代謝性疾病及心腦血管疾病尿外泌體的變化及機(jī)制研究進(jìn)展

陳曉依 趙靖宇 陳樹春

1.河北北方學(xué)院研究生學(xué)院，張家口，075000，中國

2.河北省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，石家莊，050051，中國

3.華北理工大學(xué)研究生學(xué)院，唐山，063210，中國

2015 年國家衛(wèi)計委提出的《中國疾病預(yù)防控制工作進(jìn)展報告》中指出：慢性病已經(jīng)成為我國居民頭號健康威脅，其中糖尿病及相關(guān)并發(fā)癥、心腦血管疾病等已成為主要死亡原因。近年來，伴隨著分子檢測技術(shù)的快速發(fā)展，外泌體在慢性病中的調(diào)控作用和臨床診療日益受到研究者的關(guān)注。

外泌體（exosomes）是細(xì)胞主動分泌到微環(huán)境中的，體積較小、具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞外囊泡，可自由通過各種生理屏障，其內(nèi)含有的蛋白、核酸和脂質(zhì)等可調(diào)節(jié)靶細(xì)胞的生物學(xué)功能，參與細(xì)胞間通訊及免疫調(diào)節(jié)，在各種生理及病理過程中具有重要作用。外泌體在體液中廣泛分布，如：血液、尿液、腦脊液、羊水、乳汁及唾液等。其中尿液具有樣本量多、取樣方便且穩(wěn)定性高等多種優(yōu)點，相對于其他體液是更理想的各種疾病生物標(biāo)記物的來源［1］。最新研究表明，尿外泌體參與了慢性病（糖尿病、高尿酸血癥、高血壓、心肌損傷、阿爾茨海默病、帕金森綜合征等）的發(fā)生發(fā)展，同時對尿外泌體中蛋白質(zhì)、核酸及脂類的檢測對疾病的早診斷、早治療和預(yù)后判斷有很大的幫助［2］。因此，本文就尿外泌體在代謝性疾病及心腦血管疾病中的最新研究進(jìn)展作一綜述，并探討其相關(guān)調(diào)控機(jī)制。

1 尿外泌體

1.1 外泌體的信息交流方式

外泌體是來源于細(xì)胞的膜性小泡，目前認(rèn)為外泌體與靶細(xì)胞有3 種作用方式［3-4］：①外泌體可直接與靶細(xì)胞膜融合；②外泌體通過與細(xì)胞膜表面的受體相互作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并刺激靶細(xì)胞及其下游的信號通路；③外泌體能被靶細(xì)胞內(nèi)吞進(jìn)入胞內(nèi)，并在靶細(xì)胞內(nèi)重新被釋放或經(jīng)溶酶體途徑降解。

1.2 尿外泌體的組成成分

尿外泌體是最早由Pisitkun 等用超速離心法分離純化得到的，并用全液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析揭示了正常人尿外泌體含有295 種蛋白質(zhì)，隨著技術(shù)的進(jìn)步，Wang 等［5］利用多維蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)對尿外泌體進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，結(jié)果鑒定出3 280 種蛋白質(zhì)，其中9 個人之間有31%的重疊，即共同含有1 000 多種蛋白質(zhì)，為未來的研究提供了可靠的參考價值。尿外泌體攜帶母細(xì)胞來源的特異性蛋白，如Wilms’腫瘤基因-1（wilms’tumor-1，WT1）、近曲小管的3 型Na-H 交換 器（Na+/H+-exchanger 3，NHE3）、水通道蛋白-1、髓袢升支粗段的2 型Na-K-2Cl 共轉(zhuǎn)運體（Na+-K+-2Clcotransporter 2，NKCC2）、遠(yuǎn)曲小管的Na-Cl 共轉(zhuǎn)運體（Na-Clcotransporter，NCC）和集合管的上皮鈉通道（epithelial sodium channel，ENaC）等。因此檢測尿外泌體攜帶的組織特異性蛋白質(zhì)能反映靶細(xì)胞現(xiàn)階段的狀態(tài)、病變部位及程度［6］。此外，外泌體中還含有蛋白、核酸（miRNA、mRNA、lncRNA、DNA）、脂質(zhì)等活性分子。因尿外泌體的蛋白質(zhì)或RNA 在不同疾病中的表達(dá)不同，且具有穩(wěn)定性高、敏感性強(qiáng)的特征，從而成為診斷疾病理想的標(biāo)記物，甚至有可能成為未來靶向治療的載體。

