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    N-乙酰半胱氨酸對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠治療作用及機(jī)制

    2021-08-07 06:28:54潘獻(xiàn)柱汪曉慶謝琳琳劉梅梅趙大海汪陶榮陳曉宇
    關(guān)鍵詞:滑膜踝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)

    楊 珺,潘獻(xiàn)柱,汪曉慶,謝琳琳,劉梅梅,趙大海,葉 靜,汪陶榮,陳曉宇

    (1. 安徽醫(yī)學(xué)高等??茖W(xué)校形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心,安徽 合肥 230061;2. 安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科,安徽 合肥 230601;3.安徽醫(yī)科大學(xué)形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心,安徽 合肥 230032)

    類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)病因未明,常表現(xiàn)為多發(fā)性小關(guān)節(jié)對稱性炎癥,往往以體液免疫為主,病變部位有大量炎細(xì)胞浸潤,病變遷延會導(dǎo)致患者關(guān)節(jié)功能障礙、殘疾[1]。Toll 樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是高度保守的模式識別受體因子(pattern recognition receptor factors,PRRs)家族中的跨膜受體,激活后能進(jìn)行炎癥反應(yīng)[2]。Toll 樣 受 體2(Toll-like receptor 2,TLR2)是重要的TLRs,通過識別細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),介導(dǎo)體液免疫反應(yīng),募集下游炎癥細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄,導(dǎo)致腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)、白 細(xì) 胞 介 素-1β(interleukin 1β,IL-1β)、白細(xì)胞介素-10(interleukin 10,IL-10)等致炎細(xì)胞因子升高,引起機(jī)體自身免疫性炎癥[3]。同時(shí),長期慢性炎癥使得RA 患者活動期機(jī)體活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)升高,抗氧化物酶水平下降[4]。抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)是含有巰基的半胱氨酸衍生物,可降解酸性肽鏈中的二硫鍵[5]。炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激相互作用可能為RA 發(fā)病的重要機(jī)制[6],但兩者關(guān)聯(lián)性需進(jìn)一步確認(rèn)。NAC 的抗氧化作用,清除機(jī)體ROS,能否降低RA 的慢性炎癥反應(yīng),值得進(jìn)一步研究。佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant arthritis,AA)是常用RA 動物模型[7],本文旨在研究NAC 對AA大鼠的抗炎作用,并觀察TLR2 和下游炎癥因子途徑在其中的可能作用。

    1 材料與方法

    1.1 主要儀器與試劑

    足跖容積測量儀(YLS-7C 型),北京凱輝盛達(dá)科技發(fā)展有限公司;激光共聚焦顯微鏡(LEXT OLS4100 型),日本奧林巴斯公司;全自動酶標(biāo)儀(infnite 200 PRO),瑞士帝肯公司。NAC,美國Swanson 公司;弗氏完全佐劑(freund's complete adjuvant,F(xiàn)CA),武漢易泰科技有限公司;兔抗鼠TLR2 單克隆抗體,荷蘭Hycult Biotech 公司;兔抗鼠β-actin 多克隆抗體,美國Abbkine 公司;ELISA 試劑盒TNF-α、IL-1β、IL-10,美國Biovision 公司;羊抗兔二抗和顯色試劑盒,武漢博士德生物有限公司;蛋白測定和化學(xué)發(fā)光試劑盒,美國Absin Bioscience有限公司。

    1.2 動物分組與給藥

    50 只健康雄性sprague-dawley(SD)大鼠,體質(zhì)量(210±10)g,購于安徽省動物實(shí)驗(yàn)中心(皖準(zhǔn)字2019-01)。SD 大鼠飼養(yǎng)于(25±2)℃環(huán)境中,白天夜晚12 h 光照交替。造模和給藥參照文獻(xiàn)[8],50只動物隨機(jī)分成兩組:對照組10 只0.1 mL 磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)注射右后足趾皮下;另40 只造模,構(gòu)建AA 大鼠,右后足趾皮下注射0.1 mL FCA,致炎10 d 后,再分成4 組,每組10只:模型組及NAC 低、中、高劑量組(灌胃給藥量50、100、200 mg/kg),NAC 連續(xù)灌胃16 d,對照組與模型組灌胃等量PBS。本實(shí)驗(yàn)符合學(xué)校實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會規(guī)定。

