鉛和脂多糖暴露致小鼠神經(jīng)炎癥的損傷機(jī)制

王偉軒，李爽，陳松，曹福源，張學(xué)彥，張洋，龐淑蘭，張艷淑，

華北理工大學(xué) a.公共衛(wèi)生學(xué)院 b.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，河北 唐山 063210

中國(guó)是世界鉛生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，長(zhǎng)期慢性鉛暴露可導(dǎo)致神經(jīng)炎癥，腦組織中促炎因子腫瘤壞死因 子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）、白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）等表達(dá)升高，引起學(xué)習(xí)記憶等能力缺陷或下降［1-2］。此外，日常生活中革蘭氏陰性菌感染比較廣泛，如食物污染、水源污染等。革蘭氏陰性菌感染導(dǎo)致的疾病與其釋放的內(nèi)毒素脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）密切相關(guān)。研究顯示脂多糖也可引起神經(jīng)炎癥［3-4］，然而，環(huán)境中鉛和LPS 共同暴露是否可以導(dǎo)致神經(jīng)炎癥加劇還未見報(bào)道。

神經(jīng)炎癥的重要標(biāo)志之一是小膠質(zhì)細(xì)胞過度活化。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中固有免疫細(xì)胞，參與大腦發(fā)育、神經(jīng)環(huán)境維持、損傷反應(yīng)和修復(fù)。研究顯示小膠質(zhì)細(xì)胞具有兩種明顯不同的極化方式：一是經(jīng)典激活途徑，即M1 表型，釋放TNF-α、IL-6、IL-1β等，促進(jìn)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（induced nitric oxide synthase，iNOS）、NADPH 氧化酶2（NADPH oxidase 2，NOX2）、趨化因子受體7（chemokine receptor 7，CCR7）等高表達(dá)，加重炎癥反應(yīng)，破壞血腦屏障，促進(jìn)神經(jīng)元死亡；二是替代激活途徑，即M2 表型，釋放轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、白介素-10（interleukin-10，IL-10）等，并高表達(dá)精氨酸-1（arginase 1，Arg-1）、趨化因子受體2（chemokine receptor 2，CCR2）等，抑制炎癥反應(yīng)、促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)、保護(hù)神經(jīng)元［5-6］。小膠質(zhì)細(xì)胞活化過程中，髓樣細(xì)胞觸發(fā)受體2（triggering receptor expressed on myeloid cells 2，TREM2）可參與其過程且主要在小膠質(zhì)細(xì)胞膜上特異表達(dá)［7］，可通過促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向M2 表型轉(zhuǎn)化，從而維持腦環(huán)境穩(wěn)定，參與阿茲海默癥、帕金森病等神經(jīng)退行性病變［8-9］。TREM2 的表達(dá)變化可受微小RNA（microRNAs，miRNAs）的調(diào)控，有研究顯示，微小RNA-34a（microRNA-34a，miR-34a）靶向TREM2mRNA 3’非翻譯區(qū)，并顯著下調(diào)小膠質(zhì)細(xì)胞中TREM2的表達(dá)［10］。然而，miR-34a在鉛和LPS 聯(lián)合暴露小鼠皮質(zhì)中的變化未見報(bào)道。

本研究通過建立鉛和LPS 聯(lián)合暴露小鼠模型，探討鉛和LPS 聯(lián)合暴露后皮質(zhì)中炎癥因子和小膠質(zhì)細(xì)胞M1、M2 標(biāo)志物及TREM2 和miR-34a表達(dá)的變化，以期為鉛和LPS 聯(lián)合暴露導(dǎo)致的神經(jīng)損傷防治提供理論依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

SPF 級(jí)雄性C57 小鼠64 只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后將小鼠隨機(jī)均分為對(duì)照組、LPS組、低鉛組、中鉛組、高鉛組、低鉛+LPS組、中鉛+LPS組和高鉛+LPS組，每組8只。鉛染毒劑量為：0.25、0.50、1.00 g·L-1乙酸鉛飲水，共9周，對(duì)照組給予等量的雙蒸水。LPS處理方式：在鉛染毒結(jié)束前一周，每天腹腔注射一次LPS（250 g·kg-1，以體重計(jì)），共7 次，末次注射24 h 后處死動(dòng)物。小鼠麻醉處死，迅速分離腦組織，并在冰上分離出皮質(zhì)，-80℃保存?zhèn)溆?。本研究已獲華北理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（審批號(hào)：LAEC-NCST-2020082）。

1.2 ELISA法檢測(cè)小鼠皮質(zhì)組織中炎癥因子

采用ELISA 試劑盒（Solarbio，中國(guó)），檢測(cè)皮質(zhì)組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 的水平，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。最低檢出限為31.25 ng·L-1。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)M1、M2 型標(biāo)志物和TREM2 mRNA、miR-34a 的表達(dá)水平

