哺乳期雙酚A暴露致小鼠睪丸生精細胞減數(shù)分裂阻滯的機制研究

黃曉迪，凌遠超，趙程，陳建美，張金枝，劉雅楠，解美娜，b

濰坊醫(yī)學(xué)院 a.生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 b.醫(yī)學(xué)研究實驗中心，山東 濰坊 261053

雙酚A（bisphenol A，BPA）又稱雙酚基丙烷，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與雌激素類似，屬于環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的一種。BPA是世界上使用最多的工業(yè)化學(xué)品之一，被廣泛用于制造餐具、塑料容器、水管、醫(yī)療器具、電子設(shè)備、玩具等消費品。BPA進入機體后能夠模擬內(nèi)源性激素的作用，干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)，造成精子數(shù)量下降，精子畸形率升高，性功能減退以及不育率增加等各種不良影響［1-2］。由于BPA暴露途徑眾多，在食物、水、空氣、塵埃顆粒、土壤、人體尿液和母乳中均可檢測到BPA［3-6］，因此BPA對雄性生殖系統(tǒng)健康的影響已不容忽視。

哺乳期是睪丸發(fā)育的關(guān)鍵時期，在這一過程中，睪丸原始生精細胞在曲細精管管腔中通過有絲分裂和減數(shù)分裂經(jīng)精原細胞、初級精母細胞、次級精母細胞最終分化為圓形精子細胞［7］。由于哺乳期生殖系統(tǒng)處于發(fā)育階段，且尚未形成血睪屏障，對激素樣活性物質(zhì)尤其敏感［8］，因此研究哺乳期BPA 暴露對生殖系統(tǒng)的影響和相關(guān)機制具有極為重要的意義。

細胞周期是生命活動中最重要的過程，在精子發(fā)生過程中，有絲分裂與減數(shù)分裂的準(zhǔn)確發(fā)生都依賴有序的細胞周期調(diào)控。盡管國內(nèi)外已經(jīng)有大量研究證實了BPA 的生殖毒性，但鮮有文獻報道BPA 對精子發(fā)生過程中減數(shù)分裂阻滯的機制研究。本研究擬建立哺乳期雄性小鼠體內(nèi)BPA 染毒模型，在斷乳后檢測BPA 對小鼠睪丸細胞分化的影響，并通過檢測睪丸中細胞周期相關(guān)蛋白Cdc25A、Cdc25C、Wee1、p-Tyr15 Cdc2、CDK1 表達量的變化，以及細胞周期相關(guān)基因Cdc25A、Cdc25C、Wee1、CDK1mRNA水平的變化情況，以了解BPA對相關(guān)周期調(diào)控因子轉(zhuǎn)錄和翻譯的作用，進一步探討B(tài)PA影響睪丸細胞減數(shù)分裂周期進程的分子機制。

1 對象與方法

1.1 主要儀器與試劑

超低溫冰箱（SANYO，日本），高速冷凍離心機（Heraeus，德國），流式細胞儀（BD，美國），小型垂直電泳轉(zhuǎn)印裝置系統(tǒng)（Bio-Rad，美國），化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（Protein Simple，美國），PCR 儀（Bio-Rad，美國），凝膠成像分析系統(tǒng)（UVP，美國）。

雙酚A、玉米油（Sigma-Aldrich，美國），DNA 含量檢測試劑盒（BD，美國），RIPA 裂解液（強）（北京康為世紀(jì)，中國），Na3VO4、NaF（上海生工，中國），抗Cdc25A 一抗、抗Cdc25C 一抗、抗Wee1 一抗、抗p-Tyr15 Cdc2 一抗、抗CDK1 一抗（Santa Cruz，美國），抗β-actin 一抗、山羊抗小鼠辣根過氧化物酶二抗（北京中杉金橋，中國），化學(xué)發(fā)光試劑盒（上海碧云天，中國），Trizol 試劑（上海生工，中國），RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR 擴增試劑盒（北京康為世紀(jì)，中國）。

