìn)而提高患者生存率、降低復(fù)發(fā)率，對(duì)膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制和治療方案進(jìn)行更深層次地研究是十分必要的［1］，而探明膠質(zhì)瘤相關(guān)的特異標(biāo)志物是研究其發(fā)生發(fā)展中重要的一環(huán)。

環(huán)狀RNA（circular RNA，circ-RNA）是一類內(nèi)源性非編碼RNA，具有穩(wěn)定性好、特異性高、含量豐富等特點(diǎn)，是一種極具潛能的生物標(biāo)志物。此外，circ-RNA在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用，與腫瘤的形成與發(fā)展也有著密切關(guān)系［2］。已報(bào)道的癌癥機(jī)制研究中提示，一些基因與癌癥的發(fā)生發(fā)展等有關(guān)。有關(guān)胃癌的研究報(bào)告表明，hsa_circ-0000745表達(dá)水平與腫瘤分化程度、轉(zhuǎn)移、TNM分期有明顯相關(guān)性［3］；還有研究發(fā)現(xiàn)circ-ITCH與肺癌細(xì)胞的增殖有密切關(guān)系，circ-ITCH通過(guò)結(jié)合miR-7和miR-211發(fā)揮抑癌作用，上調(diào)circ-ITCH可以抑制肺癌細(xì)胞的增殖［4］；膠質(zhì)瘤中circ-FBXW7-185aa的表達(dá)水平明顯下降，同樣circ-FBXW7-185aa有著抑制腫瘤細(xì)胞增殖的功能［5］。hsa_circ_0046701與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，先前的基礎(chǔ)研究表明hsa_circ_0046701在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中表達(dá)明顯上調(diào)，并且hsa_circ_0046701基因的敲除抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲［6］。然而，hsa_circ_0046701對(duì)患者的預(yù)后的影響尚未可知，是否可以將其作為改善患者預(yù)后的生物標(biāo)記物有待進(jìn)一步去探索。本研究結(jié)合臨床隨訪數(shù)據(jù)，分析了hsa_circ_0046701不同表達(dá)水平對(duì)臨床預(yù)后的影響，初步探討了hsa_circ_0046701的表達(dá)在腦膠質(zhì)瘤中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取自2010年7月～2015年1月在空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科行手術(shù)切除的膠質(zhì)瘤患者，共納入55例hsa_circ_0046701表達(dá)陽(yáng)性的患者，男性34例，女性21例，年齡28～77歲。所有病例術(shù)前未接受過(guò)放療、化療、手術(shù)和細(xì)胞免疫治療，且未合并有其他腫瘤。選擇15例顱腦創(chuàng)傷行開(kāi)顱治療的患者，取術(shù)中損傷的腦組織標(biāo)本作為對(duì)照組。本研究獲得了空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院的批準(zhǔn)，患者或其家屬簽署了知情同意書(shū)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

患者均在術(shù)前接受常規(guī)術(shù)前檢查，并在全麻的狀態(tài)下行膠質(zhì)瘤切除術(shù)。手術(shù)過(guò)程中，由同一名主刀醫(yī)師切取瘤組織和正常腦組織標(biāo)本。對(duì)所得樣本進(jìn)行病理學(xué)檢測(cè)：（1）TRIzol法提取標(biāo)本組織中的總RNA，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度，選用OD260/280在1.8～2.1的標(biāo)本；（2）用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；（3）按照qRT-RNA試劑盒說(shuō)明進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)hsa_circ_0046701的表達(dá)水平hsa_circ_0046701引物序列為上游：5'-CACAACCAGAGCACAATTTGA-3'下 游：5'-TGGATCATCAACCAGCTCAG-3'。以上檢驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng) 用SPSS22.0（SPSS Inc，Chicago，IL，USA）統(tǒng)計(jì)分析所得數(shù)據(jù)。以（±s）表示hsa_circ_0046701的相對(duì)表達(dá)量，并用單因素方差分析或t檢驗(yàn)比較組間的差異。應(yīng)用χ2檢驗(yàn)，分析膠質(zhì)瘤患者h(yuǎn)sa_circ_0046701高表達(dá)組與低表達(dá)組患者的臨床病理特征有無(wú)差異。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線后用Log-rank檢驗(yàn)分析不同hsa_circ_0046701表達(dá)量患者的生存率。最后用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行預(yù)后的單因素和多因素分析，評(píng)估hsa_circ_0046701表達(dá)水平對(duì)臨床預(yù)后的影響。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hsa_circ_0046701在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)顯著上調(diào)