取小鼠皮質(zhì)30 mg，采用Trizol 法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析。miR-34a購(gòu)買于廣州銳博生物科技有限公司。內(nèi)參基因?yàn)閁6、β-actin，引物由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成，各引物序列見表1。擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95℃預(yù)熱60 s，然后按95℃ 10 s，60℃ 15 s，72℃ 10 s進(jìn)行50個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

表1 目的基因引物序列Table 1 Primer sequences of target genes

1.4 Western blotting法檢測(cè)TREM2、iNOS和Arg-1蛋白表達(dá)

將皮質(zhì)組織充分裂解并研磨，4℃、12 000 r·min-1離心（離心半徑為4 cm）15 min后取上清液，取2 μL樣品放入96孔板，加入18 μL的PBS稀釋，最終體積為20 μL，將200 μL BCA工作液（BCA試劑∶Cu 體積比=50∶1，提前配制，室溫穩(wěn)定2 h）分別加入標(biāo)準(zhǔn)品和樣品孔中，使其充分混勻后于37℃孵育箱孵育30 min。冷卻至室溫后用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)為592 nm 處檢測(cè)各孔的光密度（D）值，將96 孔板放進(jìn)酶標(biāo)儀，搖板5 s。根據(jù)各孔D值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算各組樣品蛋白濃度。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白（分離膠和濃縮膠體積分?jǐn)?shù)分別為10.00%和5.00%），轉(zhuǎn)膜后進(jìn)行封閉，洗膜，加入TREM2、Arg-1和iNOS 抗體，4℃過夜，洗膜，加二抗37℃孵育2 h，顯影。內(nèi)參蛋白為β-actin。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用單因素方差分析，LPS 組、低鉛組、中鉛組和高鉛組與對(duì)照組比較，低鉛+LPS 組、中鉛+LPS 組和高鉛+LPS 組與相應(yīng)劑量的鉛暴露組比較采用LSD-t檢驗(yàn)。采用析因分析法探討鉛與LPS之間的關(guān)系。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)

與對(duì)照組相比，LPS 組、中鉛組和高鉛組皮質(zhì)中TNF-α、IL-1β 和IL-6 表達(dá)均升高，低鉛組TNF-α、IL-1β 表達(dá)升高（P＜0.05）。與LPS 組相比，中鉛+LPS組和高鉛+LPS 組小鼠皮質(zhì)中TNF-α、IL-1β 和IL-6 表達(dá)增加（P＜0.05）。分別與低鉛組、中鉛組和高鉛組相比，低鉛+LPS組、中鉛+LPS組、高鉛+LPS組的TNF-α、IL-1β 和IL-6 表達(dá)均升高。結(jié)果見表2。析因分析研究結(jié)果顯示，低鉛、中鉛、高鉛與LPS 在TNF-α、IL-1β 和IL-6炎癥因子中均不存在交互作用（P＞0.05）。

表2 鉛和LPS暴露對(duì)皮質(zhì)中炎癥因子的影響（±s，n=8）Table 2 Effects of lead and LPS exposures on inflammatorycytokines in the cortex of mice (±s,n=8) 單位（Unit）：ng·g-1

表2 鉛和LPS暴露對(duì)皮質(zhì)中炎癥因子的影響（±s，n=8）Table 2 Effects of lead and LPS exposures on inflammatorycytokines in the cortex of mice (±s,n=8) 單位（Unit）：ng·g-1

［注］a：與對(duì)照組比較，P＜0.05；b：與LPS 組比較，P＜0.05；c：與低鉛組比較，P＜0.05；d：與中鉛組比較，P＜0.05；e：與高鉛組比較，P＜0.05。中鉛組的IL-1β 有2個(gè)異常值故剔除。

組別 IL-1β TNF-α IL-6對(duì)照組 2.04±0.20 2.41±0.32 1.88±0.09 LPS 組 7.76±0.88a 6.50±0.79a 6.28±0.71a低鉛組 2.80±0.53a 3.15±0.43a 2.11±0.22中鉛組 3.99±0.63a 4.34±0.66a 3.32±0.12a高鉛組 5.65±0.54a 5.98±0.75a 4.97±0.59a低鉛+LPS 組 7.83±0.93c 7.21±1.18c 6.72±1.24c中鉛+LPS 組 8.80±0.95bd 7.82±0.60bd 7.53±0.90bd高鉛+LPS 組 11.18±0.92be 8.79±1.62be 8.66±0.93be

