冬蟲夏草內(nèi)生菌Penicillium crustosum的化學(xué)成分研究

巨 鳳，羅 凡，馮 丹，郭大樂，任 波，鄧 赟

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)-省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，成都 611137

冬蟲夏草(Ophiocordycepssinensis)是線形蟲草屬(Ophiocordyceps)真菌冬蟲夏草菌的子座與其寄主蝙蝠蛾科昆蟲的幼蟲尸體的復(fù)合體[1]，是分布在青藏高原高寒地區(qū)的特殊物種[2]。性平，味甘，歸肺、腎經(jīng)，具有化痰止血，補(bǔ)肺益腎等功效[3]。由于冬蟲夏草獨(dú)特的療效使市場(chǎng)需求量增加，天然蟲草被過度采挖，資源日益嚴(yán)峻，引起了人們的廣泛關(guān)注。而中藥內(nèi)生菌通過長(zhǎng)期的協(xié)同進(jìn)化，可產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的活性物質(zhì)[4]，如已有研究報(bào)道從冬蟲夏草中分離的中國(guó)被毛孢的菌絲體被研制成百令膠囊、蝙蝠蛾擬青霉的發(fā)酵菌絲體被開發(fā)為金水寶膠囊、蝙蝠蛾被毛孢被開發(fā)為至靈膠囊等[5]，因此冬蟲夏草中的內(nèi)生菌具有很大的研究潛力。

Penicilliumcrustosum為半知菌亞門半知菌綱殼霉目杯霉科(Discellaceae)青霉屬(Penicillium)真菌。文獻(xiàn)查閱P.crustosum次生代謝產(chǎn)物的研究集中在液體發(fā)酵，分離得到了一系列涵蓋硫代二酮哌嗪類、苯二氮卓類、吲哚二萜類、喹啉類等類型的生物堿類化合物以及具有clavatol單元和γ-丁內(nèi)酯單元的新穎結(jié)構(gòu)的聚酮類化合物[6-7]。He等[8]從P.crustosum次級(jí)代謝產(chǎn)物中分離得到了3個(gè)新的硫代二酮哌嗪和2個(gè)類似物，這兩個(gè)化合物分別在>8 μΜ和>16 μΜ的劑量下能促進(jìn)尼羅紅處理的斑馬魚的胃腸動(dòng)力，進(jìn)一步用阿托品做干擾表明化合物可能通過作用于膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)從而發(fā)揮功效；Liu等[9]從P.crustosum中分離得到一個(gè)新的多烯化合物、一個(gè)新的二酮哌嗪以及3個(gè)已知化合物，新的二酮哌嗪fusaperazine F對(duì)K562細(xì)胞(人慢性髓系白血病細(xì)胞)具有細(xì)胞毒作用，IC50值為12.7 μΜ；Feng等[10]從其液體發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到了一對(duì)新的對(duì)映異構(gòu)體及一個(gè)類似物和一個(gè)新的聚酮類化合物，其類似物對(duì)MV4-11(人髓性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞)細(xì)胞有輕微的抑制作用，IC50值為36.23 μΜ。而對(duì)P.crustosum的大米固體發(fā)酵產(chǎn)物研究較少，為進(jìn)一步豐富Penicilliumcrustosum代謝產(chǎn)物的化學(xué)信息和比較不同發(fā)酵方式對(duì)其次生代謝產(chǎn)物的影響，合理開發(fā)冬蟲夏草的資源，本文利用多種色譜分離技術(shù)和現(xiàn)代波譜技術(shù)，采用大米固體發(fā)酵對(duì)蟲草內(nèi)生菌Penicilliumcrustosum進(jìn)行培養(yǎng)并對(duì)其代謝產(chǎn)物進(jìn)行化學(xué)成分研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試劑

Finnigan-LCQDECA質(zhì)譜儀(美國(guó)賽默飛世爾公司)；Bruker Ascend 400核磁共振儀(TMS為內(nèi)標(biāo)，德國(guó)布魯克公司)；中壓層析柱(利穗科技(蘇州)有限公司)；NP7000型制備型高效液相色譜儀(江蘇漢邦儀器有限公司)；Axioscope 5生物顯微鏡(德國(guó)蔡司公司)；柱層析硅膠(300～400目)；薄層層析硅膠板(5×10 cm,G)(青島海洋化工廠)；HPLC柱(Pack ODS-A,5 um,250×10 mm)(日本YMC株式會(huì)社)。三氯甲烷、丙酮、石油醚、乙酸乙酯、甲醇(成都科龍化工試劑廠，均為分析純)。

