卵巢型子宮內(nèi)膜異位癥患者血清及內(nèi)膜中IKBa的表達(dá)及其臨床意義

白 雪，馬少寒，靳 雁，蘇育欣 ,祖逸崢，哈春芳

子宮內(nèi)膜異位癥(EMs)簡(jiǎn)稱(chēng)內(nèi)異癥，指具有活性的子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)出現(xiàn)在宮腔以外的具有雌激素依賴(lài)性的婦科常見(jiàn)病。主要臨床表現(xiàn)有慢性盆腔痛、痛經(jīng)、月經(jīng)異常、不孕、性交不適等[1]。異位內(nèi)膜組織可侵犯到全身任何部位，最常見(jiàn)的侵犯部位是卵巢和宮骶韌帶。內(nèi)異癥是良性疾病，但具有種植、轉(zhuǎn)移及侵襲等類(lèi)似惡性腫瘤的復(fù)雜性疾病[2]。其具體機(jī)制仍未完全闡明。現(xiàn)在以1927年Sampson提出的經(jīng)血逆流學(xué)說(shuō)廣為學(xué)者們接受。而許多學(xué)者們證明，70%～90%的育齡期婦女可發(fā)生經(jīng)血逆流，但僅有10%～20%的育齡期婦女發(fā)生內(nèi)異癥，故此學(xué)說(shuō)無(wú)法解釋出現(xiàn)在盆腔以外的內(nèi)異癥[3]。核轉(zhuǎn)錄因子NF-kB是一種重要的生物因子，在靜止?fàn)顟B(tài)下，其與抑制蛋白結(jié)合在細(xì)胞質(zhì)中不能發(fā)揮作用，當(dāng)受到刺激后NF-kB與IkB解離后進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)控編碼基因的表達(dá)。NF-kB 包括NF-kB 抑制蛋白 (IkB)、NF-kB 家族及 IkB 激酶 (IKK)。其中IKBa是IkB蛋白家族中最重要的成員之一。周敏等學(xué)者已證實(shí)miR-196a在內(nèi)異癥內(nèi)膜組織中呈高表達(dá)[4]。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，IKBa作為miR-196a直接靶基因，在大腸癌、胰腺癌等多種腫瘤中呈高表達(dá)，且促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和遷移，而具有惡性腫瘤特征的內(nèi)異癥[5]，那么作為miR-196a下游靶基因之一的IKBa是否在內(nèi)異癥患者血清、組織中表達(dá)以及與臨床相關(guān)影響因素間的臨床意義值得探討。

本實(shí)驗(yàn)采用ELISA及免疫組化法檢測(cè)IKBa在卵巢型內(nèi)異癥患者血清、在位內(nèi)膜組織及異位內(nèi)膜組織中的表達(dá)情況及其差異性，進(jìn)一步分析IKBa與其臨床分期、疼痛評(píng)分、卵巢囊腫直徑等臨床相關(guān)影響因素的臨床意義，并由此推測(cè)IKBa在EMs發(fā)生發(fā)展中的作用，旨在為術(shù)前評(píng)估提供診斷依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料:選取2019年11月-2021年2月因卵巢型內(nèi)異癥于寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院行手術(shù)治療的患者56例作為研究組(異位內(nèi)膜組織56份、在位內(nèi)膜組織35份、血清31份)，平均年齡為(35.39±7.70)歲。全部病例均經(jīng)組織病理學(xué)明確診斷，且術(shù)前3個(gè)月未行任何激素治療。選擇同期因其他婦科良性疾病于我院行手術(shù)治療患者的正常子宮內(nèi)膜30例作為對(duì)照組(內(nèi)膜組織30份、血清25份)。該實(shí)驗(yàn)已獲得寧夏醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)與授權(quán)，實(shí)驗(yàn)參與者均已簽署知情同意書(shū)。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn):臨床癥狀為痛經(jīng)、慢性盆腔痛、性交困難、月經(jīng)失調(diào)和繼發(fā)性不孕。體征為單側(cè)或雙側(cè)卵巢可觸及大小不等、邊界不清、活動(dòng)欠佳、壓痛陽(yáng)性的囊性包塊。輔助檢查：超聲檢查單側(cè)或雙側(cè)卵巢可見(jiàn)囊性占位，邊界不清，透聲差等影像學(xué)表現(xiàn)；腹腔鏡探查發(fā)現(xiàn)典型的卵巢型內(nèi)異癥，且經(jīng)組織病理學(xué)證實(shí)為子宮內(nèi)膜異位癥；無(wú)內(nèi)科重大疾病、惡性腫瘤及其他婦科器質(zhì)性疾??；術(shù)前3月無(wú)任何激素治療史。