1.2 實驗動物分組與染毒

健康的ICR 妊娠母鼠12 只，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，許可證號SCXK（魯）20190003。實驗期間飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制在（24±2）℃，相對濕度40%～50%，自由進食繁殖期飼料，飲清潔水。在母鼠分娩后按照隨機原則將新生小鼠分為3組，對照組（玉米油）、BPA 低劑量組（0.1 mg·kg-1，相當(dāng)于環(huán)境相關(guān)暴露劑量）和BPA 高劑量組（5 mg·kg-1，未觀察到動物明顯不良反應(yīng)的最低劑量），每組10 只。以玉米油為溶劑配制BPA 溶液，對照組給予玉米油。由于新生期小鼠口服給藥困難，且有研究發(fā)現(xiàn)，與BPA 結(jié)合的酶（UDP-葡萄糖醛糖基轉(zhuǎn)移酶）在新生兒中的表達水平很低，口服和非口服給藥的藥代動力學(xué)沒有差異［9］。因此，本研究選擇皮下注射途徑染毒。從小鼠出生后第1 天（postnatal day 1，PND1）起每日對雄性仔鼠頸背部皮下注射藥物（4 μL·g-1）直至PND21 斷奶，染毒周期20 d。在PND22 頸椎脫臼處死小鼠，稱取體重，剝?nèi)〔G丸組織并對睪丸組織進行稱重，流式細胞儀檢測睪丸生精細胞DNA 含量。用于RT-PCR 和Western blotting 檢測的睪丸樣本凍存于-150℃超低溫冰箱。本研究已獲濰坊醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查通過［濰醫(yī)倫研2017第（016）號］。

1.3 檢測指標(biāo)及方法

1.3.1 睪丸組織系數(shù)的計算計算睪丸組織系數(shù)，計算公式為：睪丸系數(shù)=睪丸重量（濕重）/體重×100%。

1.3.2 睪丸生精細胞DNA含量的測定剝離睪丸白膜后加入膠原酶和DNAase 消化，300×g離心5 min 收集細胞，預(yù)冷的PBS 清洗兩次。將細胞以1.0×106個·mL-1密度重新懸浮至1 mL 緩沖溶液中。吸取500 μL 細胞懸液，每樣品加入250 μL 胰蛋白酶緩沖液，輕拍混勻，室溫反應(yīng)10 min 后加入200 μL 胰蛋白酶抑制劑，室溫反應(yīng)10 min，加入冷的碘化丙啶200 μL，4℃避光孵育10 min后，流式細胞儀進行DNA倍體分析，ModFit LT 3.1軟件分析睪丸細胞分群情況。

1.3.3 睪丸內(nèi)細胞周期相關(guān)蛋白相對表達量的測定取凍存睪丸加入裂解液（含100×蛋白磷酸酶抑制劑、100×PMSF、100×蛋白酶抑制劑混合液），冰上裂解提取蛋白。聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后將PVDF膜置于5%的脫脂奶粉（100 mmol·L-1Na3VO4、200 mmol·L-1NaF）中4℃封閉1 h，加入一抗Cdc25A（1∶500）、Cdc25C（1∶500）、Wee1（1∶1 000）、p-Tyr15 Cdc2（1∶300）、CDK1（1∶1 000）、內(nèi)參蛋白β-actin（1∶1 000）4℃孵育 過 夜。用TBST（含100 mmol·L-1Na3VO4、200 mmol·L-1NaF）漂洗3 次，二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，TBST（含100 mmol·L-1Na3VO4、200 mmol·L-1NaF）洗膜，滴加ECL化學(xué)發(fā)光液，化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。采用Image J 1.8.0軟件對結(jié)果進行分析。

1.3.4 睪丸內(nèi)細胞周期相關(guān)基因mRNA 相對表達量的測定取凍存的小鼠睪丸組織，根據(jù)Trizol 試劑盒說明提取總RNA，超微量紫外分光光度計測定提取的總RNA的純度與濃度。按照HiFiScript cDNA合成試劑盒說明書將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用ddH2O代替逆轉(zhuǎn)錄酶作為陰性對照。RT-PCR擴增檢測mRNA水平。利用 Primer 5.0軟件設(shè)計引物序列，見表1，委托Sangon Biotech（上海）有限公司合成。PCR擴增體系為：1 μL cDNA，12.5 μL 2×Taq Mix，10 μL ddH2O，正向、反向引物各0.75 μL。Cdc25A、Cdc25C、Wee1、CDK1、β-actin的退火溫度分別為57、59、60、55、56℃。擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)拍照并進行灰度值分析。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

每組實驗獨立重復(fù)3 次或以上，所有實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)均以±s表示，多組間比較時采用單因素方差分析，染毒組與對照組比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 小鼠體重和睪丸系數(shù)的比較

