平地木化學(xué)成分及含量分析

張冠騰 龐策 左亞奇 甄攀

河北北方學(xué)院，張家口，075000，中國(guó)

平地木（Ardisia japonica（Thunb）Blume）為灌木植物，多見(jiàn)于海拔約1 200 米以下的山間林下較蔭濕的地方。平地木的藥用價(jià)值很高［1-3］，具有止咳平喘、清利濕熱、活血化瘀、通經(jīng)止痛［4-6］的功效。據(jù)文獻(xiàn)［7］報(bào)道，平地木中的一些化學(xué)成分對(duì)艾滋病、呼吸道合胞病毒等有很好的治療效果；除此之外，平地木中三萜類皂苷成分能降低一些蛋白的表達(dá)，對(duì)肝細(xì)胞產(chǎn)生一定的影響［8］。

利用層析法對(duì)平地木的乙醇提取物進(jìn)行分離、純制，所得單體化合物用質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）、紅外圖譜（infrared spectroscopy，IR）、核磁共振譜（nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR）等方法解析其分子結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)從平地木中發(fā)現(xiàn)四種化合物，化合物1 為新成分，化合物3 和4 系首次從平地木中發(fā)現(xiàn)。以自制的化合物2 為對(duì)照品，建立了高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）測(cè)定其含量的方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 藥材

平地木：采自湖南省永州市都龐嶺，由河北北方學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院魏會(huì)平教授鑒定為Ardisia japonica（Thunb）Blume。

1.1.2 儀器和試劑

BRUKER AV500-III 核磁共振儀，德國(guó)Bruker 公司（德國(guó)）；BiflexIII-TOF 質(zhì)譜儀，美國(guó)布魯克道爾頓公司（美國(guó)）；FT-IR-650 型傅里葉變換紅外光譜儀，天津港東科技發(fā)展股份有限公司（中國(guó)）；Agilent 1100 高效液相色譜儀，Agilent 公司（美國(guó)）；Agilent 1200 制備型高效液相色譜儀，Agilent 公司（美國(guó)）；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司（中國(guó)）；硅膠GF254 薄層板、柱色譜硅膠（100～200 目），青島海洋化工廠（中 國(guó)）；YMC C18（250 mm×20 mm，5 μm）色譜柱，YMC 公司（日本）；WondaSil C18 Superb 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），上海實(shí)驗(yàn)器材有限公司（中國(guó)）；甲醇、乙酸乙酯、乙醇、二氯甲烷、石油醚，天津津東天正有限公司（中國(guó)）；水為娃哈哈純凈水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 化學(xué)成分分離鑒定

平地木全株5.5 kg，粉碎，用無(wú)水乙醇浸泡24 h，重復(fù)提取2 次，提取液合并，過(guò)濾，濾液旋蒸，得膏狀物610 g。膏狀物繼續(xù)用100～200 目硅膠柱進(jìn)行分離純化，洗脫劑分別為石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯，各洗脫液分別收集，旋蒸，得到黑棕色固體，分別為10.34 g、46.04 g 和42.56 g。

將二氯甲烷洗脫部分用D101 大孔樹(shù)脂進(jìn)一步分離純化，洗脫劑為不同比例的乙醇-水（30%、50%、70%、80%、90%和100%），洗脫液分別收集，旋蒸，得固體物，質(zhì)量分別為0.41 g、3.50 g、7.14 g、9.58 g、5.29 g、8.40 g。

將上述三、四和六部分進(jìn)一步純化，用C18柱色譜分離純化，洗脫劑為不同比例的甲醇-水（50%、70%、80%、90%、100%），用試管每5 mL 收集一管，薄層色譜鑒別，相同成分合并，旋蒸，得多種固體物。

上述得到各部分固體物用甲醇溶解，甲醇-水為流動(dòng)相，用Agilent 1200 制備型高效液相色譜儀純制，得到單體化合物。單體化合物通過(guò)MS、UV、IR、NMR 等譜圖解析其分子結(jié)構(gòu)。

化合物1 制備色譜條件：Agilent 制備型高效液相色譜儀；色譜柱：YMC C18（250 mm×20 mm，5 μm）色譜柱，YMC 公司（日本）；流動(dòng)相：甲醇-水（84∶16），流速：1 mL·min-1；紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；柱溫：20 ℃。

化合物2 制備色譜條件：Agilent 制備型高效液相色譜儀；色譜柱：YMC C18（250 mm×20 mm，5 μm）色譜柱，YMC 公司（日本）；流動(dòng)相：甲醇-水（94∶6），流速：1 mL·min-1；紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；柱溫：20 ℃。