排除標(biāo)準(zhǔn)：排除腹腔鏡證實(shí)為腹膜型和其他部位的內(nèi)異癥；3個(gè)月接受過(guò)激素藥物治療；患有子宮內(nèi)膜息肉、子宮內(nèi)膜非典型性增生、生殖道炎癥及其他婦科器質(zhì)性疾病。

1.3 主要試劑：ELISA法主要試劑，人核因子kB抑制蛋白(IKBa)酶聯(lián)免疫試劑盒購(gòu)自上海信裕生物科技有限公司。免疫組化法主要試劑：兔二步法檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京諾博萊德科技有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法：ELISA法：將試劑盒從冷藏室移至室溫等待平穩(wěn)15～30 min，將血液標(biāo)本從-80 ℃冷凍冰箱取出自然解凍；按說(shuō)明將4 800 pg/ml標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為濃度為2 400 pg/mL、1 200 pg/mL、600 pg/mL、300 pg/mL及150 pg/mL(稀釋5倍)；將酶標(biāo)板設(shè)置一個(gè)不加任何試劑的空白對(duì)照孔，再分別設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔各三個(gè)孔，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)孔加入50 μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)樣本孔中先加入40 μL樣品稀釋液，后加入10 μL待測(cè)樣品；于37 ℃溫箱里溫育30 min；蒸餾水按比例將濃縮洗滌液稀釋?zhuān)蝗シ獍迥?、棄去孔?nèi)液體，加滿洗滌液30秒后再次棄去孔內(nèi)液體，重復(fù)5次；除空白孔外的每孔加入50 μL酶標(biāo)試；再次溫育、洗滌，后每孔中先加入50 μL顯色劑A、再加50 μL顯色劑B后避光顯色；每孔加入50 μL終止液，最后在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)每孔的吸光度(OD值)。

免疫組化法：將儲(chǔ)存在零下-80 ℃冷凍冰箱的組織取出，切取體積約1 cm3的組織塊3塊，將其固定在10%的甲醛溶液中24 h，然后取出制成石蠟標(biāo)本塊，將石蠟塊切成厚度約為3 μm的切片；用二甲苯脫蠟后遞減酒精脫去二甲苯并水化；微波抗原修復(fù)后加入適量?jī)?nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑來(lái)消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；加入適量的3%牛血清白蛋白封閉液在室溫孵育40 min后再加入適當(dāng)比例稀釋的一抗(稀釋濃度為1∶150)，溫箱孵育3 h后至室溫放置1 h加入適量的增強(qiáng)酶標(biāo)山羊抗兔IgG聚合物；DAB顯色液顯色；蘇木素染液復(fù)染；濃度上升梯度乙醇脫水；凝膠封片；顯微鏡下觀察3～8 min。