2 尿外泌體在代謝性疾病中的應(yīng)用

2.1 糖尿病

糖尿病是一組以血糖水平高為主要表現(xiàn)的內(nèi)分泌代謝性疾病，其并發(fā)癥可危及生命。最近的研究證明，尿外泌體與糖尿病及其相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生關(guān)系密切，尤其在糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）方面。大多數(shù)研究認(rèn)為高血糖和轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）參與了DN 的關(guān)鍵信號通路及基因表達(dá)。Wang 等［7］發(fā)現(xiàn)，腎小球系膜細(xì)胞在高糖環(huán)境下比正常環(huán)境下分泌的外泌體更多，且外泌體中含的TGF-β1 mRNA 更高，其可激活足細(xì)胞內(nèi)磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B 通路，誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡及黏附抑制。Abe H［8］對糖尿病患者尿外泌體中WT1 蛋白的表達(dá)進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)WT1 蛋白隨患者腎功能的降低反而上升，并可對糖尿病患者腎小球足細(xì)胞的損傷進(jìn)行有效反映，提示尿外泌體可作為DN 早期診斷的非侵入性標(biāo)記物。研究還指出，尿外泌體中WT1 蛋白mRNA 水平可預(yù)測DN 患者腎小球濾過率的下降速度。此外，研究發(fā)現(xiàn)尿外泌體中miR-362-3p、miR-877-3p、miR-150-5p 和miR-15a-5p 可作為DN 早期的無創(chuàng)標(biāo)記物［9］。

2.2 高尿酸血癥

研究發(fā)現(xiàn)尿外泌體源性microRNA 在高尿酸血癥的診斷中也起到重要的作用。胡艷艷等［10］檢測了高尿酸血癥患者尿液外泌體microRNA 的表達(dá)，與正常對照組相比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10 種已知 microRNA 表達(dá)差異（P<0.05），其 中miRNA-32 表達(dá)上 調(diào)，而miR-1246、miR-3615、miR-1、miR-204、miR-126、miR-320d、miR-320c、miR-3158、miR-6510 表達(dá)下調(diào)，提示以上尿外泌體攜帶的microRNAs 可能參與了高尿酸血癥的發(fā)生發(fā)展，將來有可能成為高尿酸血癥有價值的生物標(biāo)記物。然而該研究納入的人群較少，需要大量的臨床試驗研究證實，同時需要深入的研究進(jìn)一步探討尿外泌體源性的microRNA 在高尿酸血癥的作用及潛在的調(diào)節(jié)機(jī)制，為高尿酸血癥發(fā)病機(jī)制的研究提供參考。

3 尿外泌體在心血管系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用

心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）引起30% 以上的全球死亡人數(shù)。在CVD 患者中，活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生會增加。Agudiez 等［11］首次對CVD 患者和正常對照的尿外泌體代謝組學(xué)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在CVD 患者的尿外泌體中4-氨基馬尿酸水平比正常人升高，而N-1 甲基煙酰胺和檸檬酸水平降低。其中4-氨基馬尿酸水平增加可能與較高 ROS 產(chǎn)生及炎癥有關(guān)，而N-1 甲基煙酰胺具有血管舒張?zhí)匦?，可發(fā)揮抗血栓和抗炎作用，成為動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的分子指標(biāo)。檸檬酸水平降低可使三羧酸循環(huán)代謝失調(diào)，促進(jìn)蛋白尿的產(chǎn)生，進(jìn)而導(dǎo)致頑固性高血壓，甚至可能加重CVD 患者慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）的發(fā)生。綜上，尿外泌體的代謝產(chǎn)物含量可以預(yù)測心血管疾病發(fā)生的風(fēng)險。實驗證明尿液作為CVD 生物標(biāo)記物的來源研究具有很大潛力。