2.2 iNOS、NOX2、CCR7 mRNA變化

與對(duì)照組相比，LPS 組、中鉛組和高鉛組小鼠皮質(zhì)中iNOS、NOX2、CCR7mRNA 表達(dá)升高（P＜0.05），低鉛組中NOX2mRNA 表達(dá)也增加（P＜0.05）。與LPS 組相比，中鉛+LPS 組和高鉛+LPS 組iNOS、NOX2、CCR7mRNA表達(dá)增加。與低鉛組相比，低鉛+LPS組中iNOS、NOX2mRNA 表達(dá)未見明顯升高。與中鉛組相比，中鉛+LPS組iNOS、CCR7mRNA表達(dá)升高（P＜0.05），NOX2未見明顯變化。與高鉛組相比，高鉛+LPS 組iNOS、NOX2、CCR7mRNA表達(dá)均增加。結(jié)果見圖1。

圖1 各組小鼠皮質(zhì)中M1 標(biāo)志物iNOS（A）、NOX2（B）、CCR7（C） mRNA 表達(dá)情況（n=6）Figure 1 Expressions of M1 markers iNOS (A),NOX2 (B),and CCR7 (C) mRNA in the cortex of mice (n=6)

2.3 Arg-1、TGF-β、CCR2 mRNA變化

與對(duì)照組相比，低鉛組Arg-1mRNA 表達(dá)未見明顯變化，LPS 組、中鉛組和高鉛組Arg-1、TGF-β、CCR2mRNA 表達(dá)降低（P＜0.05）。與LPS 組相比，中鉛+LPS組和高鉛+LPS 組中Arg-1mRNA 表達(dá)明顯減少。與鉛暴露組相比，鉛和LPS 聯(lián)合暴露組中Arg-1mRNA表達(dá)降低最為明顯，未見TGF-β、CCR2mRNA 表達(dá)有明顯差異。結(jié)果見圖2。

圖2 各組小鼠皮質(zhì)中M2 標(biāo)志物Arg-1（A）、TGF-β（B）和CCR2（C）mRNA 表達(dá)情況（n=6）Figure 2 Expressions of M2 markers Arg-1 (A),TGF-β (B),and CCR2 (C)mRNA in the cortex of mice (n=6)

2.4 iNOS 和Arg-1蛋白變化

與對(duì)照組相比，鉛暴露組iNOS 蛋白表達(dá)量升高；與LPS 組、同劑量鉛暴露組相比，LPS 和鉛聯(lián)合暴露組中iNOS 蛋白表達(dá)量升高。與對(duì)照組相比，LPS 組和鉛暴露組Arg-1蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；與LPS組相比，聯(lián)合暴露組Arg-1 蛋白表達(dá)降低；與低鉛組相比，低鉛+LPS 組Arg-1蛋白表達(dá)明顯減少，中鉛+ LPS組和高鉛+LPS 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見圖3。

圖3 各組小鼠皮質(zhì)中iNOS（A）和Arg-1（B）蛋白表達(dá)（n=3）Figure 3 Expressions of iNOS (A) and Arg-1 (B) protein in the cortex of mice (n=3)

2.5 TREM2 mRNA 和蛋白表達(dá)

與對(duì)照組相比，LPS 組、低鉛組、中鉛組和高鉛組TREM2mRNA 和蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。與LPS 組相比，低鉛+LPS、中鉛+LPS 和高鉛+LPS 組TREM2mRNA和蛋白表達(dá)降低明顯。分別與低鉛組、中鉛組和高鉛組相比，低鉛+LPS、中鉛+LPS、高鉛+LPS 組TREM2mRNA和蛋白表達(dá)減少（P＜0.05）。結(jié)果見圖4。

圖4 各組小鼠皮質(zhì)中TREM2 mRNA（A）和蛋白（B、C）表達(dá)Figure 4 Expressions of TREM2 mRNA (A) and protein (B and C)in the cortex of mice in each group

2.6 對(duì)皮質(zhì)中miR-34a 表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，LPS 組、低鉛組、中鉛組和高鉛組miR-34a表達(dá)升高（P＜0.05）。與LPS 組相比，低鉛+LPS 組、中鉛+LPS 組和高鉛+LPS 組miR-34a表達(dá)升高1.5倍多。分別與低鉛組、中鉛組和高鉛組相比，低鉛+LPS 組、中鉛+LPS 組和高鉛+LPS 組miR-34a表達(dá)增加。結(jié)果見圖5。

圖5 各組小鼠皮質(zhì)中miR-34a 表達(dá)情況（n=6）Figure 5 Expressions of miR-34a in the cortex of mice in each group (n=6)

3 討論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥以神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的異常激活和中樞系統(tǒng)微環(huán)境中炎癥介質(zhì)的存在為特征。神經(jīng)炎癥的特征為在腦組織中積累大量的炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6等，這些炎癥因子長(zhǎng)期積累在大腦中可引發(fā)神經(jīng)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而加速中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病變過程。TNF-α在腦組織中過度積累會(huì)損傷神經(jīng)元，IL-1β可誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，分泌TNF-α 和IL-6 等促炎因子，進(jìn)一步引發(fā)神經(jīng)炎癥反應(yīng)，加速腦損傷。本研究結(jié)果顯示鉛和LPS單獨(dú)暴露后小鼠皮質(zhì)中炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)均升高。這與胡蒙蒙等［11］研究中LPS暴露后腦組中TNF-α、IL-1β表達(dá)升高的結(jié)果是一致的。本研究結(jié)果還顯示鉛和LPS聯(lián)合暴露后皮質(zhì)中炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)高于單獨(dú)暴露組，提示鉛和LPS聯(lián)合暴露加劇了神經(jīng)炎癥損傷。