1.2 菌種來源

新鮮中藥材采集于甘肅省夏河縣，由成都中醫(yī)藥大學(xué)蔣桂華教授鑒定為冬蟲夏草(Ophiocordycepssinensis)。從新鮮的冬蟲夏草中分離得到一株內(nèi)生真菌(編號(hào)：DCXC-20160503-XHX-20160908-2-1-1)，菌株在PDA平板上菌落前期為白色，然后變?yōu)榛揖G色，分生孢子梗較短，從菌絲垂直生出，分生孢子球形，直徑3.5～5.0 μm，光滑(見圖1)。再測(cè)得其ITS基因和TUB2基因得到的18S rRNA基因序列提交到NCBI的GenBank基因庫，經(jīng)BLAST比對(duì)，相似度分別為100%(NO.MK285663)和99.49%(NO.MN418444.1)鑒定為Penicilliumcrustosum。具體引物見表1。藥材樣品和P.crustosum菌種現(xiàn)保存于成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生化制藥實(shí)驗(yàn)室。

圖1 P.crustosum菌株形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of P.crustosum strain注：A：菌落；B：菌絲體；C：分生孢子。Note:A:Colony;B:Mycelia;C:Conidia.

表1 引物序列表

1.3 培養(yǎng)基

實(shí)驗(yàn)所用的培養(yǎng)基配方如下：PDA培養(yǎng)基：去皮土豆200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂15-20 g/L。液體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，可溶性淀粉8 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母膏2 g/L，氯化鈉2 g/L，碳酸鈣2 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，磷酸氫二鉀0.5 g/L，pH自然。大米固體培養(yǎng)基：大米40 g/瓶，蛋白胨2 g/瓶，自來水40 mL。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 大米固體發(fā)酵

菌種活化傳代，將在PDA培養(yǎng)基上純化得到的P.crustosum菌株接種至液體培養(yǎng)基中，于搖床培養(yǎng)4天(28 ℃、200 rpm)，得到種子液，再將其轉(zhuǎn)至滅菌后的300瓶發(fā)酵瓶中，瓶?jī)?nèi)裝有大米固體培養(yǎng)基，室溫下靜置培養(yǎng)40天。

2.2 發(fā)酵產(chǎn)物的提取與分離

發(fā)酵完畢后，得到的發(fā)酵產(chǎn)物甲醇超聲提取三次，減壓濃縮得到浸膏，再用乙酸乙酯萃取，三次后合并萃取液并濃縮得到乙酸乙酯部位浸膏224.0 g。將其經(jīng)正相硅膠柱層析，采用的洗脫體系為石油醚-丙酮(10∶0→1∶1)，收集洗脫液，TLC分析指導(dǎo)，合并得組分A(20.0 g)、B(5.5 g)、C(0.9 g)、D(29.4 g)、E(22.6 g)、F(43.5 g)、G(8.7 g)、H(2.1 g)。

組分C經(jīng)葡聚糖凝膠柱層析，由三氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脫，HPLC分析合并得5個(gè)亞組分C1、C2、C3、C4、C5。C2經(jīng)HPLC制備，甲醇-水(60∶40)洗脫得到化合物13(9.2 mg)。

組分D經(jīng)MCI柱層析，由甲醇-水(30∶70→100∶0)洗脫，HPLC分析合并得到20個(gè)亞組分D1、D2、D3～D20。D13經(jīng)甲醇重結(jié)晶得到化合物4(6.1 mg)。D15經(jīng)HPLC制備，甲醇-水(50∶50)洗脫得到化合物2(1.3 mg)、化合物3(2.6 mg)、化合物5(20.0 mg)。D20經(jīng)HPLC制備，甲醇-水(70∶30)洗脫得到化合物6(4.6 mg)。

組分E經(jīng)MCI柱層析，由甲醇-水(30∶70→100∶0)洗脫，HPLC分析合并得到29個(gè)亞組分E1、E2、E3～E29。E11經(jīng)葡聚糖凝膠柱層析，由三氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脫，HPLC分析合并得到組分E11-1、E11-2、E11-3、E11-4、E11-5。E11-5經(jīng)HPLC制備，甲醇-0.05%乙酸水(38∶72)洗脫得到化合物9(4.2 mg)。