化合物3 制備色譜條件：Agilent 制備型高效液相色譜儀；色譜柱：YMC C18（250 mm×20 mm，5 μm）色譜柱，YMC 公司（日本）；流動(dòng)相：甲醇-水（80∶20），流速：1 mL·min-1；紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；柱溫：20 ℃。

化合物4 制備色譜條件：Agilent 制備型高效液相色譜儀；色譜柱：YMC C18（250 mm×20 mm，5 μm）色譜柱，YMC 公司（日本）；流動(dòng)相：甲醇-水（80∶20），流速：1 mL·min-1；紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；柱溫：20 ℃。

1.2.2 平地木中化合物2 的含量測(cè)定

1.2.2.1 色譜條件 Waters 高效液相色譜儀（美國(guó)Waters e2695）；色譜柱：WondaSil C18Superb（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（75∶25），流速：1 mL·min-1；紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：25 ℃。

1.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 吸取上述得到的化合物2 少量，用甲醇稀釋，配制成有濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)系列，按照1.2.2.1中色譜條件依次測(cè)定，以對(duì)照品的峰面積與質(zhì)量濃度（mg·mL-1）進(jìn)行回歸分析，回歸方程為y=17 009x-318.08（r=0.999 7），線性范圍0.054～ 0.870 mg·mL-1。

1.2.3 方法學(xué)考察

實(shí)驗(yàn)測(cè)得精密度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為0.58%，24 h 內(nèi)穩(wěn)定性的RSD為0.30%，加標(biāo)回收率為102.6%。

1.2.4 含量測(cè)定

將未處理過(guò)的干燥平地木的根、莖、葉分別粉碎，收集各部分的粉末，分別稱量一定量的粉末，加入一定量的石油醚，浸泡一段時(shí)間，進(jìn)行回流提取，每次一小時(shí)，一共提取兩次，收集得到的濾液，過(guò)濾，用甲醇定容至25.00 mL。按照1.2.2.1 中色譜條件依次測(cè)定。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 分子結(jié)構(gòu)解析

化合物1，白色無(wú)定形固體，HR-ESI-MS m/z：331.263 7 ［M-H］-（計(jì)算值為331.497 9，C22H35O2），結(jié)合NMR 推測(cè)其分子式為C22H36O2，不飽和度為5，紫外光譜（ultraviolet and visible spectrum，UV）顯示在254 nm 處有吸收，IR 在1 585、1 520 cm-1有峰存在，證明結(jié)構(gòu)中含有苯環(huán)；在3 409 cm-1有一個(gè)寬峰，證明含有酚羥基；在2 850、2 923 cm-1附近有兩個(gè)峰，證明結(jié)構(gòu)中含有甲基和亞甲基；在1 635 cm-1有一個(gè)峰，證明結(jié)構(gòu)中含有烯烴；在723 cm-1附近有小峰存在，證明結(jié)構(gòu)中含有4 個(gè)以上的直鏈烷烴。

1H NMR（500 MHz，CDCl3）（Tab.1）中顯示了兩個(gè)芳香氫信號(hào)δH6.22（2H，s，4-H，6-H），兩個(gè)烯氫信號(hào)δH5.38（2H，m，10′-H和11′-H），高場(chǎng)區(qū)顯示有兩個(gè)甲基信號(hào)δH2.12（3H，s，2-CH3），0.89（3H，t，J=7.0 Hz，15′-H），根據(jù)化學(xué)位移可以判斷δH2.12 為一個(gè)烯甲基信號(hào)，1.25～1.40 之間有堆集的脂肪氫信號(hào)，提示該化合物可能有不飽和脂肪鏈結(jié)構(gòu)片段。該化合物的13C NMR（Tab.1）顯示四個(gè)芳香碳原子信號(hào)δ 154.46（1-C，3-C），142.03（5-C），107.95（4-C，6-C），107.62（2-C），提示該化合物存在對(duì)稱結(jié)構(gòu)。此外，還有兩個(gè)烯碳信號(hào)δ129.95（10′-C），129.92（11′-C），兩個(gè)甲 基信號(hào)13.98（15-C），7.76（2-CH3）。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)［9］報(bào)道的Ardisinol I 比較接近，經(jīng)核磁數(shù)據(jù)比較，兩個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)差別僅在于側(cè)鏈的不同，該化合物的側(cè)鏈只有一個(gè)雙鍵。在HMBC 譜中，末端甲基信號(hào)和一個(gè)烯氫信號(hào)（11′-H）均和13′-C 有HMBC 遠(yuǎn)程相關(guān)，提示雙鍵處于10′-C 和11′-C。根據(jù)兩個(gè)烯氫的偶合常數(shù)，推斷雙鍵的構(gòu)型為順式構(gòu)型。根據(jù)以上信息，化合物1 的結(jié)構(gòu)式鑒定為2-甲基-5-［10′（順）-十五烯基］-間苯二酚，經(jīng)文獻(xiàn)檢索，確認(rèn)為一未報(bào)道過(guò)的新化合物?；衔? 的1H NMR和13C NMR 數(shù)據(jù)見(jiàn)表1，化合物1 的結(jié)構(gòu)式見(jiàn)Fig.1。

