雷公藤莖中的二萜類成分及生物活性研究

周曉瓊，饒凱瑞，陳宣欽

昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，昆明 650500

雷公藤(TripterygiumwilfordiiHook.f.)是衛(wèi)矛科雷公藤屬植物，又名水莽草，斷腸草等，多分布于長(zhǎng)江流域以南及西南地區(qū)。雷公藤始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其味苦、辛，性寒，歸肝、腎二經(jīng)，具有祛風(fēng)除濕、殺蟲(chóng)解毒、消腫止痛和舒筋活絡(luò)的功效[1]。雷公藤作為一種常用中藥，多以根入藥，已開(kāi)發(fā)成多種雷公藤制劑，如雷公藤多苷片，雷公藤片，雷公藤總萜片和雷公藤雙層片等[2]，這些雷公藤制劑主要用于免疫和炎性疾病的治療，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，紅斑狼瘡和潰瘍性結(jié)腸炎等[3]。此外，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)雷公藤還具有抗腫瘤活性，其在腫瘤治療中具有很好的應(yīng)用前景。

至今為止，國(guó)內(nèi)外科研工作者已從雷公藤屬中分離鑒定了500多個(gè)化合物，主要為二萜，三萜和倍半萜，其中二萜類成分骨架類型多樣，包括松香烷型、海松烷型、對(duì)映貝殼杉烷型和其他類型。松香烷型三元環(huán)氧二萜內(nèi)酯類化合物，如雷公藤甲素及其衍生物一直以來(lái)被認(rèn)為是雷公藤二萜類成分中抗炎和抗腫瘤的主要活性成分[4]。然而，雷公藤甲素及其衍生物的含量低且多數(shù)具有較強(qiáng)的肝和腎毒性，這極大的限制了雷公藤的應(yīng)用和開(kāi)發(fā)。在雷公藤中，除雷公藤甲素及其衍生物外，是否存在其他低毒高效的抗炎和抗腫瘤活性二萜類成分，值得進(jìn)一步研究。另一方面，有關(guān)雷公藤化學(xué)成分的研究主要集中在其主要藥用部位根中，對(duì)其莖的化學(xué)成分研究不夠深入，查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)從雷公藤莖或者莖和葉的混合提取物中分離到的化合物目前共24個(gè)，其中二萜類化合物有9個(gè)。鑒于此，本研究采用各種色譜和波譜技術(shù)對(duì)雷公藤莖中的二萜類成分進(jìn)行了系統(tǒng)的分離和鑒定，并對(duì)分離得到的化合物進(jìn)行了體外抗炎和抗腫瘤活性評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 藥材

干燥的雷公藤莖于2019年7月購(gòu)自于昆明市新螺螄灣藥材市場(chǎng)，并由昆明理工大學(xué)陳宣欽副教授鑒定為雷公藤(Tripterygiumwilfordii)，憑證標(biāo)本(KUMST20190716)存放于昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院資源藥物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 儀器與試劑

拌樣硅膠(80～100目)、柱色譜用硅膠(200～300目)、十八烷基硅膠(ODS-C18，75 μmol，日本YMC公司)和羥丙基葡聚糖凝膠(Sephadex LH-20，20～100 μmol，Pharmacia公司)；薄層色譜(TLC)用硅膠板(G和GF254，青島海洋化工廠)；色譜純?cè)噭┘状己鸵译?Fisher公司)；顯色劑5% H2SO4-EtOH溶液(噴灑后適當(dāng)加熱)；胎牛血清(FBS，Hyclone公司)；基礎(chǔ)培養(yǎng)基(DMEM，Thermofisher公司)；二甲基亞砜(DMSO，Solarbio公司)；小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7(中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所)和脂多糖(LPS，sigma公司)；Hela細(xì)胞株(中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所)；4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES，Biosharp公司)；青鏈霉素混合液(Solarbio公司)；四甲基偶氮唑鹽(MTT，Solarbio公司)；一氧化氮合成酶抑制劑(L-NMMA，Beyo Time公司)。

Bruker DRX-500和Bruker AV Ⅲ-600核磁共振儀(德國(guó)，Bruker BioSpin Group)；UV1102Ⅱ紫外分光光度計(jì)(Betop Scientific)；高分辨質(zhì)譜儀(Agilent 6530 LC/MSD)；Jasco DIP-370數(shù)字偏振儀(日本，JASCO Corporation)；Agilent 1200高效液相色譜儀(Agilent公司)，配備ZORBAX SB-C18反相柱和二極管陣列檢測(cè)器(Agilent公司)；Spectra Max M2多功能讀板機(jī)(美國(guó)，Moleccular Devices 公司)和CO2恒溫培養(yǎng)箱(Thermofisher公司)。