組分F經(jīng)正相硅膠柱層析，由三氯甲烷-甲醇(100∶0→0∶100)洗脫，薄層分析指導(dǎo)，得到6個(gè)亞組分F1、F2、F3～ F6。F1經(jīng)HPLC制備，甲醇-水(85∶15)洗脫得到化合物16(3.2 mg)。F3經(jīng)MCI柱層析，由甲醇-水(20∶80→100∶0)洗脫，HPLC分析合并得到組分F3-1、F3-2、F3-3～F3-12。F3-3經(jīng)葡聚糖凝膠柱層析，由三氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脫，得到化合物10(4.2 mg)。

組分G經(jīng)MCI柱層析，由甲醇-水(10∶90→100∶0)洗脫，HPLC分析合并得到8個(gè)亞組分G1、G2、G3～G8。G1經(jīng)反相C8柱層析，由甲醇-水(5∶95→100∶0)洗脫，得到組分G1-1、G1-2、G1-3～G1-7。G1-2經(jīng)HPLC制備，甲醇-水(15∶85)洗脫得到化合物14(5.0 mg)。G1-3經(jīng)HPLC制備，甲醇-水(15∶85)洗脫得到化合物11(2.3 mg)、化合物12(3.1 mg)。G2經(jīng)甲醇重結(jié)晶，得到化合物15(20.0 mg)。G8經(jīng)葡聚糖凝膠柱層析，由三氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脫，HPLC分析合并得到組分G8-1、G8-2、G8-3～G8-5。G8-4經(jīng)HPLC制備，甲醇-水(60∶40)洗脫得到化合物1(11.0 mg)、化合物7(3.2 mg)、化合物8(6.7 mg)。

2.3 化合物的抑菌活性測(cè)試(濾紙片法)

對(duì)化合物1～16進(jìn)行抑菌活性測(cè)驗(yàn)。測(cè)試細(xì)菌菌株為：革蘭氏陽性菌枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisATCC 25952)、革蘭氏陰性菌大腸桿菌(EscherichiacoliATCC 9372)。測(cè)試真菌菌株為：香蕉炭疽病菌(ColletotrichummusaeACCC 31244)、馬鈴薯炭疽病菌(ColletotrichumcoccodesACCC 36067)。采用的方法是藥敏片擴(kuò)散法。抑制細(xì)菌試驗(yàn)中，硫酸鏈霉素和甲醇分別作為陽性對(duì)照組和陰性對(duì)照組；抑制真菌試驗(yàn)中，放線菌酮和甲醇、無菌水分別作為陽性對(duì)照組和陰性對(duì)照組。

將細(xì)菌菌株在LB培養(yǎng)皿中37 °C下培養(yǎng)24 h進(jìn)行活化，活化后加入無菌水配置成1.0 ×106CFU/mL的菌液，吸取1 mL菌液涂布到LB培養(yǎng)皿中；將真菌菌株在PDA培養(yǎng)皿中28 °C下培養(yǎng)48 h進(jìn)行活化，活化后加入無菌水配置成1.0 ×106CFU/mL的菌液，吸取1 mL菌液涂布到PDA培養(yǎng)皿中。硫酸鏈霉素和化合物用甲醇配置為400 μg/mL的溶液，放線菌酮用無菌水配置為400 μg/mL的溶液備用。每個(gè)藥敏片加6 μL樣品，待溶劑揮干后，放置在培養(yǎng)皿中。細(xì)菌培養(yǎng)皿在37 °C中生長(zhǎng)12 h后測(cè)量抑菌圈直徑，真菌培養(yǎng)皿在28 °C中生長(zhǎng)48 h后測(cè)量抑菌圈直徑。每組實(shí)驗(yàn)平行3次求得平均值。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1黃色油狀(CHCl3)；ESI-MS：m/z307 [M+Na]+；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：0.95(3H，d，J= 6.7 Hz，H-11)，0.99(3H，d，J= 6.5 Hz，H-10)，1.56～1.51(2H，m，H-8)，1.71(1H，ddt，J= 14.9，13.1，6.6 Hz，H-9)，1.97(3H，s，H-13)，2.03～1.98(2H，m，H-4)，2.09～2.03(2H，m，H-4)，2.24～2.19(2H，m，H-3)，3.62(2H，ddd，J= 9.7，7.4，5.8 Hz，H-5)，3.72(3H，s，H-14)，3.83(2H，dt，J= 9.8，6.9 Hz，H-5)，4.49(1H，dd，J= 8.4，4.8 Hz，H-2)，4.82(2H，td，J= 8.9，5.2 Hz，H-7)，6.29(1H，d，J= 8.3 Hz，-NH)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：22.1(C-11)，23.3(C-13)，23.5(C-10)，24.8(C-9)，25.0(C-4)，29.2(C-3)，42.0(C-8)，47.0(C-5)，49.1(C-7)，52.4(C-14)，58.9(C-2)，170.1(C-12)，171.7(C-6)，172.5(C-1)。查閱文獻(xiàn)[11]顯示，該化合物與合成產(chǎn)物Ac-Leu-Pro-OCH3的波譜數(shù)據(jù)基本一致，該化合物的結(jié)構(gòu)得以確定(圖2)。