qRT-PCR的檢測(cè)結(jié)果顯示hsa_circ_0046701在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組腦組織（正常組織vs.WHOⅠ～Ⅱ級(jí)：1.000±0.193vs.2.588±0.332，P=0.002）。此 外，WHO分 級(jí) 中hsa_circ_0046701在Ⅲ～Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)高于Ⅰ～Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤（3.602±0.228vs.2.588±0.332，P=0.031）。見(jiàn)圖1。

圖1 Hsa_circ_0046701在膠質(zhì)瘤組織Ⅰ～Ⅱ、Ⅲ～Ⅳ級(jí)和正常組織中的表達(dá)水平Fig 1 Expression levels of hsa_circ_0046701 in normal tissues and glioma tissues in gr adeⅠ-Ⅱand gradeⅢ–Ⅳ

2.2 膠質(zhì)瘤患者h(yuǎn)sa_circ_0046701表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系

根據(jù)hsa_circ_0046701表達(dá)量的均值（3.014±0.285）將患者分為高表達(dá)組29例和低表達(dá)組26例。通過(guò)對(duì)患者臨床病理指標(biāo)的比較，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0046701的高表達(dá)與高WHO分級(jí)（P=0.011）、KPS評(píng)分（P=0.002）以及患者術(shù)后復(fù)發(fā)（P=0.002）有關(guān)系，與患者的年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、腫瘤部位等均無(wú)關(guān)系。見(jiàn)表1。

表1 Hsa_circ_0046701表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤患者臨床病理指標(biāo)的關(guān)系Tab 1 The relationship between hsa_circ_0046701 ex?pression level and clinicopathologic indexes in patients with giloma

2.3 Hsa_circ_0046701水平與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后關(guān)系

利用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，繪制患者術(shù)后5年生存率曲線，通過(guò)Log-rank檢驗(yàn)，結(jié)果表明：與hsa_circ_0046701低表達(dá)組相比，高表達(dá)組預(yù)后較差，術(shù)后生存期明顯縮短，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.040 4）。見(jiàn)圖2。

圖2 Hsa_circ_0046701高、低表達(dá)組術(shù)后生存率比較Fig 2 Comparison of postoperative survival rates between the high hsa_cir c_0046701 expr ession group and the low hsa_circ_0046701 expression group

采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行患者預(yù)后的單因素和多因素分析，結(jié)果顯示：hsa_circ_0046701表達(dá)水平、高WHO分級(jí)、KPS評(píng)分、術(shù)后復(fù)發(fā)是影響膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。見(jiàn)表2。

表2 膠質(zhì)瘤患者不同臨床病理特征和hsa_circ_0046701表達(dá)的單因素和多因素分析表Tab 2 Univariate and multivariate analysis of different clinicopathological features and hsa_circ_0046701 expression in patients with glioma

3 討論

膠質(zhì)細(xì)胞瘤的生長(zhǎng)特點(diǎn)為浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，與正常腦組織無(wú)明顯界限，多數(shù)不限于一個(gè)腦葉，向腦組織外呈指狀深入破壞腦組織，惡性者瘤體生長(zhǎng)快，病程短，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，放療、化療、手術(shù)等療效有限，預(yù)后復(fù)發(fā)率高、死亡率高［7］。目前，臨床對(duì)于膠質(zhì)瘤的診斷治療及對(duì)預(yù)后的預(yù)判方面仍然缺少合適的生物標(biāo)志物。因此，尋找與膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)的特異性生物標(biāo)志物具有重要的臨床意義［8］。