1.3 方法

1.3.1 提取與分離

雷公藤莖50 kg粉碎，采用95%乙醇浸泡提取3次，每次60 L，每次24 h，濃縮后，加適量水溶解，并依次用石油醚，乙酸乙酯和正丁醇分別萃取3次。

乙酸乙酯部位(672 g)經(jīng)硅膠柱層析(石油醚∶乙酸乙酯，5∶1和2∶1)進(jìn)行劃段，得到4個(gè)部分Fr.1～4。Fr.1(29 g)通過(guò)硅膠柱層析(石油醚∶乙酸乙酯，50∶1、30∶1和20∶1)劃分為2個(gè)組分Fr.1.1～1.2。Fr.1.1(2.1 g)經(jīng)過(guò)ODS-C18反相中壓柱層析(甲醇∶水，70%→100%)分為2個(gè)組分Fr.1.1.1～1.1.2。Fr.1.1.1(90 mg)采用硅膠柱層析(石油醚∶乙酸乙酯，11∶1)進(jìn)行純化得到化合物4(10.7 mg)。Fr.1.2(18 g)經(jīng)過(guò)ODS-C18反相中壓柱層析(甲醇∶水，60%→100%)劃分為Fr.1.2.1～1.2.4共4個(gè)組分。Fr.1.2.1(4.09 g)通過(guò)硅膠柱層析(石油醚∶乙酸乙酯，30∶1、20∶1和10∶1)得到Fr.1.2.1.1～1.2.1.4共4個(gè)組分，其中Fr.1.2.1.1(62.8 mg)經(jīng)過(guò)硅膠柱層析(石油醚∶二氯甲烷，1∶1)分離純化得到化合物2(34.3 mg)。Fr.1.2.1.2(45 mg)通過(guò)硅膠柱層析(石油醚∶二氯甲烷，1.5∶1和1∶1)分離純化得到化合物5(6.7 mg)。Fr.1.2.1.3(420.1 mg)采用硅膠柱層析(石油醚∶二氯甲烷，1.5∶1和1∶1)得到2個(gè)部分Fr.1.2.1.3.1～1.2.1.3.2。Fr.1.2.1.3.1(63 mg)經(jīng)過(guò)硅膠柱層析(石油醚∶乙酸乙酯，10∶1)分離純化得化合物9(9.7 mg)。Fr.1.2.1.3.2(382.1 mg)采用硅膠柱層析(石油醚∶異丙醇，100∶1)分離純化得化合物11(58.8 mg)。Fr.1.2.1.4(54.9 mg)通過(guò)硅膠柱層析(石油醚∶乙酸乙酯，12∶1)分離純化得化合物12(5.0 mg)。Fr.1.2.2(548.9 mg)采用硅膠柱層析(石油醚∶氯仿，1∶10；氯仿∶乙酸乙酯，40∶1和30∶1)洗脫得到化合物19(26.4 mg)。Fr.1.2.3(618.2 mg)采用硅膠柱層析(二氯甲烷∶乙酸乙酯，10∶1)得到化合物16(121.9 mg)。Fr.1.2.4(2.45 g)經(jīng)過(guò)硅膠柱層析(石油醚∶二氯甲烷，1∶1)洗脫得2個(gè)部分Fr.1.2.4.1～1.2.4.2。Fr.1.2.4.1(36.7 mg)采用硅膠柱層析(石油醚∶二氯甲烷，2∶1)得到化合物10(1.3 mg)。Fr.1.2.4.2(328.7 mg)經(jīng)過(guò)硅膠柱層析(石油醚∶丙酮，35∶1)得到化合物17(23 mg)和化合物18(28.3 mg)。

Fr.2(49.48 g)經(jīng)過(guò)ODS-C18反相中壓柱層析(甲醇∶水，60%→100%)得到3個(gè)組分Fr.2.1～2.3。Fr.2.1(4.6 g)采用硅膠柱層析(石油醚∶乙酸乙酯，7∶1)洗脫得到2個(gè)組分Fr.2.1.1～2.1.2。Fr.2.1.1(288.8 mg)采用硅膠柱層析(石油醚∶乙酸乙酯，7∶1)分離純化得化合物6(8.1 mg)和化合物7(12 mg)。Fr.2.1.2(943.8 mg)經(jīng)過(guò)Sephadex LH-20(氯仿∶甲醇，1∶1)分離得到化合物20(29 mg)和2個(gè)組分Fr.2.1.2.1～2.1.2.2。Fr.2.1.2.1(100 mg)通過(guò)半制備HPLC(乙腈∶水，28%，tR= 9.2 min)得到化合物8(2.2 mg)。Fr.2.1.2.2(400 mg)采用硅膠柱層析(二氯甲烷∶乙酸乙酯，80∶1)得到化合物13(4.8 mg)。Fr.2.2(8.2 g)經(jīng)過(guò)硅膠柱層析(二氯甲烷∶乙酸乙酯，120∶1和30∶1)分成2個(gè)部分 Fr.2.2.1～2.2.2。Fr.2.2.1(582.5 mg)采用硅膠柱層析(石油醚∶異丙醇，30∶1)分為2個(gè)部分Fr.2.2.1.1～2.2.1.2，其中Fr.2.2.1.1(124.2 mg)采用硅膠柱層析(石油醚∶二氯甲烷，1∶10)洗脫得到化合物1(2 mg)，F(xiàn)r.2.2.1.2(75 mg)采用硅膠柱層析(二氯甲烷∶乙酸乙酯，200∶1)分離純化得到化合物14(24 mg)和化合物15(22.4 mg)。Fr.2.2.2(449.9 mg)經(jīng)過(guò)硅膠柱層析(石油醚∶異丙醇，50∶1)劃分為 Fr.2.2.2.1～2.2.2.2共2個(gè)部分。Fr.2.2.2.2(107 mg)采用硅膠柱層析(二氯甲烷∶乙酸乙酯，200∶1)分離，得到化合物3(15 mg)。

