艾納香地上部分化學(xué)成分及其抗氧化與酪氨酸酶抑制活性研究

周立強(qiáng)，熊 燕，陳俊磊，張嘉瑜，郝小江,4*，顧 瑋*

1貴州醫(yī)科大學(xué) 省部共建藥用植物功效與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室； 2貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550014；3貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，貴陽(yáng) 550025；4中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所，昆明 650201；5貴陽(yáng)護(hù)理職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴陽(yáng) 550081

酪氨酸酶是黑色素代謝中目前唯一已知，并在黑色素生物合成過(guò)程中起關(guān)鍵作用的一種酶，它控制著黑素形成。酪氨酸酶活性與某些色素障礙性皮膚病及面部黃褐斑的產(chǎn)生有關(guān)，增高會(huì)產(chǎn)生黃褐斑等色素沉著性疾病。國(guó)內(nèi)外學(xué)者常利用抑制酪氨酸酶活性試驗(yàn)篩選治療皮膚色素沉著過(guò)多癥的藥物。近年來(lái)，從天然產(chǎn)物中提取抑制酪氨酸酶活性成分物質(zhì)成為國(guó)內(nèi)外開發(fā)美白美容化妝品的一種途徑[1]。

艾納香(BlumeabalsamiferaDC.)是菊科艾納香屬多年生草本植物，苗藥名檔窩凱Diangd vob bvid，別名大風(fēng)艾、冰片艾、家風(fēng)艾等，主產(chǎn)于貴州、廣西、云南等地。民間記錄具有治跌打損傷、瘡癤癰腫、濕疹、皮炎、通諸竅散郁火、消腫止痛等功效，用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、產(chǎn)后風(fēng)痛、痛經(jīng)等癥[2]，在黎族、壯族、苗族等地有悠久的用藥歷史。艾納香的葉片，枝可提艾粉，經(jīng)提煉后可制成天然冰片，副產(chǎn)品為冰片油。天然冰片能散郁熱，清熱止痛，開竅醒神，故在醫(yī)藥行業(yè)中用途廣泛。艾納香葉片原料一般在提取生產(chǎn)完“艾片”之后都是作為廢渣處理，這樣造成很大的資源浪費(fèi)。初步分析，這些殘?jiān)腥耘f含有大量的黃酮類等功效成分。因此，深入研究艾納香的非揮發(fā)性成分，并探索其藥用功效具有重要的科學(xué)和應(yīng)用價(jià)值。本課題組前期已經(jīng)對(duì)艾納香中的部分黃酮類化合物及其抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性進(jìn)行了報(bào)道[3]。為進(jìn)一步探究艾納香中的非揮發(fā)性成分并進(jìn)一步探討其在化妝品開發(fā)及色素障礙性皮膚病領(lǐng)域的應(yīng)用潛力，本研究運(yùn)用各種色譜手段及波譜學(xué)技術(shù)對(duì)艾納香地上部分的非揮發(fā)性成分進(jìn)行了分離純化和鑒定，并進(jìn)一步運(yùn)用DPPH法、酪氨酸酶催化左旋多巴氧化速率法對(duì)化合物的體外抗氧化活性及酪氨酸酶抑制劑活性進(jìn)行了篩選。

1 材料和方法

1.1 儀器與材料

薄層柱色譜硅膠GF254(青島海洋化工廠，中國(guó))；Sephadex LH-20凝膠(Pharmacia公司，美國(guó))；HITACHI高效液相色譜儀(Primaide，日立高新技術(shù)集團(tuán)，日本)；反相填充材料RP-18(Merck公司，德國(guó))；HPLC色譜柱為Zorbax SB-C18(半制備柱5 μm，9.4 mm×250 mm，安捷倫公司，美國(guó))；EYELA N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(東京理化器械株式會(huì)社，日本)；INOVA-400、500、600 MHz核磁共振波譜儀(Bruker公司，德國(guó))；BioTek Epoch 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(BioTek公司，美國(guó))；1,1-二苯基苦基苯肼(思域化工，中國(guó))；左旋多巴(Macklin公司，中國(guó))；硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(東京化成工業(yè)株式會(huì)社，日本)；α-葡萄糖苷酶(上海源葉生物科技有限公司，中國(guó))；多酚氧化酶(上海源葉生物科技有限公司，中國(guó))；L-抗壞血酸(Macklin公司，中國(guó))；曲酸(上海源葉生物科技有限公司，中國(guó))；阿卡波糖(上海源葉生物科技有限公司，中國(guó))；Na2CO3、二甲基亞砜均為分析純。本實(shí)驗(yàn)所用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇等有機(jī)溶劑均為貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室統(tǒng)一采購(gòu)。

艾納香地上部分于2019年9月采自貴州省黔南布依族苗族自治州羅甸縣，經(jīng)貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室顧瑋副研究員鑒定，憑證標(biāo)本(HGML-2019-23)保存在貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.1 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 化合物的提取和分離