環(huán)狀RNA是近年來(lái)的新興分子，最先在RNA病毒中被發(fā)現(xiàn)，在1970年，真核生物核細(xì)胞質(zhì)中也證明了circRNA的存在。最初認(rèn)為其是因錯(cuò)誤連接而形成的低豐度分子，但隨著生命科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，越來(lái)越多的circRNA的功能不斷凸現(xiàn)出來(lái)［9］。目前，已發(fā)現(xiàn)circRNA可以內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)性抑制miRNA結(jié)合，調(diào)控親代基因表達(dá)，調(diào)控RNA結(jié)合蛋白等的作用，circRNA的差異表達(dá)也與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，尤其在腫瘤方面［10-13］。由于circRNA不易被核酸酶降解，具有保守性高，為其作為疾病診療及預(yù)后的特異標(biāo)記物奠定了基礎(chǔ)。例如：肝細(xì)胞肝癌中，hsa_circ_0004018明顯下調(diào)，其表達(dá)水平與腫瘤大小、分化程度、WHO分級(jí)的相關(guān)性有統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義［14，15］；hsa_circ_0047905，hsa_circ_0138960，hsa_circRNA 769015的上調(diào)與胃癌細(xì)胞增殖和侵襲高度相關(guān)，抑制這3種circRNA的表達(dá)可明顯緩解胃癌的進(jìn)展［16］。有研究發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0046701在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制miR-142-3p結(jié)合蛋白促進(jìn)膠質(zhì)瘤的進(jìn)展［6］。但hsa_circ_0046701在臨床的診療和預(yù)后方面的研究尚未有報(bào)道，本研究旨在通過(guò)檢測(cè)hsa_circ_0046701在膠質(zhì)瘤組織及正常組織中的表達(dá)水平來(lái)分析其對(duì)患者預(yù)后的影響。

本研究采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)hsa_circ_0046701在膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織中的表達(dá)量，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示，與正常腦組織相比，膠質(zhì)瘤中hsa_circ_0046701的表達(dá)水平明顯升高，且與腫瘤惡性程度有關(guān)。筆者進(jìn)一步研究了膠質(zhì)瘤患者h(yuǎn)sa_circ_0046701表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系，研究結(jié)果顯示：hsa_circ_0046701的高表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤大小、數(shù)目、部位等均無(wú)關(guān)，而與WHO分級(jí)、KPS評(píng)分及患者術(shù)后復(fù)發(fā)有關(guān)。這提示hsa_circ_0046701的表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤的侵襲性、增殖能力有關(guān)，通過(guò)抑制其表達(dá)可延緩腫瘤發(fā)展。最后，通過(guò)分析Hsa_circ_0046701表達(dá)量與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)與hsa_circ_0046701低表達(dá)組相比，高表達(dá)組5年生存率較低，同時(shí)還證實(shí)了hsa_circ_0046701表達(dá)水平、WHO分級(jí)、KPS評(píng)分＜80分，術(shù)后復(fù)發(fā)是影響膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素，可將其作為臨床預(yù)后的指標(biāo)，為早期膠質(zhì)瘤診斷和干預(yù)提供參考依據(jù)。

綜上所述，hsa_circ_0046701表達(dá)水平在膠質(zhì)瘤進(jìn)展中有十分重要的作用，與患者預(yù)后情況有關(guān)，可作為一個(gè)潛在候選因子進(jìn)行進(jìn)一步研究。后續(xù)研究可對(duì)hsa_circ_0046701的分子生物學(xué)功能進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)，明確其機(jī)制，為膠質(zhì)瘤的早期診斷、治療及預(yù)后評(píng)估提供新的證據(jù)。

作者貢獻(xiàn)度說(shuō)明：

張欽：設(shè)計(jì)研究思路，指導(dǎo)收集資料和數(shù)據(jù)分析，撰寫論文；田博：收集資料和數(shù)據(jù)分析；李張珂：設(shè)計(jì)研究思路，指導(dǎo)收集資料和數(shù)據(jù)分析，對(duì)文章進(jìn)行審閱和修改。