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)炎癥反應(yīng)的重要招募者和執(zhí)行者。在健康的大腦中，小膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出“穩(wěn)態(tài)”表型，其表達(dá)表面分子和分泌可溶性因子影響其他神經(jīng)細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞碎片和聚集蛋白的清除，維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)。但外環(huán)境發(fā)生改變時(shí)或者刺激反應(yīng)發(fā)生時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞表型可由穩(wěn)態(tài)（M0）型轉(zhuǎn)變?yōu)镸1或者M(jìn)2。在疾病的不同發(fā)展階段，小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)外界刺激的反應(yīng)在炎癥、組織修復(fù)、突觸可塑性及神經(jīng)再生中起著不同的作用［12］。在神經(jīng)退行性病變中，小膠質(zhì)細(xì)胞呈M1型，釋放炎癥介質(zhì)，誘導(dǎo)神經(jīng)元丟失。M1型小膠質(zhì)細(xì)胞增加，可促進(jìn)神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默病、帕金森病的發(fā)生發(fā)展［13-14］。有研究顯示鉛和LPS可以引起小膠質(zhì)細(xì)胞活化［2，4］，促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向M1型極化，釋放出大量炎癥細(xì)胞因子、抗炎因子、趨化因子、生長(zhǎng)因素等，維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的慢性炎癥［15-16］，本研究結(jié)果顯示，中劑量鉛（0.50 g·L-1）和高劑量鉛（1.00 g·L-1） 以及LPS單獨(dú)暴露后，M1型標(biāo)志基因和iNOS蛋白表達(dá)增加，而M2 標(biāo)志基因和Arg-1 蛋白表達(dá)下降；這與Li等［17］的研究中LPS處理原代小膠質(zhì)細(xì)胞后呈M1型，iNOS、IL-1β等表達(dá)增加的結(jié)果一致。而鉛和LPS聯(lián)合暴露與單獨(dú)暴露相比，M1型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物升高，M2型標(biāo)志物明顯降低，推測(cè)鉛和LPS聯(lián)合暴露加劇了小膠細(xì)胞向M1型轉(zhuǎn)變，進(jìn)而加劇神經(jīng)炎癥。

小膠質(zhì)細(xì)胞極化受到TREM2 等關(guān)鍵蛋白的調(diào)控。TREM2 僅表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞上，且在神經(jīng)退行性病變不同階段發(fā)揮不同作用［18］。有研究顯示TREM2 在M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞上表達(dá)升高，而在M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞上表達(dá)降低，且上調(diào)TREM2 的表達(dá)促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向M2 型轉(zhuǎn)變，而下調(diào)TREM2 促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向M1 型轉(zhuǎn)變。在本研究中，LPS和鉛單獨(dú)暴露后，皮質(zhì)中TREM2mRNA和蛋白表達(dá)下降；鉛和LPS聯(lián)合暴露后TREM2表達(dá)更加降低。推測(cè)在鉛和LPS暴露后TREM2調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞向M1極化，而且鉛和LPS聯(lián)合暴露加劇了極化程度，加速了神經(jīng)炎癥的發(fā)生。這與伍敏［19］的研究中LPS 刺激后TREM2 表達(dá)下降，BV-2 細(xì)胞M1標(biāo)志物表達(dá)增加一致。TREM2 的表達(dá)受到非編碼RNA的調(diào)控，本研究中鉛和LPS 單獨(dú)暴露可使miR-34a表達(dá)量升高，且聯(lián)合暴露后miR-34a表達(dá)明顯增加，推測(cè)鉛和LPS 暴露后miR-34a增加，從而調(diào)控TREM2 的表達(dá)下降。這Bhattacharjee 等［20］的研究在老年性黃斑變性中miR-34a靶向TREM2 mRNA 3’非編碼區(qū)，并下調(diào)小膠質(zhì)細(xì)胞中TREM2 的發(fā)現(xiàn)一致。

綜上所述，鉛和LPS 聯(lián)合暴露后小鼠炎癥損傷加劇，小膠質(zhì)細(xì)胞M1 標(biāo)志物表達(dá)增加，小膠質(zhì)細(xì)胞可能向M1 極化，推測(cè)其機(jī)制可能與miR-34a表達(dá)升高和TREM2表達(dá)降低有關(guān)。