Th1/Th2平衡對寒凝血瘀證原發(fā)性痛經(jīng)大鼠血清PG、COX?2、AVP及OT的影響

翟鳳婷，王東梅，馬 青，曹衛(wèi)平，王丹丹，李廣文

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟南 2 50014；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟南 2 50355）

原發(fā)性痛經(jīng)（primary dysmenorrhea，PD）是指伴隨月經(jīng)發(fā)生的周期性下腹疼痛而無生殖器官器質(zhì)性病變的疾病，嚴重者可導(dǎo)致暈厥等癥狀，是最常見的婦科疼痛性疾病。反復(fù)發(fā)作的經(jīng)期疼痛可導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)敏感化，增加遠期其他慢性疼痛性疾病的易感性，并使患者喪失信心，容易引發(fā)焦慮、煩躁、抑郁等負面情緒。長期嚴重的PD，可導(dǎo)致經(jīng)血逆流，增加子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生率，進而導(dǎo)致不孕癥的發(fā)生［1，2］。據(jù)統(tǒng)計，不同國家原發(fā)性痛經(jīng)的患病率在45%～90%之間［3-5］，國內(nèi)PD的發(fā)生率在40%～80%之間［6］。在美國，因PD造成的經(jīng)濟損失每年高達20億美元［7，8］，在瑞典，50%的女性會因痛經(jīng)每年缺勤至少1次，造成23萬個工作日損失［9，10］。由此可見，PD給全球帶來了巨大的經(jīng)濟損失。目前治療PD的一線藥物為非甾體類抗炎藥，其主要作用為即時止痛，缺乏遠期療效，究其原因與PD的發(fā)病機制未完全明確有關(guān)。因此，探討PD的發(fā)病機制具有重要意義。目前研究已證實，PD患者存在免疫功能異常。筆者前期研究亦證實，寒凝血瘀證PD大鼠模型中存在Th1/Th2平衡偏移現(xiàn)象［11，12］，本研究基于內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng)之間的關(guān)系，探討Th1/Th2失衡在寒凝血瘀證PD發(fā)病中的作用，進一步揭示PD的發(fā)病機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及飼養(yǎng)條件

成熟雌性Wistar大鼠32只，未交配，體重200～220 g，7～8周齡，購于濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，動物合格證號：SCXK（魯）20190003。實驗大鼠飼養(yǎng)于山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實驗室動物中心，室溫23℃～25℃，相對濕度50%～60%，日光燈光照，明暗各12 h交替，自由攝食、飲水。實驗方案已通過山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院動物倫理委員會審核（倫理批件號：AWE-2019-011）。

1.2 實驗藥物

苯甲酸雌二醇注射液（寧波第二激素廠生產(chǎn)，規(guī)格：2 mL∶4 mg，批號：181214）；縮宮素注射液（馬鞍山豐原制藥有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：1 mL∶5 IU/支，批號：180912-1）；細胞因子Rat IL-4（PeproTech，規(guī)格：20μg/包，批號：0310111）；細胞因子Rat IFN-γ（PeproTech，規(guī)格：20μg/包，批號：0316109）。

1.3 主要試劑及儀器設(shè)備

大鼠脾臟淋巴細胞分離液試劑盒（Biolegend，200 mL/kit）、Cell Activation Cocktail（with Brefeldin A）（Biolegend，100μL）、APC anti-rat CD4 Antibody（Biolegend，50μg 250μL）、FITC anti-rat IFN-gamma Antibody（Biolegend，100 tests 500μL 5μL/test）、PE anti-rat IL-4 Antibody（Biolegend，25μg 125μL）、Intracellular Fixation Buffer（Invitrogen，125 mL）、Permeabilization Buffer 10X（Invitrogen，100 mL），大鼠血清前列腺素F2α（prostaglandin F2α，PGF2α）、前 列 腺 素E2（prostaglandin E2，PGE2）、6-酮-前 列 腺 素F1α（6-Keto-Prostaglandin F1α，6-Keto-PGF1α）、血 栓 素B2（thromboxane B2，TXB2）、環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）、血管加壓素（arginine vasopressin，AVP）及縮宮素（oxytocin，OT）ELISA試劑盒（江蘇晶美生物科技有限公司，96T）。流式細胞儀（美國Beckman coulter公司，Epics XL型），酶標儀（芬蘭Labsystems Multiskan MS公司，352型）。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組方法 所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按隨機數(shù)字表法隨機分為空白對照組、模型對照組、Th1偏移組和Th2偏移組，每組各8只，分別用苦味酸標記。