    1.3 關(guān)節(jié)炎癥狀判定和標(biāo)本處理

    關(guān)節(jié)炎癥指標(biāo)參照文獻(xiàn)[8],造模后10 d 開始,每4 天記錄一次關(guān)節(jié)病變。(1)關(guān)節(jié)腫脹度:反映繼發(fā)性炎癥改變,應(yīng)用容積測量儀測量SD 大鼠左后肢踝關(guān)節(jié)以下的容積變化(ΔmL)=致炎后左后肢容積(mL)-致炎前左后肢容積(第10 天,mL)。(2)關(guān)節(jié)炎指數(shù):反映四肢炎性改變,最高12 分,標(biāo)準(zhǔn)如下,0 分:四肢關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)無變化;1 分:某個(gè)四肢關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅斑或輕微腫脹;2 分:≥2 個(gè)四肢關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅斑和輕微腫脹;3 分:≥2 個(gè)四肢關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅斑和腫脹;4 分:≥2 個(gè)四肢關(guān)節(jié)腫脹明顯,不能站立。第26天,戊巴比妥鈉麻醉下,股靜脈取血、離心,-20 ℃保存待測炎癥因子;每組隨機(jī)選取3 只SD 大鼠左后肢踝關(guān)節(jié),做組織學(xué)檢查;每組余下7 只SD 大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織,以踝關(guān)節(jié)為中心,逐層切開,剝?nèi)£P(guān)節(jié)面上方呈淡黃色的滑膜組織,-80 ℃凍存作進(jìn)一步研究。

    1.4 踝關(guān)節(jié)免疫組織化學(xué)檢查

    做組織學(xué)檢查的SD 大鼠踝關(guān)節(jié)固定于4%多聚甲醛溶液中,硝酸脫鈣、乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、厚3 μm 切片,免疫組化采取鏈霉素過氧化合物酶復(fù)合物(strept actividin-biotin complex,SABC)法,根據(jù)試劑盒說明書,切片脫蠟至水,經(jīng)過3%H2O2處理、抗原修復(fù)、封閉抗原,滴加一抗兔抗鼠TLR2 單克隆抗體(濃度1∶200)50 μL,4 ℃孵育過夜,次日二抗、SABC 染液50 μL、DAB 顯色、蘇木精復(fù)染,再行脫水、透明、封片、鏡檢、攝片。免疫組化染色判斷,陽性結(jié)果為細(xì)胞質(zhì)(或核)呈黃色或棕黃色,采用PBS 替代一抗作陰性對照。采用南京捷達(dá)JD801 圖像分析軟件,參照文獻(xiàn)[9]計(jì)算TLR2 免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞光密度值(optical density,OD)。

    1.5 Western blot 法測定TLR2 蛋白表達(dá)

    取出踝關(guān)節(jié)滑膜組織后,加入組織裂解液,將滑膜組織研磨成勻漿,離心后,測定組織總蛋白含量。上樣30 μg 蛋白,行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離,電轉(zhuǎn)移法將蛋白至硝酸纖維素膜,孵育一抗:兔抗鼠TLR2 單克隆抗體(濃度1∶1 500),兔抗鼠β-actin 多克隆抗體(濃度1∶3 000),化學(xué)發(fā)光法顯像,Image J 軟件作半定量分析。

    1.6 酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)測定血清炎癥因子濃度

    SD 大鼠血清炎癥因子含量檢測采取ELISA法,按照美國Biovision 公司提供的ELISA 試劑盒說明書步驟,檢測血清TNF-α、IL-1β、IL-10 濃度。