化合物2黃色粉末(CHCl3)；ESI-MS：m/z279 [M+Na]+；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：3.51(3H，s，H-17)，6.72(1H，s，H-10)，6.97(1H，d，J= 8.0 Hz，H-9)，7.26(1H，m，H-7)，7.31～7.29(3H，m，H-12，14，16)，7.40～7.38(2H，m，H-13,15)，7.43(1H，td，J= 7.4，1.5 Hz，H-8)，7.95(1H，d，J= 7.6 Hz，H-6)，8.36(1H，s，H-1)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：37.9(C-17)，120.8(C-9)，125.6(C-7)，127.1(C-5b)，128.8(C-13,15)，129.0(C-12,16)，129.6(C-14)，131.8(C-6)，132.3(C-11)，132.5(C-8)，133.1(C-3)，133.3(C-10)，134.4(C-9b)，166.5(C-5)，167.9(C-2)。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道的核磁數(shù)據(jù)基本一致，故確定該化合物為(E)-3-benzylidene-4-methyl-3,4-dihydro-1H-benzo[e][1,4]diazepine-2,5-dione。

化合物3黃色粉末(CHCl3)；ESI-MS：m/z279 [M+H]+；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：3.19(3H，s，H-17)，6.94(1H，d，J= 8.0 Hz，H-9)，6.95(1H，s，H-10)，7.29～7.26(1H，m，H-7)，7.40～7.34(5H，m，H-12～16)，7.47(1H，td，J= 7.9，1.5 Hz，H-8)，7.62(1H，s，1-NH)，8.02(1H，dd，J= 7.9，1.4 Hz，H-6)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：36.2(C-17)，120.4(C-9a)，125.5(C-7)，125.8(C-5b)，129.2(C-12，14，16)，129.6(C-13，15)，130.0.(C-11)，131.7(C-6，10)，132.9(C-8)，133.6(C-3)，135.6(C-9b)，166.3(C-5a)，171.2(C-2)。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道的核磁數(shù)據(jù)基本一致，故確定該化合物為(Z)-3-benzylidene-4-methyl-3,4-dihydro-1H-benzo[e][1,4]diazepine-2,5-dione。

化合物4無色晶體(MeOH)；ESI-MS：m/z295 [M+H]+；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：3.24(3H，s，H-17)，4.02(1H，s，H-10)，6.65(2H，d，J= 6.3 Hz，H-12，16)，7.09(1H，m，H-14)，7.15(1H，m，H-9)，7.22(2H，d，J= 7.6 Hz，H-13，15)，7.28(1H，m，H-6)，7.39(1H，m，H-8)，7.51(1H，m，H-7)，8.60(1H，s，H-1)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：31.6(C-17)，65.0(C-10)，70.4(C-3)，120.8(C-9a)，125.7(C-7)，126.2(C-13，15)，128.4(C-12，C-16)，129.4(C-14)，130.3(C-11)，131.9(C-8)，132.8(C-6)，134.0(C-9b)，166.0(C-5)，167.5(C-2)。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13,14]報(bào)道的核磁數(shù)據(jù)基本一致，故確定該化合物為cyclopenin。

