TLR4基因多態(tài)性及IL-6表達(dá)水平與慢性腎盂腎炎表型特征的相關(guān)性研究

韓 晶,黃鳳麗

小兒腎盂腎炎是最常見的泌尿系統(tǒng)傳染性炎性疾病，具有較高的急性發(fā)病率和長期腎臟損害，在腎臟間質(zhì)參與炎癥過程中，患兒的腎硬化風(fēng)險極高，極易造成腎功能下降及早期殘疾[1-3]。因此，為改善腎盂腎炎患兒的生活質(zhì)量，急需發(fā)現(xiàn)特異性指標(biāo)以實(shí)現(xiàn)腎盂腎炎的早期診治。本研究通過探討Toll樣受體-4(TLR4)基因多態(tài)性與慢性腎盂腎炎表型特征及IL-6表達(dá)的相關(guān)性，以期發(fā)現(xiàn)腎盂腎炎的特異性指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料：收集2018年1月-2019年12月于本院小兒科住院治療的60例加重期慢性腎盂腎炎患兒作為觀察組，同期納入95例健康兒童作為對照組，均進(jìn)行臨床及實(shí)驗(yàn)室檢查。收集2組患兒的一般資料并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.1.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：符合慢性腎盂腎炎相關(guān)性診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，并經(jīng)X線、尿培養(yǎng)、尿常規(guī)及腎功能檢查等確診者；所有患者或其監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書；獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：合并嚴(yán)重心腦血管疾病者；理解或認(rèn)知功能障礙者；肝腎功能嚴(yán)重?fù)p失者；接受相關(guān)免疫藥物治療者；患尿道綜合征者；先天泌尿系畸形者；先天性免疫缺陷者。

1.2 方法

1.2.1 TLR4基因多態(tài)性檢測：采集所有研究對象周圍靜脈血作為研究標(biāo)本，從肘靜脈取樣到帶有EDTA的無菌真空容器中，再與“ Dna-express”試劑一起引入eppendorf。使用寡核苷酸引物通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)(試劑盒購自Thermo公司)進(jìn)行Asp299Gly多態(tài)性部分的遺傳分型。使用Tertsyk進(jìn)行擴(kuò)增。用PCR擴(kuò)增TLR4基因的Asp299Gly多態(tài)性片段(上游：5′-GATTAGCATACTTAGACTACTACCTCCATG-3′；下游：5′-GATCAACTTCTGAAAAAGCATTCCCAC-3′)。25 μl反應(yīng)混合物包含2.5 μl 10×Buf用于擴(kuò)增， 2 mM氯化鎂，dNTP為0.2 mM，2.5個單位的DNA聚合酶標(biāo)簽，20-50 ng基因組DNA， 66 ng Asp299Gly引物。

1.2.2 IL-6表達(dá)水平檢測：研究對象血清中IL-6含量的測定通過酶聯(lián)免疫吸附(ELISA，Thermo公司)試劑盒檢測。使用從肘靜脈到無菌真空容器中取樣的外周靜脈血作為研究材料。治療前和治療結(jié)束時對IL-6濃度進(jìn)行了兩次分析。

1.2.3 常規(guī)指標(biāo)檢測：使用常規(guī)方法對所有研究對象進(jìn)行一般的臨床和實(shí)驗(yàn)室以及生化指標(biāo)檢測。腎小球?yàn)V過率(GFR)=48.4×身高(cm)/血液中肌酐含量(μmol/ L)，并校正了年齡和性別系數(shù)。尿液的細(xì)菌學(xué)研究包括檢測微生物劑及其對抗菌和化學(xué)治療劑的敏感性以及分子生物學(xué)研究[5](聚合酶鏈反應(yīng)檢測沙眼衣原體、解脲支原體、人支原體，研究材料為從尿道上皮刮擦的上皮細(xì)胞)，86.7%的患病兒童在處方抗菌治療之前進(jìn)行過治療。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，使用標(biāo)準(zhǔn)χ2檢查數(shù)據(jù)是否符合Hardy-Weinberg平衡，檢查多形基因座的基因型分布。為了比較研究組之間的等位基因頻率，對自由度等于1的人，使用具有連續(xù)性的Yates校正的Pearson準(zhǔn)則2，對研究組之間的基因型頻率進(jìn)行比較。列聯(lián)表使用Fischer精確檢驗(yàn)。為了比較未連接組中變體的頻率，確定95%置信區(qū)間(CI)，計(jì)算比值比(OR),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TLR4基因多態(tài)性分布情況：在大多數(shù)實(shí)際健康的兒童中(96.8%)，TLR4基因的AA等位基因AA呈正態(tài)分布(基因型為“野生型”)。雜合基因型AG的頻率較低(3.2%)。慢性腎盂腎炎(CP)兒童的雜合子和突變基因型AG和GG的頻率分別為86.7%和11.7%，并顯著高于對照組的參數(shù)(χ2=5.78，OR=4.72，CI=1.2～8.56，P<0.05)。CP患兒中，突變等位基因299Gly的頻率比健康兒童高4.4倍(χ2=5.78，P<0.05)。CP患兒的實(shí)際平均雜合水平為Asp299Gly(АG)，最低數(shù)量(1.6%)是純合子Gly299Gly(GG)。