1.5 結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)：用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式，將樣品的OD值帶入方程式算出IKBa濃度，再乘以稀釋倍數(shù)(×5倍)，單位換算后計(jì)算出的濃度為最終實(shí)際濃度。免疫組化陽(yáng)性結(jié)果以細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核膜出現(xiàn)棕黃色或黃色顆粒表示陽(yáng)性著色。陽(yáng)性著色細(xì)胞一般符合下列要求：①陽(yáng)性著色顆粒定位較好；②鏡下可以觀察到清晰的子宮內(nèi)膜組織的內(nèi)膜和腺體結(jié)構(gòu)；③背景顏色清晰、無(wú)污染，且染色部位強(qiáng)于背景色，須由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的專(zhuān)業(yè)人員獨(dú)立閱片。每個(gè)切片在400倍高倍鏡下隨機(jī)取3個(gè)視野，然后用圖像分析軟件系統(tǒng)分析并測(cè)定陽(yáng)性細(xì)胞的平均灰度值。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者血清中IKBa的水平比較：酶聯(lián)免疫法檢測(cè)卵巢型內(nèi)異癥患者血清中IKBa的表達(dá)水平明顯高于非內(nèi)異癥患者血清中IKBa的表達(dá)水平(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 卵巢型內(nèi)異癥患者和非內(nèi)異癥患者血清中IKBa的水平比較

2.2 兩組患者在位、異位內(nèi)膜及正常子宮內(nèi)膜組織中IKBa蛋白表達(dá)情況：免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，IKBa在卵巢型子宮內(nèi)膜異位癥在位、異位內(nèi)膜及正常子宮內(nèi)膜組織中均有不同程度的表達(dá)，且大部分均表達(dá)于子宮內(nèi)膜組織腺上皮細(xì)胞的胞質(zhì)，異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜組織還部分表達(dá)于間質(zhì)(見(jiàn)圖1-圖3，封三)。且IKBa在卵巢型子宮內(nèi)膜在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜組織中的表達(dá)明顯高于正常子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)(P<0.05),見(jiàn)表2。

表2 卵巢型內(nèi)異癥患者在位、異位內(nèi)膜及正常子宮內(nèi)膜組織中IKBa的表達(dá)比較

2.3 卵巢型內(nèi)異癥患者血清中IKBa表達(dá)的特點(diǎn)：卵巢型內(nèi)異癥患者血清中IKBa的表達(dá)在臨床分期、病灶分布、有無(wú)盆腔浸潤(rùn)、浸潤(rùn)深度、有無(wú)痛經(jīng)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而在異位囊腫直徑大小≤5 cm和囊腫直徑大小>5 cm組間差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，若增大樣本量，異位囊腫直徑大小≤5 cm和異位囊腫直徑大小>5 cm間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的可能性較大，見(jiàn)表3。

表3 卵巢型內(nèi)異癥患者血清中IKBa表達(dá)的臨床特點(diǎn)

2.4 卵巢型內(nèi)異癥患者異位內(nèi)膜組織中IKBa表達(dá)的臨床相關(guān)因素分析：在卵巢型子宮內(nèi)膜異位癥患者異位內(nèi)膜組織中IKBa的表達(dá)與臨床分期、有無(wú)痛經(jīng)、疼痛評(píng)分、有無(wú)觸痛結(jié)節(jié)、有無(wú)盆腔浸潤(rùn)、浸潤(rùn)深度、病灶單雙側(cè)分布及患者年齡均無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，但在卵巢異位囊腫直徑≤5 cm與囊腫直徑>5 cm組間及在有無(wú)子宮肌瘤等合并癥組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且在囊腫直徑≤5 cm和囊腫直徑>5 cm的卵巢型內(nèi)異癥囊腫大小中呈正相關(guān)(r=0.293，P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 卵巢型內(nèi)異癥患者異位內(nèi)膜組織中IKBa表達(dá)的臨床相關(guān)因素