1.3.2 抗炎活性和毒性篩選

1.3.2.1 巨噬細(xì)胞RAW 264.7的培養(yǎng)

RAW 264.7細(xì)胞使用DMEM培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素雙抗溶液)，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行恒溫培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)的狀態(tài)，同時(shí)DMEM培養(yǎng)液需要定期進(jìn)行替換，直到細(xì)胞生長(zhǎng)良好，覆蓋率達(dá)90%以上對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代。

1.3.2.2 Griess試劑的配制

Griess Ⅰ液：在1.0 g無(wú)水對(duì)氨基苯磺酸中加入6 mL的磷酸和適量的超純水，進(jìn)行水浴加熱使其全部溶解，再定容至100 mL，進(jìn)行除雜除菌后，于4 ℃的條件貯存?zhèn)溆谩?/p>

Griess Ⅱ液：稱取0.1 g的N-1-萘基乙二胺二鹽酸鹽同上述方法配制。

1.3.2.3 Griees法檢測(cè)體外抗炎活性

把對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW 264.7細(xì)胞，按7×104濃度稀釋，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(每孔加入100 μL細(xì)胞懸液)，再置于37 ℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，把貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞分別分為空白組、模型組(1 μg/mL脂多糖LPS)、實(shí)驗(yàn)組(待測(cè)物+1 μg/mL LPS)和陽(yáng)性對(duì)照組(一氧化氮合成酶抑制劑L-NMMA+1 μg/mL LPS)等4個(gè)組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。其中，待測(cè)物的濃度分別為12.5、6.25、3.125、1.56 和0.78 μmol/L；繼續(xù)培養(yǎng)24 h之后，吸取各孔細(xì)胞的上層清液加入50 μL的Griess Ⅰ溶液并用搖床振搖10 min,之后再加入50 μL的Griess Ⅱ溶液并在避光條件下振搖10 min，最后用酶標(biāo)儀檢測(cè)其在540 nm處的吸光值，使用IBM SPSS Statistics 20計(jì)算半數(shù)抑制濃度IC50值。

1.3.2.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞毒性

把濃度為7×104的RAW 264.7細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，再置于37 ℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用不同濃度(50、25、12.5、6.25、3.125 μmol/L)的待測(cè)物處理RAW 264.7細(xì)胞。用MTT法檢測(cè)化合物對(duì)RAW 264.7細(xì)胞的細(xì)胞毒性[5]。

1.3.2.5 MTT法檢測(cè)抗腫瘤活性

把對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞以每孔1×105的密度接種于96孔板中，恒溫培養(yǎng)24 h后，以順鉑為陽(yáng)性對(duì)照，以不同濃度50、25、12.5、6.25和3.12 μmol/L的樣品作為實(shí)驗(yàn)組，作用48 h，用MTT比色法測(cè)定細(xì)胞存活率[6]。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從雷公藤莖中分離得到了20個(gè)二萜類化合物(見(jiàn)圖1)，包括1個(gè)新二萜和19個(gè)已知二萜。

圖1 化合物1～20的結(jié)構(gòu)Fig.1 The structures of compounds 1～20

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

圖2 化合物1的1H-1H COSY 和 HMBC相關(guān)Fig.2 1H-1H COSY and HMBC correlations of compound 1

表1 化合物1的1H NMR(600 MHz，CDCl3)和13C NMR(150 MHz，CDCl3)譜數(shù)據(jù)

續(xù)表1

化合物2淡黃色油狀物；分子式C20H26O3。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：6.37(1H，s，H-12)，3.00(1H，m，H-15)，2.86(1H，m，H-2)，2.82(1H，m，H-7)，2.57(2H，m，H-1)，2.32(1H，m，H-7)，1.52(1H，m，H-6)，1.30(3H，s，H-20)，1.15(3H，s，H-19)，1.12(3H，s，H-18)，1.12(3H，d，J= 6.9 Hz，H-16)，1.11(3H，d，J= 6.9 Hz，H-17)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：217.1(C-3)，187.7(C-14)，187.5(C-11)，153.2(C-13)，148.2(C-9)，142.8(C-8)，131.9(C-12)，50.8(C-5)，47.0(C-4)，37.5(C-10)，34.7(C-1)，33.9(C-2)，27.7(C-19)，26.4(C-15)，25.5(C-7)，21.4(C-17)，21.3(C-16)，20.7(C-18)，20.2(C-20)，18.6(C-6)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8,9]報(bào)道的數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物2為雷藤二萜醌H。