1.4.2 各組大鼠模型建立方法及造模成功指標

寒凝血瘀證PD大鼠模型：采用寒冷刺激聯(lián)合苯甲酸雌二醇以及縮宮素建立。除空白組外，其余各組大鼠每日固定時間置于冰塊上20 min，1次/d，連續(xù)12 d，同時，每天給予大鼠皮下注射苯甲酸雌二醇注射液0.4 mg/只，第1天和第12天各0.8 mg/只，末次注射苯甲酸雌二醇1 h后腹腔注射縮宮素2 IU/只。

Th1偏移組：自寒凝血瘀證PD大鼠造模第7天起，腹腔注射Rat IFN-γ（2μg/mL），1 mL/次，1次/d，連續(xù)6 d；空白組及模型組大鼠同時間腹腔注射生理鹽水，1 mL/次，每日1次，連續(xù)6 d。

Th2偏移組：自寒凝血瘀證PD大鼠造模第7天起，腹腔注射Rat IL-4（200 ng/mL），1 mL/次，1次/d，連續(xù)6 d。

1.4.3 指標檢測 注射縮宮素后，觀察各組大鼠扭體反應(yīng)潛伏時間及30 min內(nèi)扭體次數(shù)。末次給藥1 h后，腹腔注射10%水合氯醛0.3 mL/100 g麻醉，腹主動脈取血，注入促凝管顛倒混勻，靜置30 min后分離血清。肉眼觀察大鼠脾臟，摘取大鼠脾臟組織。流式細胞術(shù)法檢測各組大鼠脾臟Th1細胞、Th2細胞比例，ELISA法檢測各組大鼠血清中PGF2α、PGE2、6-Keto-PGF1α、TXB2、COX-2、AVP及OT含量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，統(tǒng)計資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，當數(shù)據(jù)滿足正態(tài)性和方差齊性時，組間比較采用單因素方差分析，否則，組間比較采用秩和檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠脾臟Th1/Th2細胞比值

圖 中P4（APC anti-rat CD4、FITC anti-rat IFN-γ抗體標記）為Th1細胞，P3（APC anti-rat CD4、PE anti-rat IL-4抗體標記）為Th2細胞。Th1細胞所占比例與Th2細胞所占比例做比值比較，由高到低分別為空白組、Th1偏移組、模型組、Th2偏移組。與空白組比較，各組大鼠Th1/Th2細胞比值降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，Th1偏移組Th1/Th2細胞比值升高，Th2偏移組Th1/Th2細胞比值降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。證實造模成功。見圖1及表1。

表1 各組大鼠脾臟Th1/Th2細胞比值（n=8，±s）Tab 1 The ratio of Th1/Th2 cells in spleen of rats in each group（n=8，±s）

表1 各組大鼠脾臟Th1/Th2細胞比值（n=8，±s）Tab 1 The ratio of Th1/Th2 cells in spleen of rats in each group（n=8，±s）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與Th1偏移組比較，&&P＜0.01。

組別空白組模型組Th1偏移組Th2偏移組Th1/Th2細胞比值2.63±0.08 0.60±0.12**1.92±0.29**##0.30±0.08**##&&

圖1 各組大鼠脾臟Th1/Th2細胞比值Fig 1 The ratio of Th1/Th2 cells in spleen of r ats in each gr oup

2.2 各組扭體潛伏時間及扭體次數(shù)比較

Th1、Th2偏移組扭體潛伏時間與模型組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；Th2偏移組較Th1偏移組扭體潛伏時間縮短，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

與模型組比較，Th1偏移組30 min內(nèi)扭體次數(shù)明顯減少，而Th2偏移組30 min內(nèi)扭體次數(shù)明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠扭體潛伏時間及扭體次數(shù)比較（n=8，±s）Tab 2 Comparison of writhing latency and writhing times of rats in each group（n=8，±s）

表2 各組大鼠扭體潛伏時間及扭體次數(shù)比較（n=8，±s）Tab 2 Comparison of writhing latency and writhing times of rats in each group（n=8，±s）

注：與模型組比較，**P＜0.01；與Th1偏移組比較，##P＜0.01。

組別模型組Th1偏移組Th2偏移組扭體潛伏時間（min）4.76±0.50 5.18±0.72 4.41±0.41扭體次數(shù)18.75±1.49 14.25±1.28**22.63±1.77**##

2.3 各組PGF 2α、PGE 2、6-Keto-PGF 1α、TXB2含量比較

與空白組比較，各組PGF2α、TXB2含量均升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，Th1偏移組PGF2α、TXB2含量均降低，而Th2偏移組PGF2α、TXB2含量均升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與Th1偏 移 組 比 較，Th2偏 移 組PGF2α、TXB2含量均升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