BPA 給藥過程中小鼠生存狀態(tài)良好，飲食和活動情況無明顯變化，均存活至實驗結(jié)束。與對照組相比，BPA 低、高劑量組小鼠體重、睪丸重量、睪丸系數(shù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05，表2）。

表2 BPA對小鼠體重、睪丸重量、睪丸系數(shù)的影響（±s，n=10）Table 2 Effects of BPA on body weight,testicular weight,and testicular coefficient of mice (±s,n=10)

表2 BPA對小鼠體重、睪丸重量、睪丸系數(shù)的影響（±s，n=10）Table 2 Effects of BPA on body weight,testicular weight,and testicular coefficient of mice (±s,n=10)

劑量組/（mg·kg-1） 體重/g 左睪重/mg 右睪重/mg 睪丸系數(shù)/%0 16.26±2.73 39.70±6.07 41.40±6.15 0.50±0.06 0.1 15.54±1.37 41.50±5.93 44.30±5.58 0.55±0.08 5.0 15.27±1.94 41.70±9.55 42.80±8.77 0.55±0.08 F 0.59 0.45 0.43 1.45 P 0.559 0.511 0.653 0.252

2.2 睪丸生精細胞DNA含量的變化

由表3可見，與對照組相比，BPA 處理組睪丸內(nèi)生精細胞百分比發(fā)生了明顯變化，低、高劑量組二倍體細胞（精原細胞、次級精母細胞和支持細胞）占比明顯減少，四倍體細胞（初級精母細胞、G2/M 期的精原細胞）占比明顯增多，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。而低、高劑量組中單倍體細胞和S 期細胞占比與對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

表3 BPA對小鼠睪丸生精細胞DNA 含量的影響（±s，n=4）Table 3 Effects of BPA on DNA content of spermatogenic cells in mice testis (±s,n=4) 單位（Unit）：%

表3 BPA對小鼠睪丸生精細胞DNA 含量的影響（±s，n=4）Table 3 Effects of BPA on DNA content of spermatogenic cells in mice testis (±s,n=4) 單位（Unit）：%

［注］*：與對照組相比，P＜0.01。

劑量組/（mg·kg-1） 單倍體細胞 二倍體細胞 四倍體細胞 S期0 11.14±4.67 49.33±6.91 24.72±6.44 14.82±5.53 0.1 14.14±2.31 25.05±1.62* 45.89±1.95* 14.93±2.27 5.0 10.29±2.61 25.25±6.67* 51.11±8.89* 13.35±4.90 F 1.20 18.15 14.30 0.08 P 0.346 0.001 0.002 0.921

2.3 睪丸組織細胞周期相關(guān)蛋白表達的變化

圖1A 為免疫印跡蛋白電泳圖。Western blotting檢測結(jié)果顯示：與對照組相比，Cdc25A、Cdc25C、Wee1、p-Tyr15 Cdc2 蛋白表達水平在低、高劑量組中均降低（P＜0.05 或P＜0.01），CDK1 表達水平無明顯改變（均P＞0.05）（圖1B）。

圖1 BPA對哺乳期小鼠睪丸內(nèi)Cdc25A、Cdc25C、Wee1、p-Tyr15 Cdc2、CDK1蛋白相對表達水平的影響（n=10）Figure 1 Effects of BPA on protein relative expression levels of Cdc25A,Cdc25C,Wee1,p-Tyr15 Cdc2,and CDK1 in the testis of lactational mice (n=10)

2.4 睪丸組織細胞周期相關(guān)基因mRNA水平的變化

由圖2可見，在BPA 低劑量、高劑量組中Cdc25A、Cdc25C、Wee1、CDK1mRNA的表達水平與對照組相比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

圖2 BPA 對哺乳期小鼠睪丸內(nèi)Cdc25A、Cdc25C、Wee1、CDK1 mRNA 相對表達水平的影響（n=10）Figure 2 Effects of BPA on mRNA relative expression levels of Cdc25A,Cdc25C,Wee1,and CDK1 in the testis of lactational mice(n=10)