化合物5無色粉末(MeOH)；ESI-MS：m/z281 [M+H]+；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：2.84(1H，dd，J= 13.6，6.0 Hz，H-10a，A-type)，2.71(1H，m，H-10a，B-type)，3.14(3H，s，H-17，A-type)，2.91(3H，s，H-17，B-type)，3.49(1H，dd，J= 12.0，6.0 Hz，H-10，A-type)，3.21(1H，dd，J= 14.4，6.4 Hz，H-10，B-type)，4.35(1H，t，J= 7.1 Hz，H-3，A-type)，4.26(1H，dd，J= 10.4，6.2 Hz，H-3，B-type)，7.01(2H，m，H-13，15，A-type)，7.01(2H，m，H-13，15，B-type)，7.06(1H，d，J= 8.0 Hz，H-9，A-type)，6.96(1H，d，J= 8.0 Hz，H-9，B-type)，7.25～7.17(3H，m，H-12，14，16，A-type，B-type)，7.30(2H，dd，J= 18.6，4.6 Hz，H-7，A-type，B-type)，7.51(1H，t，J= 7.5 Hz，H-8，A-type)，7.44(1H，t，J= 7.6 Hz，H-8，B-type)，8.10(1H，d，J= 7.7 Hz，H-6，A-type)，7.95(1H，d，J= 7.7 Hz，H-6，B-type)，9.48(1H，s，H-1，A-type)，9.16(1H，s，H-1，B-type)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：34.7(C-10，A-type)，32.3(C-10，B-type)，39.8(C-17，A-type)，29.4(C-17，B-type)，68.6(C-3，A-type)，56.4(C-3，B-type)，120.9(C-9，A-type)，120.3(C-9，B-type)，125.4(C-7，A-type)，125.0(C-7，B-type)，127.4(C-5a，A-type)，127.0(C-5a，B-type)，128.9(C-14，A-type)，128.8(C-14，B-type)，129.0(C-12，16，A-type)，129.0(C-12，16，B-type)，129.1(C-13，15，A-type)，129.1(C-13，15，B-type)，131.9(C-6，A-type)，131.5(C-6，B-type)，132.8(C-8，A-type)，132.5(C-8，B-type)，135.7(C-9a，A-type)，134.8(C-9a，B-type)，136.5(C-11，A-type)，135.7(C-11，B-type)，168.6(C-5，A-type)，166.1(C-5，B-type)，171.8(C-2，A-type)，170.3(C-2，B-type)。該化合物由于N-4的構(gòu)型(孤對(duì)電子)上下翻轉(zhuǎn)，導(dǎo)致七元環(huán)出現(xiàn)構(gòu)象不同的異構(gòu)體，對(duì)比核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道的核磁數(shù)據(jù)基本一致，故確定該化合物為(3S)-1,4-benzodiazepine-2,5-diones。

化合物6無色針晶(MeOH)；ESI-MS：m/z480 [M+H]+；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：1.01(3H，s，12c-CH3)，1.26(3H，s，H-2′)，1.29(3H，s，H-3′)，1.32(3H，s，12b-CH3)，1.43(1H，dd，J= 12.4，3.9 Hz，H-13b)，1.62～1.56(1H，m，H-5b)，1.76～1.71(1H，m，H-6b)，1.96～1.90(1H，m，H-14b)，2.05～2.01(2H，m，H-5a，6a)，2.08(3H，s，3-COOCH3)，2.30～2.22(1H，m，H-14a)，2.44(1H，dd，J= 13.0，11.0 Hz，H-7b)，2.71(1H，d，J= 5.9 Hz，H-7a)，2.74(1H，d，J= 6.1 Hz，H-6a)，2.88～2.79(1H，m，H-13a)，3.34(2H，m，H-2，1′)，4.68～4.61(1H，m，H-14a)，5.24(1H，dt，J= 5.8，1.8 Hz，H-3)，5.75(1H，dd，J= 5.8，1.4 Hz，H-4)，7.07(2H，dd，J= 5.7，2.6 Hz，H-9，10)，7.32～7.28(1H，m，H-11)，7.32～7.28(1H，m，H-11)，7.45～7.42(1H，m，H-8)，7.78(1H，s，H-12)；13C NMR(400 MHz，CDCl3)δ：16.4(12b-CH3)，20.1(12c-CH3)，21.0(C-6)，21.5(COOCH3)，26.1(C-2′)，26.5(C-3′)，27.5(C-7)，28.3(C-13)，28.4(C-14)，34.8(C-5)，43.1(C-12c)，49.8(C-6a)，50.9(C-12b)，65.6(C-3)，71.8(C-1′)，74.1(C-14a)，77.9(C-4b)，81.2(C-2)，111.6(C-11)，114.8(C-4)，117.5(C-7a)，118.6(C-8)，119.6(C-9)，120.6(C-10)，125.3(C-7b)，139.8(C-11a)，150.4(C-4a)，152.4(C-12a)，170.9(3-COOCH3)。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道的核磁數(shù)據(jù)基本一致，故確定該化合物為O-acetyl-β-paxitriol。