化合物3黃色無(wú)定形粉末；分子式C20H26O4。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：6.38(1H，d，J= 1.2 Hz，H-12)，4.06(1H，d，J= 11.4 Hz，H-19)，3.46(1H，m，H-19)，3.00(1H，m，H-15)，2.84(1H，m，H-1)，2.48(1H，ddd，J= 15.7，9.1，5.6 Hz，H-2)，2.29(1H，ddd，J= 20.0，11.8，6.6 Hz，H-7)，2.01(1H，dd，J= 13.0，2.2 Hz，H-5)，1.85(2H，m，H-1，H-6)，1.83(1H，m，H-1)，1.43(1H，m，H-6)，1.35(3H，s，H-18)，1.28(3H，s，H-20)，1.12(3H，d，J= 6.9 Hz，H-16)，1.10(3H，d，J= 6.9 Hz，H-17)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：221.0(C-3)，187.6(C-14)，187.4(C-11)，153.4(C-13)，147.5(C-9)， 142.5(C-8)，131.9(C-12)，65.6(C-19)，51.6(C-5)，50.2(C-4)，37.1(C-10)，34.4(C-1)，34.2(C-2)，26.4(C-15)，25.5(C-7)，22.6(C-18)，21.4(C-17)，21.3(C-16)， 21.2(C-20)，17.8(C-6)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道的數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物3為triptoquinone B。

化合物4無(wú)色油狀物；分子式C20H28O2。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：6.87(1H，s，H-11)，6.63(1H，s，H-14)，3.13(1H，m，H-15)，1.27(3H，s，H-18)，1.25(3H，d，J= 6.9 Hz，H-17)，1.23(3H，d，J= 6.9 Hz，H-16)，1.16(3H，s，H-19)，1.13(3H，s，H-20)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：217.9(C-3)，151.1(C-12)，145.6(C-9)，132.3(C-13)，126.8(C-8)，126.6(C-14)，111.8(C-11)，50.5(C-5)，47.4(C-4)，37.5(C-1)，37.0(C-10)，34.6(C-2)，30.1(C-7)，26.9(C-18)，26.8(C-15)，24.6(C-20)，22.7(C-17)，22.5(C-16)，21.0(C-19)，20.4(C-6)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11,12]報(bào)道的數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物4為hinokione。

化合物5無(wú)色油狀物；分子式C20H28O2。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：7.04(1H，d，J= 8.2 Hz，H-12)，6.85(1H，d，J= 8.2 Hz，H-11)，4.75(1H，s，14-OH)，3.13(1H，m，H-15)，2.92(1H，m，H-7)，2.61(1H，m，H-7)，2.56(1H，m，H-2)，2.48(1H，m，H-2)，1.93(1H，m，H-6)，1.91(1H，m，H-1)，1.88(1H，m，H-1)，1.80(1H，m，H-6)，1.33(3H，s，H-18)，1.25(3H，d，J= 6.8 Hz，H-17)，1.23(3H，d，J= 6.8 Hz，H-16)，1.17(3H，s，H-19)，1.14(3H，s，H-20)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：217.3(C-3)，150.1(C-14)，146.4(C-9)，130.4(C-13)，123.6(C-12)，120.8(C-8)，117.3(C-11)，50.0(C-5)，47.4(C-4)，37.6(C-1)，37.1(C-10)，34.8(C-2)，26.9(C-15)，26.6(C-19)，24.7(C-7)，24.4(C-18)，22.8(C-17)，22.5(C-16)，21.2(C-20)，19.5(C-6)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道的數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物5為雷酚萜。

化合物6白色粉末；分子式C21H30O4。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：6.30(1H，s，H-12)，4.40(1H，d，J= 11.4 Hz，H-19)，3.67(3H，s，H-21)，3.44(1H，d，J= 11.4 Hz，H-19)，3.24(1H，m，H-15)，3.08(1H，m，H-7)，3.08(1H，m，H-1)，2.77(1H，ddd，J= 15.1，11.2，6.7 Hz，H-2)，2.55(1H，m，H-7)，2.39(1H，m，H-2)，2.22(1H，dd，J= 12.9，12.0 Hz，H-5)，2.04(1H，m，H-1)，1.85(1H，m，H-6)，1.46(1H，m，H-6)，1.42(3H，s，H-18)，1.29(3H，s，H-20)，1.18(3H，d，J= 6.9 Hz，H-16)，1.17(3H，d，J= 6.9 Hz，H-17)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：223.8(C-3)，150.5(C-11)，148.4(C-14)，139.7(C-13)，130.7(C-9)，130.6(C-8)，111.8(C-12)，66.1(C-19)，60.8(C-21)，52.6(C-5)，49.9(C-4)，37.6(C-10)，35.4(C-1)，34.6(C-2)，26.5(C-7)，26.1(C-15)，23.8(C-17)，23.8(C-16)，22.8(C-18)，21.1(C-20)，19.1(C-6)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)一致[13]，故鑒定化合物6為triptonediol。