與空白組比較，各組PGE2、6-Keto-PGF1α含量均降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，Th1偏移組PGE2、6-Keto-PGF1α含量升高，而Th2偏移組PGE2、6-Keto-PGF1α含量降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與Th1偏移組比較，Th2偏移組PGE2、6-Keto-PGF1α含量降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表3。

表3 各組大鼠PGF2α、PGE2、6?Keto?PGF1α、TXB2含量比較（n=8，±s）Tab 3 Comparison of the contents of PGF 2α、PGE2、6?Keto?PGF1αand TXB2 of rats in each group（n=8，±s）

表3 各組大鼠PGF2α、PGE2、6?Keto?PGF1α、TXB2含量比較（n=8，±s）Tab 3 Comparison of the contents of PGF 2α、PGE2、6?Keto?PGF1αand TXB2 of rats in each group（n=8，±s）

注：與空白組比較,**P＜0.01；與模型組比較,#P＜0.05，##P＜0.01；與Th1偏移組比較,&&P＜0.01。

組別空白組模型組Th1偏移組Th2偏移組PGF 2α(ng/L)223.72±8.44 267.21±17.01**253.27±11.40**#349.20±3.05**##&&PGE2(ng/L)559.69±16.77 464.71±19.16**496.20±18.11**##324.20±12.64**##&&6-Keto-PGF 1α(ng/mL)112.20±2.28 83.51±5.05**95.99±3.48**##73.28±2.67**##&&TXB2(ng/L)316.99±12.45 390.00±10.90**376.96±4.98**#476.89±8.05**##&&

2.4 各組COX-2、AVP、OT含量比較

與空白組比較，各組COX-2、AVP、OT含量均升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，Th1偏移組COX-2、AVP含量降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；OT含量亦降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.056）。與模型組比較，Th2偏移組含量均升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與Th1偏移組比較，Th2偏移組各指標含量均升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表4。

表4 各組大鼠COX?2、AVP、OT含量比較（ng/L，n=8，±s）Tab 4 Comparison of the contents of COX?2、AVP and OT of rats in each group（ng/L，n=8，±s）

表4 各組大鼠COX?2、AVP、OT含量比較（ng/L，n=8，±s）Tab 4 Comparison of the contents of COX?2、AVP and OT of rats in each group（ng/L，n=8，±s）

組別空白組模型組Th1偏移組Th2偏移組COX-2 76.14±2.87 93.89±3.92**88.46±7.03**#106.35±7.01**##&&AVP 57.77±5.04 86.55±3.99**77.42±8.45**##97.62±3.39**##&&OT 32.67±0.29 38.27±2.24**36.22±1.79*47.39±2.83**##&&

3 討論

PD是婦科常見病。中醫(yī)學(xué)認為，PD的發(fā)生主要在于邪氣內(nèi)伏或精血素虧，更值經(jīng)期前后沖任二脈氣血的生理變化急驟，導(dǎo)致胞宮的氣血運行不暢，“不通則痛”；或沖任、胞宮失于濡養(yǎng)，“不榮則痛”。臨床常見證型有：氣滯血瘀證、寒凝血瘀證、濕熱蘊結(jié)證、腎氣虧損證及氣血虛弱證。現(xiàn)代流行病學(xué)調(diào)查研究顯示，寒凝血瘀證在PD的中醫(yī)證型分布中所占比例最高［13］。基于數(shù)據(jù)挖掘分析王東梅教授治療PD的中藥配伍規(guī)律，結(jié)果表明治療藥物以甘溫、辛溫為主，常用方劑組合以少腹逐瘀湯為主，主要發(fā)揮溫經(jīng)散寒、活血止痛之功，進一步驗證了寒凝血瘀證在PD中所占比例最高［14］?！吨T病源候論》云：“婦人月水來腹痛者，由勞傷氣血，以致體虛，受風(fēng)冷之氣客于胞絡(luò)，損沖、任之脈……其經(jīng)血虛，受風(fēng)冷，故月水將來之際，血氣動于風(fēng)冷，風(fēng)冷與血氣相擊，故令痛也”的論述，提出痛經(jīng)的產(chǎn)生是由寒凝胞宮而致。寒凝血瘀證中，寒凝為本，血瘀為標?；颊呔镁雍疀鲋兀蜇潧鲲嬂?，經(jīng)期不注重保暖，寒克于胞宮、沖任，經(jīng)血凝結(jié)，且經(jīng)前、經(jīng)期氣血下注沖任，子宮氣血更加壅滯，導(dǎo)致“不通則痛”；或患者身體素虛，陰寒內(nèi)生，沖任二脈及胞宮失于溫煦，難以鼓動血脈運行，血滯而成瘀，進而發(fā)展為痛經(jīng)［15］。由此可見，寒凝血瘀導(dǎo)致的“不通則痛”是PD的主要病機。