化合物7黃色油狀(CHCl3)；ESI-MS：m/z388 [M-H]-；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：1.04(3H，s，H-21)，1.16(3H，s，H-22)，2.48(1H，t，J= 11.9 Hz，H-11)，2.61(1H，dd，J= 12.4，6.0 Hz，H-11)，4.07(1H，dd，J= 11.3，5.9 Hz，H-11a)，5.10(1H，s，H-6)，5.10(1H，d，J= 9.7 Hz，H-20)，5.15(1H，d，J= 10.5 Hz，H-20)，5.65(1H，s，H-5a)，5.99(1H，dd，J= 17.3，10.8 Hz，H-19)，6.33(1H，s，H-12)，6.61(1H，J= 7.8 Hz，H-7)，6.78(1H，t，J= 7.3 Hz，H-8)，7.11(1H，t，J= 7.6 Hz，H-8)，7.19(1H，d，J= 7.5 Hz，H-10)，7.30(1H，s，H-15)，7.74(1H，s，H-17)，9.25(1H，s，H-2)，9.25(1H，s，H-16)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：22.6(C-21)，23.0(C-22)，36.9(C-11)，41.0(C-18)，59.0(C-11a)，61.7(C-10b)，78.6(C-5a)，109.2(C-12)，111.3(C-7)，114.7(C-20)，119.3(C-9)，122.0(C-3)，125.3(C-10)，125.6(C-13)，128.7(C-10a)，129.3(C-8)，134.9(C-17)，136.8(C-15)，143.5(C-19)，150.0(C-6a)，159.5(C-4)，167.0(C-1)。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道的核磁數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定此化合物為roquefortine C。

化合物8黃色油狀(CHCl3)；ESI-MS：m/z388 [M-H]-；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：1.04(3H，s，H-21)，1.15(3H，s，H-22)，2.48(1H，t，J= 11.9 Hz，H-11)，2.61(1H，dd，J= 12.2，5.8 Hz，H-11)，4.12(1H，dd，J= 11.5，5.8 Hz，H-11a)，4.95(1H，s，H-6)，5.09(1H，d，J= 17.0 Hz，H-20)，5.13(1H，d，J= 9.7 Hz，H-20)，5.66(1H，s，H-5a)，5.99(1H，dd，J= 17.3，10.8 Hz，H-19)，6.58(1H，d，J= 7.8 Hz，H-7)，6.71(1H，s，H-12)，6.74(1H，dd，J= 13.2，5.9 Hz，H-8)，7.09(1H，t，J= 7.6 Hz，H-9)，7.16(1H，d，J= 7.5 Hz，H-10)，7.18(1H，s，H-17)，7.68(1H，s，H-15)，9.69(1H，s，H-16)，11.61(1H，s，H-2)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：22.6(C-21)，23.1(C-22)，37.4(C-11)，41.1(C-18)，59.3(C-11a)，61.8(C-10b)，78.2(C-5a)，105.0(C-12)，109.1(C-7)，114.7(C-20)，117.2(C-17)，119.0(C-9)，125.4(C-10)，126.9(C-3)，129.0(C-10a)，129.1(C-8)，135.2(C-15)，137.7(C-13)，143.7(C-19)，150.5(C-6a)，158.6(C-4)，165.6(C-1)。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道的核磁數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定此化合物為isoroquefortine C。

化合物9白色粉末(MeOH)；ESI-MSm/z：278 [M+Na]+；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：4.59(1H，s，H-3)，6.96(1H，d，J= 7.9 Hz，H-9)，7.11(1H，t，J= 7.5 Hz，H-7)，7.22(3H，d，J= 6.5 Hz，H-13，14，15)，7.32～7.27(1H，m，H-8)，7.35(2H，d，J= 7.6 Hz，H-12，16)，7.56(1H，d，J= 7.7 Hz，H-6)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：76.6(C-3)，78.3(C-4)，116.9(C-9)，124.9(C-7)，127.6(C-6)，128.6(C-13，14，15)，128.7(C-12，16)，130.1(C-8)，132.4(C-5)，136.6(C-10)，141.4(C-11)，172.6(C-2)。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報(bào)道的核磁數(shù)據(jù)基本一致，故確定該化合物為aflaquinolone G。