    1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    采用SPSS23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件包,關(guān)節(jié)炎指數(shù)、關(guān)節(jié)腫脹度、TLR2 蛋白和炎癥因子含量等計(jì)量資料以(±s)表示,進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)后采用t檢驗(yàn),P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 NAC 對AA 大鼠繼發(fā)性關(guān)節(jié)腫脹的影響

    為觀察NAC 改善SD 大鼠非炎癥側(cè)關(guān)節(jié)腫脹情況,應(yīng)用排水法計(jì)算從FCA 注射第10 天開始,連續(xù)16 d。與對照組SD 大鼠比較,AA 模型組繼發(fā)性足腫脹明顯,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);NAC低、中、高劑量組灌胃給藥后,明顯抑制AA 模型大鼠的繼發(fā)性足腫脹(P<0.05 或P<0.01),NAC 高劑量組變化最明顯,見表1。

    表1 各組足腫脹度(ΔmL)比較(n=10,±s)Tab 1 Comparison of secondary lateral joint swelling(ΔmL)of rats in the each group(n=10,±s)

    表1 各組足腫脹度(ΔmL)比較(n=10,±s)Tab 1 Comparison of secondary lateral joint swelling(ΔmL)of rats in the each group(n=10,±s)

    注:與對照組比較,##P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01。

    26 d 0.23±0.03 0.82±0.07##0.73±0.08*0.54±0.04**0.44±0.05**組別對照組模型組NAC 低劑量組NAC 中劑量組NAC 高劑量組10 d 0.10±0.02 0.43±0.05##0.44±0.04 0.44±0.04 0.45±0.03 14 d 0.12±0.03 0.54±0.05##0.51±0.04 0.49±0.04*0.47±0.05*18 d 0.17±0.02 0.71±0.05##0.64±0.06*0.54±0.04**0.48±0.05**22 d 0.20±0.03 0.88±0.06##0.81±0.06*0.71±0.05**0.54±0.04**

    2.2 NAC 對大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)癥的影響

    致炎10 d 后,與對照組SD 大鼠相比較,AA 模型組大鼠非致炎側(cè)(左后肢)足趾開始腫脹,進(jìn)行性加重,直至站立困難,各時(shí)間點(diǎn)關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);NAC 低、中、高劑量組各治療組均有效緩解癥狀,關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分降低,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05 或P<0.01),以NAC 高劑量組最為明顯,見表2。

    表2 各組繼發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)比較(n=10,±s)Tab 2 Comparison of secondary arthritis index of rats in each group(n=10,±s)

    表2 各組繼發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)比較(n=10,±s)Tab 2 Comparison of secondary arthritis index of rats in each group(n=10,±s)

    注:與對照組比較,##P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01。

    26 d 0.95±0.40 8.71±0.61##5.56±0.46**4.23±0.47**3.72±0.37**組別對照組模型組NAC 低劑量組NAC 中劑量組NAC 高劑量組10 d 0.56±0.25 5.91±0.45##5.71±0.39 5.61±0.42 5.82±0.39 14 d 0.76±0.29 6.80±0.63##6.12±0.56*5.97±0.65*5.58±0.47**18 d 0.92±0.27 8.60±0.68##6.39±0.71**6.19±0.68**5.74±0.52**22 d 0.98±0.31 9.52±0.72##6.87±0.68**5.43±0.52**5.06±0.48**

    2.3 免疫組化染色顯示NAC 對AA 大鼠踝關(guān)節(jié)TLR2 蛋白表達(dá)