西醫(yī)學(xué)關(guān)于PD的發(fā)病機制存在多種學(xué)說，但目前公認PD的發(fā)生主要與子宮內(nèi)膜前列腺素有關(guān)。其中，PGF2α含量升高引起子宮痙攣性收縮，局部缺血缺氧而出現(xiàn)痛經(jīng)，而PGE2能夠抑制子宮平滑肌的自發(fā)收縮。筆者前期研究亦證實，PD大鼠模型PGF2α/PGE2比值升高［16］。另外，非妊娠子宮肌層還能夠合成具有血管活性的前列腺素，包括血栓 素A 2（thromboxane A 2，TXA2）和PGI2。其 中TXA2能夠收縮血管、促進血小板聚集，而PGI2能夠抗血小板聚集、舒張血管。但TXA 2及PGI2在體內(nèi)很不穩(wěn)定，因此目前實驗多測定其相對穩(wěn)定的代謝產(chǎn)物TXB2和6-Keto-PGF1α含量來反映二者的代謝情況［17］。COX-2是一種催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為PGs的關(guān)鍵酶，可以導(dǎo)致子宮痙攣性收縮，從而引發(fā)PD［18］。AVP作為加重PD相關(guān)因子，一方面能夠通過作用于子宮上的相應(yīng)的受體，使子宮收縮加劇及肌肉運動，導(dǎo)致子宮血量減少，引起PD；另一方面，AVP亦能夠促進PGs合成，并增加子宮對縮宮藥物的敏感度，引起PD［19］。OT又名“催產(chǎn)素”，主要作用于子宮的平滑肌，使其興奮，致使子宮收縮加速，激活磷酸，調(diào)節(jié)某一部分細胞的PGs含量，從而加重PD［20］。本研究結(jié)果顯示，寒凝血瘀證PD大鼠模型PGF2α及TXB2含量均升高，6-Keto-PGF1α及PGE2含量降低，且寒凝血瘀證PD大鼠模型存在COX-2、AVP及OT含量的升高。

除上述內(nèi)分泌因素外，目前已有研究證實，PD患者存在免疫功能異常，內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)失調(diào)是PD的發(fā)病原因之一［13］。在Th細胞中，Th1細胞及Th2細胞是最為經(jīng)典的兩個亞群。Th1細胞主要分泌IL-2、γ-干擾素（interferon-gamma，IFN-γ）等細胞因子，介導(dǎo)細胞毒素和炎癥反應(yīng)；Th2細胞主要分泌IL-4、IL-10等調(diào)節(jié)性細胞因子，參與體液免疫應(yīng)答及誘導(dǎo)免疫耐受。Th1細胞分泌的IFN-γ可促進Th1亞群的分化，但卻抑制Th2亞群的增殖。反之，Th2細胞分泌的IL-4可促進Th2亞群的分化，但卻抑制Th1細胞的活化。生理狀態(tài)下，Th1和Th2細胞處于動態(tài)平衡，維持機體正常的免疫功能；當機體受到異己抗原攻擊或機體內(nèi)部免疫平衡發(fā)生異常時，可導(dǎo)致Th1/Th2平衡失調(diào)，表現(xiàn)為Th2過度表達，Th1/Th2平衡向Th2偏移。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)寒凝血瘀證PD模型大鼠較正常大鼠子宮組織上清液中IFN-γ水平明顯降低，而IL-4水平顯著升高，證實寒凝血瘀證PD大鼠存在Th1/Th2平衡失調(diào)［12，13］。

本研究結(jié)果表明，與模型組比較，Th1偏移組PD大鼠PGF2α、TXB2、COX-2及AVP含量均降低，OT差異雖無統(tǒng)計學(xué)意義，但其含量亦成下降趨勢，不排除與造模時腹腔注射縮宮素有關(guān)，6-Keto-PGF1α、PGE2含量升高；而Th2偏移組PD大鼠PGF2α、TXB2、COX-2、AVP及OT含量均升高，6-Keto-PGF1α、PGE2含 量 降 低。說 明Th1細 胞、Th2細 胞 能 夠 調(diào) 節(jié)PGF2α/PGE2、TXB2/6-Keto-PGF1α比值及COX-2、AVP、OT含量。進一步證實了Th1/Th2平衡偏移在寒凝血瘀證PD發(fā)病中的作用。

作者貢獻度說明：

翟鳳婷：動物實驗的操作及數(shù)據(jù)分析，文章的寫作；王東梅：項目（山東省自然科學(xué)基金）負責(zé)人，負責(zé)整個科研項目的設(shè)計，對文章進行審校；馬青、王丹丹：參與實驗實施；曹衛(wèi)平：參與數(shù)據(jù)整理與分析；李廣文：進行理論指導(dǎo)。