化合物7黃色無(wú)定形粉末；分子式C20H28O3。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：7.04(1H，d，J= 8.2 Hz，H-12)，6.85(1H，d，J= 8.2 Hz，H-11)，4.08(1H，d，J= 11.3 Hz，H-19)，3.54(1H，d，J= 11.3 Hz，H-19)，3.11(1H，m，H-15)，2.92(1H，dd，J= 16.7，4.8 Hz，H-7)，2.70(1H，ddd，J= 16.1，9.1，4.5 Hz，H-2)，2.62(1H，dd，J= 16.8，8.1 Hz，H-2)，2.48(1H，ddd，J= 13.0，8.2，4.5 Hz，H-1)，2.10(1H，dd，J= 13.1，2.2 Hz，H-5)，2.02(1H，m，H-1)，1.97(1H，m，H-7)，1.70(1H，m，H-6)，1.35(3H，s，H-18)，1.28(3H，s，H-20)，1.25(3H，d，J= 6.8 Hz，H-16)，1.24(3H，d，J= 6.8 Hz，H-17)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：220.4(C-3)，150.0(C-14)，145.6(C-9)，130.4(C-13)，123.7(C-12)，120.7(C-8)，117.7(C-11)，65.7(C-19)，51.0(C-4)，50.7(C-5)，37.3(C-1)，36.8(C-10)，35.0(C-2)，26.9(C-15)，25.5(C-20)，24.8(C-7)，22.7(C-17)，22.5(C-16)，22.1(C-18)，19.0(C-6)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道的數(shù)據(jù)一致[14]，故鑒定化合物7為triptobenzene A。

化合物8淡黃色無(wú)定形粉末；分子式C21H30O4。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：6.36(1H，s，H-11)，4.73(1H，s，14-OH)，4.07(1H，d，J= 11.3 Hz，H-19)，3.77(3H，s，H-21)，3.49(1H，s，H-19)，3.45(1H，m，H-15)，2.99(1H，s，19-OH)，2.80(1H，dd，J= 15.3，6.4 Hz，H-7)，2.71(1H，ddd，J= 16.0，9.3，4.6 Hz，H-2)，2.60(1H，dt，J= 16.1，8.1 Hz，H-2)，2.50(1H，m，H-7)，2.44(1H，ddd，J= 13.1，8.5，4.8 Hz，H-1)，2.11(1H，dd，J= 13.0，2.2 Hz，H-5)，2.06(1H，m，H-1)，1.96(1H，m，H-6)，1.68(1H，m，H-6)，1.35(3H，s，H-18)，1.32(3H，d，J= 7.2 Hz，H-16)，1.31(3H，d，J= 7.2 Hz，H-17)，1.29(3H，s，H-20)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：220.4(C-3)，156.8(C-12)，151.5(C-14)，145.2(C-9)，119.2(C-13)，113.8(C-8)，100.8(C-11)，65.6(C-19)，55.7(C-21)，50.9(C-4)，50.8(C-5)，37.2(C-1)，37.0(C-10)，34.9(C-2)，25.4(C-20)，24.3(C-7)，24.3(C-15)，22.2(C-18)，20.9(C-16)，20.8(C-17)，19.1(C-6)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道的數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物8為wilforol F。

化合物9白色無(wú)定形粉末；分子式C20H30O2。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：7.03(1H，d，J= 8.2 Hz，H-12)，6.84(1H，d，J= 8.2 Hz，H-11)，3.15(1H，m，H-15)，2.85(1H，dd，J=16.5，6.5 Hz，H-7)，1.25(3H，d，J= 6.9 Hz，H-16)，1.22(3H，d，J= 6.9 Hz，H-17)，1.20(3H，s，H-20)，1.07(3H，s，H-18)，0.90(3H，s，H-19)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：150.2(C-14)，148.3(C-9)，130.2(C-13)，123.4(C-12)，120.6(C-8)，116.5(C-11)，78.7(C-3)，49.2(C-5)，38.9(C-4)，37.3(C-10)，37.1(C-1)，28.2(C-19)，28.0(C-2)，26.8(C-15)，24.9(C-20)，24.7(C-7)，22.8(C-17)，22.5(C-16)，18.2(C-6)，15.4(C-18)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道的數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物9為triptobenzene B。

化合物10白色粉末；分子式C20H30O。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：7.17(1H，d，J= 8.1 Hz，H-11)，7.00(1H，m，H-12)，6.90(1H，s，H-14)，3.30(1H，m，H-3)，2.95(1H，m，H-15)，2.79-2.89(2H，m，H-15/H-7)，1.23(3H，d，J= 7.3 Hz，H-17)，1.21(3H，d，J= 7.3 Hz，H-16)，1.19(3H，s，H-19)，1.07(3H，s，H-18)，0.89(3H，s，H-20)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：146.8(C-9)，145.7(C-13)，134.7(C-8)，126.8(C-14)，124.4(C-11)，123.9(C-12)，78.8(C-3)，49.8(C-5)，39.0(C-4)，37.3(C-10)，36.9(C-1)，33.4(C-15)，30.7(C-7)，28.2(C-18)，28.0(C-2)，24.9(C-20)，24.0(C-17)，24.0(C-16)，18.9(C-6)，15.4(C-19)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道的數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物10為abietatrien-3β-ol。