3 討論

在小鼠出生后第1-21 天，睪丸精原細胞完成分化轉(zhuǎn)變?yōu)槌跫壘讣毎跫壘讣毎瓿蓽p數(shù)分裂形成圓形精子細胞，是研究外源生殖毒性物質(zhì)對減數(shù)分裂進程影響的最佳階段。因此本研究選擇小鼠出生后第1-21 天染毒BPA，探討B(tài)PA 對小鼠精子發(fā)生過程中減數(shù)分裂的影響。研究發(fā)現(xiàn)，BPA 暴露導(dǎo)致小鼠睪丸生精細胞中四倍體細胞比例增加，二倍體細胞比例減少。小鼠睪丸中四倍體細胞主要包括處于細線期、偶線期、粗線期和雙線期中的初級精母細胞和G2/M 期的精原細胞，二倍體細胞主要包括次級精母細胞、精原細胞和支持細胞［9-10］。22日齡小鼠睪丸中初級精母細胞比例增大，精原細胞比例減?。?］，且細胞G2/M 期轉(zhuǎn)換持續(xù)時間較短，這說明，BPA 暴露導(dǎo)致小鼠睪丸中生精細胞減數(shù)分裂阻滯在初級精母細胞階段，進入減數(shù)分裂下一階段的初級精母細胞量減少，減數(shù)分裂進程發(fā)生紊亂。這與Ali 等［11］發(fā)現(xiàn)的BPA 導(dǎo)致大鼠睪丸曲細精管部分精母細胞減數(shù)分裂阻滯的結(jié)果一致。BPA 將生精細胞減數(shù)分裂阻滯在初級精母細胞階段，必然會干擾精子發(fā)生。已經(jīng)有不少研究證實BPA 暴露會影響精子發(fā)生，降低精子數(shù)量和精子質(zhì)量［12-13］。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，BPA 暴露于小鼠出生后第1-21 天會導(dǎo)致在精母細胞內(nèi)特異表達的Boule 蛋白下調(diào)［14］。Boule基因可以通過調(diào)節(jié)Cdc25A 的翻譯水平來活化成熟促進因子（mature promoting factor，MPF），即CDK1/CyclinB 復(fù)合物，啟動減數(shù)分裂G2 期向M 期的轉(zhuǎn)換［15］。因此，本研究檢測了BPA是否影響細胞周期調(diào)控相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，發(fā)現(xiàn)BPA引起睪丸內(nèi)Cdc25A、Cdc25C、Wee1、p-Tyr15 Cdc2 蛋白表達下調(diào)，未影響CDK1 蛋白的表達。Cdc25A 與Cdc25C 同屬于Cdc25 家族，在細胞周期調(diào)控中能夠?qū)PF 的催化亞基CDK1（即Cdc2）的Tyr15 位點去磷酸化，進而激活CDK1/CyclinB 復(fù)合物［16］。Cdc25A 與Cdc25C 可以促進細胞G1/S、G2/M 檢驗點之間的轉(zhuǎn)變，有研究表明Cdc25C 蛋白表達缺失會導(dǎo)致前列腺癌細胞G2/M 期比例增多［17］。Wee1 蛋白在細胞周期調(diào)控中發(fā)揮檢查點作用，主要功能是磷酸化MPF 的催化亞基CDK1 Tyr15位點，避免CDK1/Cyclin B復(fù)合物過度激活。研究發(fā)現(xiàn)，使用Wee1 抑制劑能夠抑制CDK1在Tyr15 處的磷酸化，進而誘導(dǎo)細胞凋亡［18］。因此推測，BPA 暴露導(dǎo)致小鼠睪丸生精細胞減數(shù)分裂被阻滯在初級精母細胞階段與Cdc25A、Cdc25C、Wee1 翻譯水平的下調(diào)有關(guān)。由于Cdc25A、Cdc25C、Wee1 蛋白表達水平下調(diào)，導(dǎo)致CDK1 未被及時磷酸化因而磷酸化蛋白（p-Tyr15 Cdc2）水平降低。通過進一步檢測BPA 是否影響Cdc25A、Cdc25C、Wee1以及CDK1的轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)BPA 未影響以上周期調(diào)控因子的轉(zhuǎn)錄，這說明BPA 主要影響睪丸內(nèi)Cdc25A、Cdc25C、Wee1的轉(zhuǎn)錄后翻譯。

綜上所述，哺乳期接觸BPA 能夠干擾小鼠睪丸內(nèi)生精細胞的分化，BPA 可能通過下調(diào)睪丸生精細胞Cdc25A、Cdc25C、Wee1 蛋白表達，影響CDK1 的磷酸化，導(dǎo)致精母細胞減數(shù)分裂阻滯，干擾生精細胞分化進程。但在BPA下調(diào)Cdc25A、Cdc25C、Wee1蛋白表達的過程中，相關(guān)蛋白如何發(fā)揮作用影響減數(shù)分裂，干擾生精細胞分化，需要繼續(xù)深入探討。