Fig.1 Chemical structure of compound 1

Tab.1 1H NMR and 13C NMR of compound 1

化合物2，白色無(wú)定形固體，HR-ESI-MS m/z：303.232 5 ［M-H］-（計(jì)算值為303.446 1，C20H31O2），結(jié)合NMR 推測(cè)其分子式為C20H32O2?；衔? 的核磁數(shù)據(jù)和化合物1 比較相似，1H NMR（500 MHz，CDCl3）中顯示了兩個(gè)芳香氫信號(hào)δH6.22（2H，s，4-H 和6-H），兩個(gè)烯氫信號(hào)δH5.35（2H，m，8′-H 和9′-H），高場(chǎng)區(qū)顯示有兩個(gè)甲基信號(hào)δH2.09（3H，s，2-CH3），0.89（3H，t，J=7.0 Hz，13′-H），1.28～1.32 之間有堆集的脂肪氫信號(hào)，提示該化合物可能含有不飽和脂肪鏈結(jié)構(gòu)片段。化合物2 的13C NMR 譜僅在δ29.0 附近的個(gè)數(shù)碳原子個(gè)數(shù)和化合物1 有明顯區(qū)別，結(jié)合兩個(gè)化合物的高分辨數(shù)據(jù)和核磁數(shù)據(jù)，化合物2 的不飽和脂肪鏈碳原子個(gè)數(shù)為13，末端甲基信號(hào)和一個(gè)烯氫信號(hào)9′-H 均和11′-C 有HMBC 遠(yuǎn)程相關(guān)，提示雙鍵位于8′-C 和9′-C。綜上所述，化合物2 的1H NMR 和13C NMR 的數(shù)值與文獻(xiàn)［10］報(bào)道的化合物Ⅰ基本一致，因此，化合物2 為2-甲基-5-［8′（順）-十三烯基］-間苯二酚。

苯環(huán)結(jié)構(gòu)的歸屬：1H NMR（500 MHz，CDCl3）：δ6.22（2H，s，4-H，6-H）。13C NMR（500 MHz，CDCl3）：δ 154.57（1-C，3-C），142.06（5-C），108.85（4-C，6-C），107.83（2-C）。

取代基 的歸屬：1H NMR（500 MHz，CDCl3）：δ6.22（2H，s，4-H，6-H），5.35（2H，m，8′-H 和9′-H），2.42（2H，t，J=7.5 Hz，1′-H），2.09（3H，s，2-CH3），2.01（4H，m，7′-H 和10′-H），1.53（2H，m，2′-H），1.28～1.32（16H，m，3′-H～6′-H，11′-H，12′-H），0.89（3H，t，J=7.0 Hz，13′-H），。13C NMR（500 MHz，CDCl3）：δ 130.05（1-C），130.00（5-C），35.62（1′-C），32.06（11′-C），31.2（2′-C），27.30（7′-C），27.02（8′-C），22.43（12′-C），14.07（13′-C），7.88（2-CH3）。

化合物3，白色無(wú)定形固體，HR-ESI-MS m/z：305.248 4 ［M-H］-（計(jì)算值為305.462 0，C20H33O2），結(jié)合NMR 推測(cè)其分子式為C20H34O2?；衔? 的核磁數(shù)據(jù)和化合物1 和2 均比較相似，該化合物的1H NMR（500 MHz，CDCl3）缺失了兩個(gè)烯氫的質(zhì)子信號(hào)，13C NMR 譜缺失了兩個(gè)烯碳信號(hào)，提示該化合物5 位的取代基為飽和脂肪鏈，結(jié)合該化合物的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)和核磁數(shù)據(jù)，脂肪鏈碳原子個(gè)數(shù)為13。綜上所述，化合物3 的1H NMR 和13C NMR 的數(shù)值與文獻(xiàn)［11］報(bào)道的化合物1 基本一致，因此，化合物3 的結(jié)構(gòu)鑒定為2-甲基-5-十三烷基間苯二酚。