3.1 高血壓

高血壓能造成嚴(yán)重的心血管疾病，引發(fā)了全球的關(guān)注。有原發(fā)性高血壓和繼發(fā)性高血壓，其中原發(fā)性高血壓的病因不明確，研究發(fā)現(xiàn)遺傳、內(nèi)皮功能障礙、血管重塑、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)激活等均與高血壓的發(fā)生有關(guān)，但其分子機(jī)制依然不明確。最近研究表明，高血壓的發(fā)生、發(fā)展中尿外泌體起著重要作用。

目前，尿源性外泌體在高血壓中的研究相對于循環(huán)外泌體的研究多，可能是尿液中的外泌體由腎及泌尿生殖道各種上皮細(xì)胞分泌，且大多數(shù)蛋白-鈉轉(zhuǎn)運體位于腎上皮的頂端質(zhì)膜上［12］。研究顯示，尿外泌體內(nèi)鈉轉(zhuǎn)運蛋白與高血壓密切相關(guān)。尿外泌體內(nèi)含有NHE3、NKCC2、NCC 和ENaC，以上轉(zhuǎn)運蛋白在維持電解質(zhì)平衡及血壓調(diào)節(jié)中發(fā)揮了重要作用。這些轉(zhuǎn)運蛋白的改變會導(dǎo)致特殊類型高血壓的發(fā)生，如假性醛固酮增多癥、醛固酮增多癥?；颊吣蛲饷隗w的磷酸化水平比正常人明顯升高，其機(jī)制在醛固酮的作用下，促進(jìn)腎的鈉轉(zhuǎn)運體上的NCC 和ENaC 蛋白磷酸化并移位到尿外泌體內(nèi)，提示尿外泌體可作為高血壓疾病的一種新的無創(chuàng)性診斷標(biāo)記物［13］。Perez-Hernandez 等［14］通過比較大量的高血壓患者與正常人尿液樣本發(fā)現(xiàn)，尿外泌體miR-26a 水平與蛋白尿呈負(fù)相關(guān)，提示尿外泌體miR-26a 可能是研究高血壓早期腎損傷的潛在有用工具。此外，大多數(shù)研究表明高血壓患者尿外泌體的miR-615、miR-211、miRNA-29a-3p、miRNA-193a-5p 等多種miRNAs 對血壓波動較敏感，并且被認(rèn)為是尿外泌體中所特有的，提示尿外泌體的miR-615、miR-211、miRNA-29a-3p、miRNA-193a-5p 可以作為是血壓鹽敏感性和逆鹽敏感性的新型標(biāo)記物［15-16］。

3.2 心肌損傷

心肌損傷可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞死亡。近年來，外泌體miRNA 作為缺血性心臟病的診斷和預(yù)后的生物標(biāo)記物，成為了缺血性心臟病研究熱點之一。microRNAs（miRNAs）是一種小的（<24 個核 苷酸）RNA，具有很強(qiáng)的生物學(xué)功能。研究顯示，尿液中存在外泌體miRNAs，它們來源于泌尿生殖以外的細(xì)胞，經(jīng)血液循環(huán)到達(dá)腎臟，最終以尿外泌體的形式排出體外［17］。血清及尿液外泌體中多種miRNAs，在急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）患者表達(dá)顯著升高，如miR-1、miR-208、miR-194、miR-34a 及miR-499，其中miR-34a、miR-194 與AMI 患者合發(fā)右心衰關(guān)系顯著。研究證實了心臟釋放的miRNAs 可以通過腎釋放進(jìn)入尿液，提示尿外泌體中的miR-1、miR-194、miR-208、miR-34a 及miR-499 可能代表了一組新的缺血性心臟病的尿液生物標(biāo)記物［18］。