取干燥的艾納香地上部分(75.7 kg)，粉碎之后用乙醇(100 L)加熱回流提取3次，減壓回收得到浸膏與水混懸，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，分別得到石油醚部位2.3 kg 和乙酸乙酯部位1.8 kg。石油醚部位(2.3 kg)經(jīng)40～80目正相硅膠柱層析，用石油醚/乙酸乙酯(1∶0→2∶1)、二氯甲烷/甲醇(1∶0→0∶1)洗脫得到12段樣品，記為Fr-1～Fr-12。

Fr-1段經(jīng)正相硅膠柱(石油醚、石油醚/乙酸乙酯=100∶1→1∶1、乙酸乙酯)初步分離，得到11段樣品，洗脫過(guò)程中出現(xiàn)大量白色結(jié)晶，重結(jié)晶得到化合物16(6.7 g)。Fr-1-6(13.5 g)經(jīng)正相硅膠分離(石油醚/乙酸乙酯=50∶1)得到9段樣品，F(xiàn)r-1-6-7經(jīng)正相硅膠分離(石油醚/乙酸乙酯=50∶1)、正相硅膠分離洗脫過(guò)程中發(fā)現(xiàn)不溶性白色固體，甲醇洗凈得到化合物15(6.8 mg)。Fr-1-7經(jīng)正相硅膠分離(石油醚/乙酸乙酯=50∶1)得到4段樣品，洗脫過(guò)程中出現(xiàn)不溶物，甲醇洗凈得到化合物13(9.4 mg)。乙酸乙酯萃取部位經(jīng)正相硅膠柱(40～80目)初步分離得到Fr-1～5，其中Fr-2經(jīng)正相硅膠分離(石油醚/乙酸乙酯=20∶1→1∶1、氯仿/甲醇=100∶1→1∶1)得8段樣品，其中Fr-2-5經(jīng)反相硅膠分離(甲醇/水=50∶1→90∶1)得到6段樣品，其中60%部分出現(xiàn)白色針狀結(jié)晶，重結(jié)晶得到化合物17(500 mg)，剩余部分經(jīng)正相硅膠分離得到7段，F(xiàn)r-2-5-6經(jīng)Sephadex LH-20凝膠分離得到化合物11(16.5 mg)，剩余主要部分經(jīng)RP-HPLC(Zorbax SB-C18，甲醇/水=32∶68，流速2.0 mL/min)純化得到化合物10(43.1 mg，tR=30.2 min)；90%部分經(jīng)正相硅膠(石油醚/乙酸乙酯=30∶1)分離得到化合物14(100 mg)。Fr-2-7經(jīng)反相硅膠(甲醇/水=50∶1→90∶1)分離得到9段樣品，80%段發(fā)現(xiàn)黃色不溶性固體，柱色譜純化得化合物2(14.2 mg)。乙酸乙酯部位Fr-3(316.42 g)經(jīng)正相硅膠分離(石油醚/乙酸乙酯=10∶1→1∶1、二氯甲烷/甲醇=100∶1→1∶1)得到Fr-1～7，F(xiàn)r-3-4段出現(xiàn)大量黃色固體粉末，甲醇洗凈得到化合物3(108.4 mg)和4(113.2 mg)，剩余部分經(jīng)MCI分離(甲醇/水=50∶1→90∶1)得到8段樣品，50%部分經(jīng)正相硅膠(二氯甲烷/甲醇=60∶1)分離得到的Fr-3-4-2，經(jīng)Sephadex LH-20凝膠和正相硅膠分離(二氯甲烷/甲醇=100∶1)得到化合物18(23.9 mg)，剩余部分用RP-HPLC(Zorbax SB-C18，甲醇/水=40∶60，流速2.0 mL/min)純化得到化合物6(34.2 mg，tR=39.9 min)。55%部分經(jīng)正相硅膠分離(300～400目，二氯甲烷/甲醇=100∶1)得到的Fr-3-4-3-3出現(xiàn)黃色不溶性粉末，甲醇洗凈得到化合物5(155.1 mg)，剩余部分經(jīng)正相硅膠(300～400目，二氯甲烷/甲醇=100∶1)、Sephadex LH-20凝膠分離得到化合物7(10.2 mg)。65%部分出現(xiàn)大量不溶性黃色固體，甲醇洗凈得到化合物8(500 mg)。Fr-3-5經(jīng)反相硅膠分離(甲醇/水=50∶1→90∶1)得到6段樣品，50%部分經(jīng)正相硅膠分離(300～400目，二氯甲烷/甲醇=100∶1)得到化合物9(100 mg)。Fr-5-1經(jīng)正相硅膠得到8段樣品，F(xiàn)r-5-1-7過(guò)凝膠柱后進(jìn)一步通過(guò)正相硅膠(石油醚/乙酸乙酯=5∶1)得到化合物12(120.3 mg)。Fr-8-1-1經(jīng)正相硅膠多次分離(石油醚/乙酸乙酯=10∶1)得到化合物1(17.1 mg)。