3 討論

子宮內(nèi)膜異位癥(EMs)是一種危害育齡期婦女常見(jiàn)的良性疾病，慢性盆腔痛、繼發(fā)并進(jìn)行性痛經(jīng)、性交不適和不孕癥與之密切相關(guān)。具有活性的子宮內(nèi)膜可出現(xiàn)在全身任何部位，最常侵犯的部位是卵巢。EMs是良性疾病，但具有侵襲、增殖和異位種植等類(lèi)似惡性腫瘤的生物學(xué)行為。目前EMs發(fā)病機(jī)制不明，研究顯示遺傳因素、盆腔內(nèi)環(huán)境、免疫炎癥反應(yīng)、激素調(diào)節(jié)和氧化因子等多種因素參與了EMs的疾病機(jī)制形成[6]。目前EMs的診斷金標(biāo)準(zhǔn)仍是腹腔鏡檢查，后是經(jīng)病理組織學(xué)確認(rèn)[7]，但其是一種有創(chuàng)檢查。EMs的無(wú)創(chuàng)診斷有助于疾病的早期發(fā)現(xiàn)和治療，提高生活質(zhì)量并降低疾病相關(guān)費(fèi)用。因此，其被世界子宮內(nèi)膜異位癥學(xué)會(huì)和世界子宮內(nèi)膜異位癥研究基金會(huì)選為優(yōu)先研究項(xiàng)目。影像學(xué)診斷及血清標(biāo)記物(如CA125)對(duì)EMS的特異性及靈敏度有限。因此，研究子宮內(nèi)膜異位癥診斷的無(wú)創(chuàng)，特異性生物標(biāo)記物是目前亟待解決的難題。

細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子KB(NF-kB)是一種廣泛存在于細(xì)胞中的蛋白質(zhì)分子，具有許多生物學(xué)功能，如在炎癥反應(yīng)、細(xì)胞分化、凋亡和增殖過(guò)程中起重要作用，且與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)及細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)。靜息狀態(tài)下，NF-kB與抑制蛋白IKB形成三聚體存在于細(xì)胞基質(zhì)中，當(dāng)受到細(xì)菌、病毒、腫瘤壞死因子等因子刺激時(shí)，三聚體復(fù)合物被激活，開(kāi)始調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而引起相關(guān)疾病的發(fā)生[8]。張名香[9]等通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)卵巢良性上皮腫瘤、卵巢交界性上皮腫瘤和卵巢癌中NFKB蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在卵巢良性上皮性腫瘤、卵巢交界性上皮腫瘤和卵巢癌中NFKB的陽(yáng)性表達(dá)率分別是33.3%、37.5%和65.0%。卵巢癌中NFKB/P65的陽(yáng)性率顯著高于良性卵巢癌，此研究結(jié)果還顯示在卵巢癌組織中，P65核染色陽(yáng)性與腫瘤的分化、是否淋巴轉(zhuǎn)移、臨床期別和腫瘤直徑的大小有著明顯的相關(guān)性。Carlos[10]等通過(guò)RT-PCR、免疫組化、Western Blot及ELISA法檢測(cè)子宮內(nèi)膜異位患者在位內(nèi)膜組織及正常子宮內(nèi)膜組織RELA、IKB激酶(Chuk)、NFKBIA和白介素-6的表達(dá)及NFKB DNA結(jié)合情況，結(jié)果顯示在內(nèi)異癥患者在位內(nèi)膜組織中，NFKB通路中的經(jīng)典激活途徑中的部分蛋白出現(xiàn)異常，降低了它的轉(zhuǎn)錄功能，從而影響NFKBIA和白介素-6的表達(dá)，這兩個(gè)基因與子宮內(nèi)膜異位癥局部促炎和子宮內(nèi)膜增殖過(guò)程相關(guān)。微小RNA(miRNA)是內(nèi)源性的非編碼RNA，在人類(lèi)許多疾病中通過(guò)促進(jìn)mRNA降解或抑制mRNA蛋白翻譯來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)。迄今為止，已鑒定出幾種miRNA在子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機(jī)理中具有重要作用，其中周敏[4]等學(xué)者運(yùn)用miRN微陣列分析法篩選了66個(gè)失調(diào)的miRNA和357個(gè)失調(diào)的mRNA。發(fā)現(xiàn)miR-196a和P-MEK/P-ERK在異位子宮內(nèi)膜組織中均顯著上調(diào)。Zhang等人[11]研究表明，miR-196a在宮頸癌組織、癌前病變CINII-III和細(xì)胞系中顯著上調(diào)。Yang[12]等人研究發(fā)現(xiàn)，miR-196a可能通過(guò)調(diào)控下游靶基因HOXA10來(lái)促進(jìn)上皮源性卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲。作為miR-196a直接靶基因之一的IKBa，在大腸癌、胰腺癌、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等多種腫瘤中呈高表達(dá)，且能夠促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和遷移，而具有惡性腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移特點(diǎn)的子宮內(nèi)膜異位癥，推測(cè)IKBa作為miR-196a下游靶基因可能與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生具有相關(guān)性。