    陽性染色呈黃色或棕黃色顆粒,位于關(guān)節(jié)滑膜和軟骨細(xì)胞中。對照組SD 大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中有少量TLR2 蛋白陽性表達(dá);AA 模型大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織增厚,TLR2 蛋白表達(dá)增加;NAC 治療組隨著灌胃劑量的增加,TLR2 蛋白陽性表達(dá)逐漸減弱,見圖1。計(jì)算TLR2 蛋白陽性O(shè)D 值,與對照組OD 值(0.13±0.02)比較,AA 模型組OD 值(0.39±0.09)明顯升高(t=6.733,P<0.01),NAC 低、中、高劑量組TLR2 蛋白的OD 值均降低,分別為(0.31±0.07)、(0.26±0.06)、(0.21±0.05),與模型組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05 或P<0.01)。

    圖1 各組踝關(guān)節(jié)TLR2 蛋白表達(dá)免疫組化結(jié)果(SABC 染色×100)Fig 1 Immunohistochemical results of TLR2 protein expression in ankle joints of rats(SABC staining ×100)

    2.4 Western blot 檢測NAC 對關(guān)節(jié)滑膜組織中TLR2 蛋白的表達(dá)影響

    與對照組SD 大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織比較,TLR2 蛋白在模型組滑膜組織中表達(dá)增加明顯,而NAC 低、中、高劑量組滑膜組織中TLR2 蛋白含量較對照組升高,但較模型組明顯下降。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,NAC低、中、高劑量組較模型組滑膜組織TLR2 蛋白降低,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05 或P<0.01)。見表3 及圖2。

    圖2 各組滑膜組織TLR2 蛋白表達(dá)Fig 2 TLR2 protein expression in synovial tissues of rats in eac h group

    表3 各組TLR2/β-actin 相對蛋白量表達(dá)(n=7,±s)Tab 3 Relative protein content(TLR2/β-actin)in each group(n=7,±s)

    表3 各組TLR2/β-actin 相對蛋白量表達(dá)(n=7,±s)Tab 3 Relative protein content(TLR2/β-actin)in each group(n=7,±s)

    注:與對照組比較,##P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01。

    相對蛋白量0.21±0.03 0.67±0.04##0.56±0.07*0.38±0.05**0.32±0.03**組別對照組模型組NAC 低劑量組NAC 中劑量組NAC 高劑量組

    2.5 ELISA 測定大鼠血清炎癥因子含量

    與對照組比較,模型組血清中致炎因子TNF-α、IL-1β 相比較含量明顯增加,而IL-10 含量明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);而NAC各 劑 量 組 致 炎 因 子TNF-α、IL-1β 含 量 下 降,而IL-10 含量明顯升高,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05 或P<0.01),見表4。

    表4 各組血清炎癥因子比較(pg/mL,n=10,±s)Tab 4 Comparison of serum inflammatory factors in each group(pg/mL,n=10,±s)

    表4 各組血清炎癥因子比較(pg/mL,n=10,±s)Tab 4 Comparison of serum inflammatory factors in each group(pg/mL,n=10,±s)

    注:與對照組比較,##P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01。

    IL-10 12.03±0.54 7.62±0.55##8.16±0.45*8.49±0.79*9.36±0.63**組別對照組模型組NAC 低劑量組NAC 中劑量組NAC 高劑量組TNF-a 470.57±27.94 830.32±65.04##759.94±63.07*742.50±71.11*605.87±56.03**IL-1β 12.15±1.50 34.98±3.13##30.59±3.73*24.35±2.81**20.13±2.34**