化合物10白色粉末(MeOH)；ESI-MS：m/z260 [M+Na]+；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：7.07(2H，dt，J= 14.9，7.8 Hz，H-6，7)，7.34(4H，m，H-8，9，12，16)，7.44(1H，t，J= 7.5 Hz，H-14)，7.51(2H，t，J= 7.5 Hz，H-13，15)，9.21(1H，s，3-OH)，12.23(1H，s，1-NH)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：115.2(C-9)，120.9(C-5)，122.1(C-7)，123.9(C-4)，124.3(C-6)，126.4(C-8)，127.6(C-14)，128.3(C-13，C-15)，129.8(C-12，C-16)，133.2(C-3)，133.7(C-11)，142.4(C-10)，158.3(C-2)。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]報(bào)道的核磁數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定此化合物為3-hydroxy-4-phenylquinolin-2(1H)-one。

化合物11白色粉末(MeOH)；ESI-MS：m/z254 [M+H]+；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：6.72(1H，d，J= 5.1 Hz，H-16)，6.73(1H，d，J= 4.8 Hz，H-15)，6.83(1H，dd，J= 5.1，4.2 Hz，H-14)，7.09～7.05(1H，m，H-6)，7.11(1H，d，J= 7.8 Hz，H-7)，7.29(1H，s，H-12)，7.32(1H，m，H-5)，7.34(1H，d，J= 7.1 Hz，H-8)，9.12(1H，s，13-OH)，9.51(1H，s，1-NH)，12.19(1H，s，3-OH)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：114.6(C-14)，115.2(C-8)，116.7(C-16)，120.4(C-15)，120.9(C-10)，122.1(C-6)，124.1(C-11)，124.5(C-7)，126.4(C-5)，129.4(C-12)，133.1(C-9)，134.9(C-4)，142.2(C-3)，157.3(C-13)，158.3(C-2)。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]報(bào)道的核磁數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定此化合物為viridicatol。

化合物12白色粉末(MeOH)；ESI-MS：m/z299 [M+Na]+；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：1.44(1H，ddd，J= 12.9，11.8，4.7 Hz，H-5b)，2.12(1H，dd，J= 13.0，5.8 Hz，H-5a)，3.12(1H，d，J= 5.0 Hz，H-10)，3.78(2H，m，H-3)，4.34(1H，t，J= 4.7 Hz，H-6)，4.41(1H，ddd，J= 11.7，5.9，1.8 Hz，H-9)，4.47～4.44(1H，m，H-4)，6.78～6.74(2H，m，H-12，16)，7.12～7.08(2H，m，H-12，15)；13C NMR(400 MHz，CD3OD)δ：37.5(C-10)，38.9(C-5)，55.3(C-3)，57.8(C-9)，58.3(C-6)，68.5(C-4)，116.2(C-13,15)，127.7(C-11)，132.1(C-12,16)，157.7(C-14)，167.1(C-7)，171.1(C-1)。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]報(bào)道核磁數(shù)據(jù)基本一致，故確定該化合物為環(huán)(絡(luò)氨酸-脯氨酸)。

化合物13黃色粉末(MeOH)；ESI-MS：m/z152 [M+H]+；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：3.63(2H，s，H-7)，7.34～7.25(5H，m，H-2～6)，8.31(1H，br s，-NH)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：41.3(C-7)，127.5(C-4)，128.8(C-3，5)，129.5(C-2，6)，133.5(C-1)，178.0(C-8)。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[22]報(bào)道的核磁數(shù)據(jù)基本一致，故確定該化合物為N-苯甲基氨基甲酸。

化合物14無色油狀(MeOH)；ESI-MS：m/z290 [M+Na]+；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：3.81(1H，dd，J= 12.5，2.7 Hz，H-9b)，3.95(1H，dd，J= 12.5，2.5 Hz，H-9a)，4.23(1H，m，H-8)，4.39(1H，dd，J= 5.1，2.6 Hz，H-7)，4.82～4.77(1H，m，H-6)，6.03(1H，d，J= 6.4 Hz，H-5)，8.24(1H，s，H-1)，8.36(1H，s，H-4)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：63.5(C-9)，72.7(C-7)，75.5(C-6)，88.2(C-8)，91.3(C-5)，142.0(C-4)，150.1(C-3)，153.5(C-1)，157.6(C-2)。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[23]報(bào)道的核磁數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定此化合物為(5S,6R,7S,8R)-5-amino-(2Z,4Z)-1,2,3-trihydroxybuta-2,4-dienyloxy-pentane-6,7,8,9-tetraol。