化合物11黃色油狀物；分子式C20H26O3。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：6.54(1H，s，H-12)，3.66(3H， s，H-21)，3.29(1H，s，H-15)，3.24(1H，m，H-7)，3.20(1H，m，H-1)，2.96(1H，m，H-6)，2.70(1H，m，H-2)，2.49(1H，m，H-7)，2.46(1H，m，H-2)，2.28(1H，m，H-6)，1.89(3H，s，H-18)，1.84(1H，m，H-1)，1.70(3H，s，H-20)，1.18(3H，d，J= 6.9 Hz，H-17)，1.16(3H，d，J= 6.9 Hz，H-16)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：200.4(C-3)，166.1(C-5)，151.4(C-11)，147.7(C-14)，139.7(C-13)，130.9(C-8)，129.1(C-9)，126.7(C-4)，112.6(C-12)，61.1(C-21)，40.7(C-10)，34.2(C-2)，32.1(C-1)，26.7(C-6)，26.2(C-15)，25.4(C-7)，23.9(C-17)，23.6(C-16)，22.3(C-20)，10.8(C-18)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道的數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物11為triptobenzene S。

化合物12黃色無(wú)定形粉末；分子式C20H24O3。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：7.13(1H，d，J= 10.0 Hz，H-7)，6.53(1H，s，H-12)，6.53(1H，d，J= 10.0 Hz，H-6)，3.83(3H，s，H-20)，2.72(1H，m，H-1)，2.64(1H，m，H-1)，2.56(1H，m，H-2)，2.24(1H，m，H-2)，1.90(3H，s，H-18)，1.39(3H，s，H-19)，1.35(3H，d，J= 7.2 Hz，H-16)，1.35(3H，d，J= 7.2 Hz，H-17)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：197.5(C-3)，158.9(C-11)，156.6(C-5)，151.1(C-14)，145.3(C-9)，128.7(C-4)，126.6(C-7)，120.1(C-6)，119.2(C-13)，112.8(C-8)，100.1(C-12)，55.6(C-20)，39.2(C-10)，33.9(C-1)，33.3(C-2)，29.9(C-19)，24.3(C-15)，20.9(C-16)，20.9(C-17)，10.5(C-18)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]報(bào)道的數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物12為hypoglicin B。

化合物13黃色無(wú)定形粉末；分子式C20H26O5。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：12.78(1H，s，14-OH)，6.85(1H，s，H-12)，5.04(1H，s，11-OH)，4.07(1H，d，J= 11.3 Hz，H-19)，3.53(1H，d，J= 11.3 Hz，H-19)，3.32(1H，m，H-15)，3.32(1H，m，H-1)，3.12(1H，s，19-OH)，2.76(1H，m，H-2)，2.73(1H，m，H-6)，2.65(1H，d，J= 2.5 Hz，H-5)，2.64(1H，d，J= 2.5 Hz，H-6)，2.54(1H，ddd，J= 15.6，8.7，6.7 Hz，H-2)，2.07(1H，ddd，J= 14.1，9.7，6.7 Hz，H-1)，1.42(3H，s，H-20)，1.35(3H，s，H-18)，1.20(3H，d，J= 6.6 Hz，H-16)，1.29(3H，d，J= 6.6 Hz，H-17)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：219.4(C-3)，204.4(C-7)，155.2(C-14)，144.7(C-11)，136.6(C-13)，133.0(C-9)，123.8(C-12)，114.8(C-8)，65.6(C-19)，50.2(C-4)，49.3(C-5)，38.2(C-10)，35.5(C-6)，35.1(C-1)，34.8(C-2)，26.0(C-15)，22.6(C-18)，22.3(C-17)，22.1(C-16)，18.3(C-20)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報(bào)道的數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物13為triregelin H。

化合物14黃色油狀物；分子式C20H24O3。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：7.08(1H，d，J= 8.2 Hz，H-12)，6.96(1H，d，J= 8.2 Hz，H-11)，4.89(1H，d，J= 3.4 Hz，14-OH)，4.84(1H，m，H-19)，4.77(1H，m，H-19)，3.12(1H，m，H-15)，2.92(1H，dd，J= 17.3，7.3 Hz，H-7)，2.82(1H，m，H-7)，2.51(2H，m，H-2)，2.00(2H，m，H-6)，1.70(2H，m，H-1)，1.28(3H，d，J= 6.9 Hz，H-16)，1.26(3H，d，J= 6.9 Hz，H-17)，1.03(3H，s，H-20)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：174.4(C-18)，163.0(C-4)，150.8(C-14)，143.8(C-8)，131.0(C-9)，125.1(C-13)，123.4(C-12)，120.6(C-3)，116.3(C-11)，70.6(C-19)，40.8(C-15)，36.2(C-10)，32.6(C-1)，26.9(C-5)，22.8(C-17)，22.6(C-6)，22.54(C-16)，22.46(C-20)，19.7(C-2)，18.2(C-7)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19,20]報(bào)道的數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物14為雷酚內(nèi)酯。