本研究比較了卵巢型子宮內(nèi)膜異位癥患者和非內(nèi)異癥患者血清中IKBa的表達(dá)水平，及卵巢型子宮內(nèi)膜異位癥和非內(nèi)異癥患者在位、異位內(nèi)膜及正常子宮內(nèi)膜組織中IKBa的表達(dá)情況，結(jié)果顯示：IKBa在卵巢型子宮內(nèi)膜異位癥患者血清、在位及異位內(nèi)膜組織中的表達(dá)顯著高于非內(nèi)異癥患者血清及正常子宮內(nèi)膜組織，這提示IKBa的表達(dá)顯著差異性可能與卵巢型內(nèi)異癥的形成有密切關(guān)聯(lián)。在分析臨床相關(guān)影響因素時(shí)發(fā)現(xiàn)，卵巢型子宮內(nèi)膜異位癥患者血清及內(nèi)膜組織中IKBa的表達(dá)與臨床分期、有無(wú)痛經(jīng)、疼痛評(píng)分、有無(wú)觸痛結(jié)節(jié)、有無(wú)盆腔浸潤(rùn)、浸潤(rùn)深度、病灶單雙側(cè)分布及患者年齡均無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)，而在卵巢型內(nèi)異癥異位內(nèi)膜組織中異位囊腫直徑≤5cm與囊腫直徑>5cm組間及在有無(wú)子宮肌瘤等合并癥組間比較有明顯差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，這表明卵巢型子宮內(nèi)膜異位癥患者中卵巢異位囊腫直徑越大的患者IKBa的表達(dá)越高，且大多數(shù)合并子宮肌瘤、子宮腺肌癥等并發(fā)癥。這說(shuō)明IKBa可能與卵巢型子宮內(nèi)膜異位癥的形成和發(fā)展密切關(guān)聯(lián)。本實(shí)驗(yàn)僅從IKBa蛋白水平研究其與卵巢型子宮內(nèi)膜異位癥的關(guān)系，在一定范圍內(nèi)得出了初步結(jié)論。IKBa作為miR-196a下游靶基因在卵巢型內(nèi)異癥有了最初步的結(jié)論，兩者之間的關(guān)系及具體調(diào)控機(jī)制仍未知，后續(xù)可從基因與蛋白兩個(gè)水平，通過(guò)基因檢測(cè)技術(shù)來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證mi-196a與IKBa在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥中的具體調(diào)控機(jī)制，這也將成為本課題組將來(lái)研究的方向。

本研究探討了卵巢型子宮內(nèi)膜異位患者血清中及在位、異位內(nèi)膜組織中IKBa的具體表達(dá)情況及其臨床意義，為以后卵巢型子宮內(nèi)膜異位癥的診斷、術(shù)前評(píng)估及診療方案提供了新思路。IKBa在卵巢型內(nèi)異癥中的具體調(diào)控機(jī)制及能否作為判定卵巢型子宮內(nèi)膜異位癥診斷生物學(xué)指標(biāo)需要進(jìn)一步探討與深入研究。