    3 討論

    RA 以破壞多發(fā)性小關(guān)節(jié)的軟骨組織和骨結(jié)構(gòu)的自身免疫病,當(dāng)患者機(jī)體在病痛、促炎因子、持續(xù)的關(guān)節(jié)滑膜炎癥等傷害性刺激下,組織細(xì)胞中氧自由基過度生成,使得機(jī)體氧化-抗氧化作用失調(diào),機(jī)體過度的ROS 加重炎癥反應(yīng),使得RA 病程進(jìn)展[9]。TNF-α、IL-1β 的過表 達(dá)會破壞關(guān)節(jié)滑膜和關(guān)節(jié)軟骨,引起骨侵蝕加重,骨修復(fù)系統(tǒng)長期遭受破壞,引起關(guān)節(jié)畸形,程度不等的關(guān)節(jié)強(qiáng)直和功能喪失。弗氏完全佐劑建立的AA 動物模型是研究RA 的常見動脈模型,本研究通過大鼠皮下注射弗氏完全佐劑,應(yīng)用關(guān)節(jié)腫脹度、關(guān)節(jié)炎指數(shù),反映四肢炎性改變,結(jié)果證實(shí)造模成功。氧化應(yīng)激在AA 大鼠關(guān)節(jié)損傷中作用明顯,由致炎因子導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激是關(guān)節(jié)病變的重要原因[10]。本研究ELISA 檢測顯示,模型組血清中致炎因子TNF-α、IL-1β 較對照組明顯增加,而抑炎因子IL-10 含量明顯降低,說明AA大鼠炎癥的存在和損傷。

    NAC 為還原性谷胱甘肽的前體,可促進(jìn)細(xì)胞谷胱甘肽(glutathione,GSH)的合成,增加血清中內(nèi)谷胱甘肽GSH 含量,清除ROS,從而實(shí)現(xiàn)多途徑抗生物氧化作用,NAC 是機(jī)體ROS 抑制劑,通過促進(jìn)還原型谷胱甘肽(GSH)生物合成,清除ROS 而抗氧化和抗炎功能[11]。本研究也證實(shí),NAC 能劑量依賴性地改善AA 大鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)和關(guān)節(jié)腫脹度,降低模型動物血清中促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β 表達(dá),升高抑炎細(xì)胞因子IL-10 表達(dá),表明NAC 對AA大鼠抗氧化的同時(shí),可有效降低炎癥損傷。

    RA 的發(fā)病機(jī)制未明,持續(xù)性的滑膜炎是骨破壞重要因素,研究RA 發(fā)病過程中炎癥信號通路是認(rèn)識該病的重要方向[12]。TLR 和下游炎癥因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是免疫性炎癥的重要信號通路,TLR 過表達(dá)有可能在RA 發(fā)病中影響較大[13]。有研究發(fā)現(xiàn)在低氧和細(xì)菌脂多糖刺激下的大鼠睪丸炎模型中,在炎癥起始階段TLR2 活化后,可促進(jìn)炎癥細(xì)胞黏附與侵襲睪丸生精細(xì)胞,導(dǎo)致精子生成障礙[14]。本研究通過免疫組化染色和蛋白免疫印跡均證實(shí),相對于正常對照大鼠,AA 大鼠模型滑膜組織呈TLR2蛋白高表達(dá),表明異常激活的TLR2 蛋白參與AA大鼠發(fā)病進(jìn)程中;而且,NAC 治療組滑膜組織中TLR2 蛋白表達(dá)水平較模型組明顯降低,且呈NAC濃度依賴趨勢,即隨著NAC 濃度升高,AA 大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中TLR2 蛋白漸減弱,表明NAC 可能通過抑制TLR2 的活性而對AA 大鼠起到一定治療作用。TLR2 下游效應(yīng)細(xì)胞因子產(chǎn)生于單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)和關(guān)節(jié)成纖維樣滑膜細(xì)胞等,與炎癥疾病活動度有一定的相關(guān)性[15]。本研究表明,低劑量的NAC 即可明顯降低大鼠血清促炎因子IL-1β、TNF-α 降低,升高抑炎因子IL-10,但NAC 是否通過降低TLR2 活性,從而降低炎癥反應(yīng)有待進(jìn)一步機(jī)制研究。

    作者貢獻(xiàn)度說明:

    楊珺:實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析、文章撰寫;潘獻(xiàn)柱、汪曉慶:免疫組化實(shí)驗(yàn);謝琳琳、劉梅梅:AA 造模及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的采集;趙大海、汪陶榮:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析;葉靜:實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和文章審校;陳曉宇:實(shí)驗(yàn)統(tǒng)籌安排及文章審校。

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