化合物15黃色油狀物；分子式C21H26O4。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：6.48(1H，s，H-12)，4.80(2H，m，H-19)，3.69(3H，s，H-21)，3.08(1H，m，H-15)，2.40(2H，m，H-2)，1.82(2H，m，H-1)，1.18(6H，d，J= 6.9 Hz，H-16/H-17)，1.16(3H，s，H-20)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：174.6(C-18)，163.4(C-4)，150.8(C-14)，149.1(C-11)，139.9(C-13)，130.8(C-9)，129.2(C-8)，125.2(C-3)，111.9(C-12)，70.7(C-19)，60.7(C-21)，44.0(C-15)，37.2(C-10)，31.0(C-1)，26.0(C-5)，25.5(C-2)，23.8(C-17)，23.8(C-16)，19.5(C-6)，18.6(C-7)，17.3(C-20)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]報(bào)道的數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物15為雷酚新內(nèi)酯。

化合物16無(wú)色油狀物；分子式C21H34O3。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：4.40(1H，dd，J= 11.1，2.7 Hz，H-20)，4.14(1H，s，H-19)，3.35(1H，d，J= 12.4 Hz，H-20)，3.32(3H，s，H-21)，2.24(1H，m，H-2)，2.17(1H，m，H-5)，1.87(1H，m，H-1)，1.82(1H，m，H-6)，1.73(1H，m，H-13)，1.66(1H，m，H-14)，1.37(3H，s，H-17)，0.86(3H，s，H-18)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：105.9(C-19)，79.4(C-16)，62.5(C-20)，57.6(C-15)，55.0(C-21)，52.5(C-9)，49.2(C-5)，48.2(C-13)，44.9(C-8)，40.6(C-1)，40.4(C-7)，40.35(C-3)，39.0(C-10)，38.5(C-14)，36.7(C-4)，26.8(C-12)，24.5(C-17)，23.3(C-18)，22.4(C-2)，22.1(C-6)，18.0(C-11)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]報(bào)道的數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物16為16α-hydroxy-19,20-epoxy-19R*-methoxy-kaurane。

化合物17無(wú)色油狀物；分子式C22H36O3。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.21(1H，s，H-20)，3.97(1H，m，H-21)，3.62(1H，dd，J= 11.3，2.7 Hz，H-19)，3.49(1H，dd，J= 11.3，1.7 Hz，H-19)，3.40(1H，m，H-21)，2.52(1H，m，H-1)，2.36(1H，m，H-2)，1.99(1H，m，H-11)，1.82(1H，s，H-13)，1.38(3H，s，H-17)，1.22(3H，t，J= 7.1 Hz，H-22)，1.07(1H，m，H-5)，0.68(3H，s，H-18)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：101.7(C-20)，79.5(C-16)，71.7(C-19)，64.1(C-21)，58.0(C-15)，54.2(C-9)，52.1(C-5)，49.0(C-13)，44.9(C-8)，41.7(C-10)，41.2(C-3)，40.6(C-7)，38.7(C-14)，35.7(C-1)，33.3(C-4)，25.6(C-12)，24.4(C-17)，23.3(C-18)，22.4(C-2)，19.8(C-6)，18.6(C-11)，15.1(C-22)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[22]報(bào)道的數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物17為16α-hydroxy-19,20-epoxy-20R*-ethoxy-kaurane。

化合物18白色粉末；分子式C22H36O3。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：4.43(1H，dd，J= 11.0，2.8 Hz，H-20)，4.25(1H，s，H-19)，3.71(1H，m，H-21)，3.36(1H，m，H-21)，3.32(1H，d，J= 10.7 Hz，H-20)，2.24(1H，m，H-2)，2.16(1H，m，H-1)，1.94(1H，m，H-6)，1.81(1H，m，H-13)，1.37(3H，s，H-17)，1.20(3H，t，J= 7.1 Hz，H-22)，0.85(3H，s，H-18)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：104.2(C-19)，79.5(C-16)，62.7 (C-21)，62.6(C-20)，57.6(C-15)，52.5(C-9)，49.2(C-5)，48.3(C-13)，45.0(C-8)，40.7(C-1)，40.4(C-3)，40.40(C-7)，39.0(C-10)，38.4(C-14)，36.6(C-4)，26.8(C-12)，24.4(C-17)，23.4(C-18)，22.5(C-2)，22.0(C-6)，18.1(C-11)，15.4(C-22)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[22]報(bào)道的數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物18為16α-hydroxy-19,20-epoxy-19R*-ethoxy-kaurane。