苯環(huán)結(jié)構(gòu)的歸屬：1H NMR（500 MHz，CDCl3）：δ6.23（2H，s，4-H，6-H）。13C NMR（500 MHz，CDCl3）：δ 154.66（1-C，3-C），142.23（5-C），108.00（4-C，6-C），108.00（2-C）。

取代基 的歸屬：1H NMR（500 MHz，CDCl3）：2.45（2H，t，J=7.5 Hz，1′-H），2.10（3H，s，2-CH3），1.53（2H，m，2′-H），1.25～1.29（24H，m，3′-H～12′-H），0.89（3H，t，J=7.0 Hz，13′-H）。13C NMR（500 MHz，CDCl3）：δ 35.67（1′-C），32.07（11′-C），31.33（2′-C），22.83（12′-C），14.24（13′-C），7.83（2-CH3）。

化合物4，白色無(wú)定形固體，HR-ESI-MS m/z：333.279 0 ［M-H］-（計(jì)算值為333.513 8，C22H37O2），結(jié)合NMR 推測(cè)其分子式為C22H38O2?；衔? 的核磁數(shù)據(jù)和化合物3 比較一致，該化合物的1H NMR（500 MHz，CDCl3）中未發(fā)現(xiàn)烯氫的質(zhì)子信號(hào)，13C NMR 譜中未發(fā)現(xiàn)烯碳信號(hào)，說(shuō)明該化合物5 位的取代基同樣為飽和脂肪鏈，結(jié)合該化合物的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)和核磁數(shù)據(jù)，脂肪鏈碳原子個(gè)數(shù)為15。綜上所述，化合物4 的1H NMR 和13C NMR 的數(shù)值與文獻(xiàn)［12］報(bào)道的化合物2 基本一致，因此，化合物4 的結(jié)構(gòu)鑒定為2-甲基-5-十五烷基間苯二酚。

苯環(huán)結(jié)構(gòu)的歸屬：1H NMR（500 MHz，CDCl3）：δ6.23（2H，s，4-H，6-H）。13C NMR（500 MHz，CDCl3）：δ 154.66（1-C，3-C），142.23（5-C），108.00（4-C，6-C），108.00（2-C）。

取 代基的歸 屬：1H NMR（500 MHz，CDCl3）：2.45（2H，t，J=7.5 Hz，1′-H），2.10（3H，s，2-CH3），1.55（2H，m，2′-H），1.25～1.29（24H，m，3′-H～14′-H），0.88（3H，t，J=7.0 Hz，15′-H）。13C NMR（500 MHz，CDCl3）：δ 35.67（1′-C），32.08（13′-C），31.32（2′-C），22.84（14′-C），14.25（13′-C），7.83（2-CH3）。

2.2 化合物2 的含量

平地木根、莖、葉中化合物2的含量分別為16.79 mg·g-1、19.39 mg·g-1和24.59 mg·g-1，重復(fù)測(cè)定5 次，RSD分別為0.21%、0.76%和1.7%?；衔? 對(duì)照品色譜圖見(jiàn)Fig.2A，平地木乙醚提取液色譜圖見(jiàn)Fig.2B。

3 討論

利用硅膠、D101 大孔吸附樹(shù)脂和C18 等方法分離，用高效液相色譜儀純化，得到四種單體化合物。分別為2-甲基-5-［10′（順）-十五烯基］ -間苯二酚，2-甲基-5-［8′（順）-十三烯基］-間苯二酚，2-甲基-5-十三烷基間苯二酚，2-甲基-5-十五烷基間苯二酚?；衔? 為新化合物，化合物3 和4 為首次從本植物中發(fā)現(xiàn)。

以自制的化合物2 為對(duì)照品，HPLC 法測(cè)定其含量。對(duì)比石油醚和乙醇提取物，石油醚提取物的色譜圖（Fig.2B）幾乎沒(méi)有雜峰，干擾因素較少，分離效果較好；乙醇提取物的色譜圖峰多雜亂，分離效果較差；實(shí)驗(yàn)證明，石油醚提取效率高于乙醇。因此，本文用石油醚為溶劑提取化合物2。

Fig.2 Chromatogram of Ardisia japonica （Thunb） Blume

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［13］，化合物2 的UV λmax為275 nm，但本文選擇了254 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)，因?yàn)樘烊凰幬镏械脑S多成分均在254 nm 有吸收，且本文中的四個(gè)化合物在254 nm 都有吸收。因此，為了最大程度體現(xiàn)其他成分對(duì)化合物2 定量分析的干擾，選擇了254 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)。