4 尿外泌體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用

4.1 阿爾茨海默病

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是以記憶減退合并認(rèn)知障礙為特征的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。AD的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，目前認(rèn)為與β淀粉樣蛋白參與形成淀粉樣老年斑、Tau 蛋白過度磷酸化聚集成雙螺旋變成神經(jīng)纖維纏結(jié)及神經(jīng)功能退行性病變等密切相關(guān)，外泌體則參與了β淀粉樣蛋白和Tau 蛋白在機(jī)體內(nèi)的代謝、轉(zhuǎn)運等過程［19］。目前對阿爾茨海默癥尿外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)的報道并不多，吳利等［20］首次采用液壓透析與超高速離心兩種方法聯(lián)合提取分離AD 患者尿液外泌體，并通過蛋白質(zhì)組學(xué)的方法對AD 患者與對照組尿外泌體的差異蛋白進(jìn)行分析，提出與機(jī)體炎癥相關(guān)的尿外泌體alpha-1-antichymotrypsin、ceruloplasmin、protein S100-A8、protein S 100-A9 與細(xì)胞骨架相關(guān)的尿外泌體annexin A2 等五個蛋白可作為AD 的生物標(biāo)記物。

4.2 帕金森病

帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）成為排名第二的老年人常見神經(jīng)系統(tǒng)疾病。研究表明PD 典型病理改變是路易氏體的形成，而α-核突觸蛋白（alphasynuclein，α-Syn）是其主 要成分［21］。α-Syn 可能通過富亮氨酸重復(fù)激酶2（leucine-rich repeat kinase 2，LRRK2）介導(dǎo)的自噬和細(xì)胞內(nèi)吞途徑致病，而LRRK2基因的表達(dá)被證實與外泌體的合成和分泌有關(guān)［21］：LRRK2 與內(nèi)吞蛋白Rab5b 可互相作用調(diào)節(jié)內(nèi)體囊泡轉(zhuǎn)運。在PD 患者的尿液中可以檢測到LRRK2 蛋白外泌體，這表明LRRK2 蛋白的分泌又依賴于外泌體。

目前，有關(guān)PD 認(rèn)知障礙的尿液生物標(biāo)記物研究較少，F(xiàn)raser 等［22］收集了79 例已排除LRRK2 基因突變的PD 患者和79 例健康受試者的尿液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PD 患者尿外泌體磷酸化LRRK2 水平高于健康受試者，且磷酸化 LRRK2 水平越高，PD 患者認(rèn)知功能及日常活動能力越差。而Ho 等［23］在PD 患者尿外泌體未檢測到α-Syn，且發(fā)現(xiàn)PD 患者尿外泌體中的DJ-1 和LRRK2蛋白與健康受試者無明顯差異，男性PD 患者尿外泌體中DJ-1 蛋白水平較男性健康受試者增高，但尿外泌體中的DJ-1 蛋白是否可作為男性PD 患者的候選生物標(biāo)記物，需要不斷探索和研究。

5 總結(jié)和展望

尿外泌體作為慢性疾病的新型診斷標(biāo)記物具有很多優(yōu)勢，尿外泌體攜帶有特異性的蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)，它的脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)可以保護(hù)內(nèi)部循環(huán)的miRNA、mRNA、DNA 片段及功能性蛋白等活性物質(zhì)，取樣容易且穩(wěn)定存在于尿液中，因此可用作各系統(tǒng)疾病的診斷和預(yù)后的潛在生物標(biāo)記物［1］。近年來，雖然尿外泌體在各系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展中取得一定的成果，但在臨床應(yīng)用方面仍然面臨著很多挑戰(zhàn)，需要更高效、更標(biāo)準(zhǔn)化的外泌體分離和鑒定技術(shù)。提取尿外泌體有差速超速和密度梯度離心法等，這些提取方法還有許多不足，如產(chǎn)量低、耗時長等。但隨著對尿外泌體在慢性疾病研究中的不斷深入及分子檢測技術(shù)的飛速發(fā)展，尿外泌體作為新型生物標(biāo)記物在慢性疾病的早期診斷和預(yù)后評估必然發(fā)揮關(guān)鍵作用，甚至有可能成為疾病診療的新方向。