化合物19無(wú)色油狀物；分子式C20H32O2。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：10.41(1H，s，H-20)，2.61(1H，d，J= 12.7 Hz，H-1)，1.34(3H，s，H-17)，0.92(3H，s，H-18)，0.76(3H，s，H-19)，0.58(1H，t，J= 13.0 Hz，H-1)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：208.0(C-20)，79.6(C-16)，58.5(C-9)，56.0(C-15)，55.5(C-5)，54.1(C-10)，48.7(C-13)，45.0(C-8)，41.6(C-3)，41.0(C-14)，40.1(C-7)，34.7(C-1)，33.6(C-4)，31.9(C-18)，24.4(C-12)，24.0(C-17)，20.7(C-19)，19.7(C-6)，19.1(C-2)，17.6(C-11)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[23]報(bào)道的數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物19為fischericin D。

化合物20白色無(wú)定形粉末；分子式C20H32O。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.71(1H，dd，J= 17.4，10.4 Hz，H-15)，5.13(1H，s，H-14)，4.95(1H，dd，J= 10.4，2.0 Hz，H-16)，4.90(1H，dd，J= 17.3，2.0 Hz，H-16)，3.83(1H，d，J= 10.8 Hz，H-19)，3.43(1H，d，J= 10.8 Hz，H-19)，2.32(1H，ddd，J= 14.3，4.6，2.1 Hz，H-7)，0.99(6H，s，H-17/H-18)，0.70(3H，s，H-20)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：147.3(C-15)，138.1(C-8)，128.0(C-14)，112.8(C-16)，65.2(C-19)，55.7(C-5)，51.4(C-9)，39.1(C-1)，38.6(C-13)，38.5(C-10)，38.3(C-4)，36.1(C-7)，35.7(C-12)，35.3(C-3)，29.4(C-17)，27.0(C-18)，22.4(C-6)，19.2(C-11)，18.6(C-2)，15.8(C-20)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[24]報(bào)道的數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物20為ent-pimara-8(14),15-diene-19-ol。

2.2 抗炎活性評(píng)價(jià)

采用LPS誘導(dǎo)小鼠單核巨噬細(xì)胞的體外炎癥模型，以L-NMMA作為陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)從雷公藤中分離得到的20個(gè)單體化合物進(jìn)行體外抗炎活性研究，結(jié)果表明化合物2、3和20對(duì)LPS誘導(dǎo)NO的產(chǎn)生有顯著的抑制作用，IC50分別為2.01、1.70和1.77 μmol/L，活性遠(yuǎn)強(qiáng)于L-NMMA(IC50= 24.89 μmol/L，表2)，其他化合物IC50值大于50，沒(méi)有顯示出明顯的抗炎活性。

表2 化合物2、3和20的體外抗炎活性

2.3 抗腫瘤活性評(píng)價(jià)

采用MTT法評(píng)價(jià)了化合物1～20對(duì)Hela細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果表明只有化合物11具微弱的抗腫瘤活性，IC50值為18.41 μmol/L，其他化合物沒(méi)有明顯的活性(IC50>40 μmol/L)。

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從雷公藤莖的乙醇提取物的乙酸乙酯萃取相中分離鑒定了20個(gè)二萜類化合物，骨架類型包括二萜醌類、松香烷型、海松烷型和對(duì)映貝殼杉烷型，其中1為新的二萜醌類化合物，化合物10、19和20為首次從雷公藤中分離得到，在以往的研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步豐富了雷公藤化學(xué)成分的研究?jī)?nèi)容。我們并沒(méi)有分離得到具有三元環(huán)氧結(jié)構(gòu)的松香烷型二萜內(nèi)酯，可能是因?yàn)檫@類化合物主要分布在根部，其在莖中含量較低的緣故。對(duì)化合物1～20進(jìn)行了體外抗炎活性和抗腫瘤活性篩選，化合物2、3和20具有顯著的抗炎活性。2為C環(huán)具有對(duì)醌結(jié)構(gòu)的松香烷型二萜，C環(huán)的對(duì)醌結(jié)構(gòu)可能是松香烷型二萜抗炎的關(guān)鍵活性基團(tuán)。前人的研究表明具有三元環(huán)氧結(jié)構(gòu)的松香烷型二萜內(nèi)酯(雷公藤甲素及其衍生物)是雷公藤中二萜類成分抗炎的主要活性成分，而本研究表明，除雷公藤甲素及其衍生物外，具有C環(huán)對(duì)醌結(jié)構(gòu)的松香烷型二萜可能也是雷公藤二萜類抗炎的活性成分之一[25]。本研究的發(fā)現(xiàn)為我們對(duì)雷公藤抗炎物質(zhì)基礎(chǔ)的認(rèn)識(shí)提供了新線索，也為以松香烷型二萜作為抗炎先導(dǎo)化合物的結(jié)構(gòu)改造提供了思路。此外，所有的化合物均沒(méi)有顯示顯著的抗腫瘤活性，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，具有三元環(huán)氧結(jié)構(gòu)的松香烷型二萜內(nèi)酯可能才是雷公藤抗腫瘤的關(guān)鍵活性成分[4]。