化合物15無色針晶(MeOH)；ESI-MS：m/z181 [M+H]+；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：2.11(3H，s，3′-CH3)，2.22(3H，s，5′-CH3)，2.56(3H，s，H-1)，7.48(1H，s，H-6′)，12.88(1H，s，2′-OH)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：7.9(3′-CH3)，16.3(5′-CH3)，26.2(C-1)，111.8(C-1′)，113.8(C-3′)，117.2(C-5′)，131.2(C-6′)，162.0(C-2′)，162.3(C-4′)，204.4(C-2)。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[24]報(bào)道的核磁數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定此化合物為2′，4′-二羥基-3′，5′-二甲基苯乙酮。

化合物16黃色油狀物(MeOH)；ESI-MS：m/z288 [M+H]+；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：0.96(3H，s，H-19)，1.05(3H，s，H-20)，1.16～1.19(1H，m，H-7b)，1.18(3H，s，H-17)，1.20(3H，d，J= 7.2 Hz，H-16)，1.28(3H，s，H-18)，1.39(1H，d，J= 5.3 Hz，H-15)，1.52～1.47(1H，m，H-13b)，1.59～1.54(1H，m，H-13a)，1.60～1.54(1H，m，H-7a)，1.66～1.62(2H，m，H-10b，12b)，1.69～1.66(2H，m，H-8b，12a)，1.98(1H，d，J= 14.6 Hz，H-10a)，2.09(1H，dd，J= 11.5，5.9 Hz，H-8)，2.71～2.64(1H，m，H-4)，2.25(1H，dd，J= 9.3，5.3 Hz，H-6)，5.97(1H，d，J= 10.0 Hz，H-2)，6.94(1H，dd，J= 10.0，5.9 Hz，H-3)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：18.9(C-16)，21.1(C-17)，27.3(C-19)，32.7(C-18)，34.5(C-7)，37.7(C-4)，39.0(C-12)，39.2(C-8)，40.9(C-13)，42.9(C-14)，48.1(C-10)，52.4(C-11)，56.2(C-6)，57.6(C-9)，59.1(C-5)，73.8(C-15)，127.6(C-2)，154.6(C-3)，206.2(C-1)。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[25]報(bào)道的核磁數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定此化合物為conidiogenone B。

圖2 化合物1～16的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.2 Chemical structure of compounds 1-16

3.2 抑菌測(cè)試結(jié)果

抑菌測(cè)試結(jié)果顯示，從蟲草內(nèi)生菌分離得到的化合物1～16對(duì)測(cè)試的菌株均無明顯抑制圈，沒有明顯的活性。

4 討論

本文從冬蟲夏草內(nèi)生菌P.crustosum的大米固體發(fā)酵物中分離得到了16個(gè)化合物，主要為苯二氮卓類、吲哚二萜類和喹諾酮類生物堿，其中化合物1和2是新的天然產(chǎn)物，化合物1～4、6、9、12～14和16為首次從該真菌中分離得到。與課題組前期得到的結(jié)果類似[26]。已有報(bào)道表明生物堿類具有廣泛藥理活性，如抗腫瘤、消炎鎮(zhèn)痛等，本文對(duì)分離得到的化合物進(jìn)行了初步的抑菌測(cè)試但均沒有明顯的抑制活性，推測(cè)是試驗(yàn)菌株的選擇類型較少或者是該類化合物具有其他的生物活性。文獻(xiàn)表明化合物4對(duì)流感神經(jīng)氨酸酶有很強(qiáng)的抑制作用，IC50值為5.02 μM[27]；化合物7對(duì)Balanusamphitrite、Bugulaneritina有抑制作用，具防污抗菌活性，EC50分別為6.2、2.1 μg/mL[28]。這提示我們可以從其他角度來探討此類化合物的生物活性，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的開展提供參考。

Penicilliumcrustosum的液體培養(yǎng)和大米固體培養(yǎng)的代謝產(chǎn)物類型差異較大，液體培養(yǎng)產(chǎn)物中含有較多硫代二酮哌嗪類的化合物，研究報(bào)道這些化合物因?yàn)槎蜴I的存在而具有較強(qiáng)的毒性，而大米固體發(fā)酵物中的生物堿都不具有硫原子，可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)基中沒有加入相關(guān)的元素。因此在進(jìn)行中藥內(nèi)生菌的次生代謝產(chǎn)物研究時(shí)，可以通過改變培養(yǎng)方式從而得到結(jié)構(gòu)新穎的生物活性化合物。