2.2 TLR4基因多態(tài)性與慢性腎盂腎炎表型特征的相關(guān)性：有TLR4基因多態(tài)性位點(diǎn)的Gly/Gly或Asp/Gly基因型的患病兒童與“野生”基因型攜帶者相比，CP的早期表現(xiàn)風(fēng)險(χ2=15.2,P<0.05)、長期復(fù)發(fā)形成的風(fēng)險、泌尿綜合征(χ2=4.0,P<0.05)和病情不穩(wěn)定性(χ2=8.0,P<0.05)顯著更高。突變基因299Gly攜帶者的平均復(fù)發(fā)頻率為每年(3.8±0.2)次，而“野生基因型”兒童的復(fù)發(fā)次數(shù)較低，每年(1.1±0.2)次。血液中紅細(xì)胞沉降率和帶狀中性粒細(xì)胞降低(分別為1.6倍和2倍)。有白細(xì)胞減少癥(χ2=14.9,P<0.05)和感覺減退癥(χ2=14.7,P<0.05)。具有TLR4基因多態(tài)性基因位點(diǎn)的Gly/Gly或Asp/Gly基因型的兒童中，尿液中的白細(xì)胞數(shù)量超過沒有這些基因多態(tài)性的兒童近30倍，并高于正常水平(P<0.05)。此類患者在CP加重期間還具有更明顯的腎臟和排泄功能損害，尤其是晝間低脂血癥的減少，相對尿密度的降低和腎小球?yàn)V過率下降。299Gly TLR4的存在與解脲支原體和人型支原體之間有相關(guān)性(τ=0.58)。與具有“野生”基因型的兒童相比，TLR4基因多態(tài)性位點(diǎn)的純合子Gly/Gly和雜合子Asp/Gly患者的解脲支原體和人型支原體檢測頻率分別高11.7和5.9倍(P<0.05)。

2.3 TLR4基因多態(tài)性與IL-6表達(dá)相關(guān)性：在CP患兒中，IL-6的初始平均范圍為(2.49±0.11)pg/ml至(33.35±7.7) pg/ml。CP患兒的IL-6平均值為(10.58±2.40) pg/ml，而健康兒童的平均值為(3.43±0.21) pg/ml，超出對照3.1倍以上(P<0.05)。不同TLR4受體基因型變異的患病兒童組中，與TLR4基因等位基因正常分布的患者相比，基因型AG的IL-6，GG TLR4的水平比相同參數(shù)低2.2倍，在緩解期仍然很高(P<0.05)。緩解期患者與TLR4等位基因突變分布(τ=0.74，P<0.05)，疾病頻繁復(fù)發(fā)(τ=0.86，P<0.05)和尿毒癥延長患者(τ=0.76，P<0.05)直接相關(guān)。

3 討論

腎盂腎炎的發(fā)生發(fā)展及進(jìn)程除取決于病原體特征外，還取決于個體特征(如患者的免疫反應(yīng))，這主要受其遺傳因素影響[6-7]，近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，從基因?qū)用骖A(yù)測患者的遺傳為預(yù)后及病理發(fā)展提供了可能。由于TLR4在先天免疫系統(tǒng)防御機(jī)制中的重要作用，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)TLR4基因等位基因的存在會引起泌尿生殖道感染(如衣原體、支原體病、脲原體病、賈德氏菌病、滴蟲)的風(fēng)險增加[8]?；蚨鄳B(tài)性表明，可以從同一基因?qū)崿F(xiàn)同一蛋白質(zhì)的多個結(jié)構(gòu)多樣的拷貝，同時，部分拷貝的變體沒有活性或可能具有相反的功能?？刂朴袡C(jī)體防御反應(yīng)的基因差異可以在引入外源藥物的情況下提供不同的炎癥反應(yīng)過程和特定的免疫反應(yīng)過程特征，因此對慢性腎盂腎炎患兒單核苷酸替代的流行進(jìn)行研究極為關(guān)鍵。

本研究結(jié)果表明，CP患兒TLR4多態(tài)性位點(diǎn)的雜合和純合突變基因型AG和GG的頻率與對照組相比顯著增高。與“野生”基因型攜帶者相比，腎盂腎炎患兒中TLR4基因突變等位基因299Gly的存在與疾病的復(fù)發(fā)、病情不穩(wěn)定、機(jī)體炎癥反應(yīng)的降低顯著相關(guān)，CP急性加重期間尿道綜合征持續(xù)時間延長，腎臟的濃度和排泄功能明顯受損(P<0.05)。在患有慢性腎盂腎炎的患病兒童中，Asp299Gly，Gly299Gly TLR4基因的多態(tài)性與某些微生物有關(guān)。特別是與具有“野生”基因型的兒童相比，TLR4基因多態(tài)性位點(diǎn)的純合子Gly/Gly和雜合子Asp/Gly的患者中解脲支原體和人型支原體的檢出率增高了11.7和5.9倍。

在存在某些遺傳先決條件的情況下，慢性腎盂腎病的患兒長期形成的IL-6反映了炎癥過程的穩(wěn)定活動[9]，通過基因組中TLR4突變等位基因299Gly的存在與水平升高之間的直接相關(guān)性證明病情加重或緩解期患病兒童白細(xì)胞介素6的水平(P<0.05)。同時，在患兒泌尿系統(tǒng)下部檢測到解脲支原體和人型支原體，伴有促炎細(xì)胞因子濃度的升高(P<0.05)。