1.2.2 DPPH自由基清除活性測(cè)試

參照文獻(xiàn)報(bào)道的DPPH自由基清除活性的方法并做適當(dāng)改進(jìn)[4]，用DPPH作為底物，濃度為0.15 mmol/L，分為3個(gè)組：陰性對(duì)照組A(160 μL無(wú)水甲醇和40 μL DPPH)、樣品組B(160 μL樣品和40 μL DPPH)、樣品背景對(duì)照組C(160 μL樣品和40 μL甲醇)，避光30 min使其充分反應(yīng)后于517 nm測(cè)定吸光值。平行3次，按照公式(DPPH清除率=[A-(B-C)]/A×100%)計(jì)算DPPH自由基清除率，并用SPSS軟件計(jì)算IC50值。

1.2.3 酪氨酸酶抑制活性測(cè)試

本實(shí)驗(yàn)參考酪氨酸酶催化左旋多巴(L-DOPA)氧化速率的方法，并加以改進(jìn)[5]。以0.2 M 磷酸鹽緩沖液(PBS)為溶劑，蘑菇酪氨酸酶配置成59 U/mL，分為4個(gè)組：空白組A(120 μL PBS)、空白對(duì)照組B(90 μL PBS和30 μL蘑菇酪氨酸酶)、樣品背景對(duì)照組C(20 μL樣品和100 μL PBS)和樣品組D(20 μL樣品、70 μL PBS和30 μL蘑菇酪氨酸酶)，30 ℃恒溫箱中孵育5 min，后將各孔加入0.5 mM左旋多巴(L-DOPA)100 μL，繼續(xù)孵育10 min后，于492 nm下測(cè)定吸光值。平行3次，按照公式(抑制率=[(B-A)-(D-C)]/(B-A)×100%)計(jì)算酪氨酸酶的抑制率，并用SPSS軟件計(jì)算IC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1黃色粉末；ESI-MS：m/z367.00 [M+Na]+；分子式為C18H16O7；UV(MeOH)λmax(logε)229(3.501)，226(3.447)，223(3.195)；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：12.66(1H，s，5-OH)，7.71(1H，d，J= 2.0 Hz，H-2′)，7.68(1H，dd，J= 8.4，2.0 Hz，H-6′)，7.05(1H，d，J= 8.4 Hz，H-5′)，6.45(1H，d，J= 2.2 Hz，H-8)，6.36(1H，d，J= 2.2 Hz，H-6)，6.14(1H，s，3-OH)，4.00(3H，s，3′-OCH3)，3.89(3H，s，4′-OCH3)，3.87(3H，s，7-OCH3)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：156.0(C-2)，138.9(C-3)，178.8(C-4)，162.0(C-5)，97.9(C-6)，165.5(C-7)，92.2(C-8)，156.7(C-9)，106.0(C-10)，122.7(C-1′)，122.4(C-6′)，146.4(C-3′)，148.3(C-4′)，110.9(C-2′)，114.6(C-5′)，60.2(7-OCH3)，56.1(4′-OCH3)，55.8(3′-OCH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]報(bào)道對(duì)照基本一致，因此鑒定化合物1為7，3′，4′-三甲基槲皮素。

化合物2黃色粉末；ESI-MS：m/z313.10 [M-H]-；分子式為C17H14O6；UV(MeOH)λmax(logε)220(2.672)；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：6.92(1H，s，H-3)，6.35(1H，d，J= 1.9 Hz，H-6)，6.79(1H，d，J= 1.9 Hz，H-8)，7.58(1H，d，J= 10.0 Hz，H-2′)，6.94(1H，d，J= 8.3 Hz，H-5′)，7.57(1H，s，H-6′)，3.87(3H，s，OCH3)，3.89(3H，s，OCH3)；13C NMR(150MHz，CDCl3)δ：164.5(C-2)，103.8(C-3)，182.4(C-4)，157.8(C-5)，98.5(C-6)，165.6(C-7)，93.2(C-8)，161.6(C-9)，105.1(C-10)，121.7(C-1′)，110.6(C-2′)，151.5(C-3′)，148.6(C-4′)，116.3(C-5′)，121.0(C-6′)，56.4(-OCH3)，56.5(-OCH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]報(bào)道對(duì)照基本一致，因此鑒定化合物2為4′，5-二羥基-3′，7-二甲氧基黃酮。

化合物3黃色粉末；ESI-MS：m/z299.00 [M-H]-；分子式為C16H12O6；UV(MeOH)λmax(logε)221(2.886)；1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：12.97(1H，s，-OH)，7.43(2H，m，H-2′，6′)，6.89(1H，d，J= 8.5 Hz，H-5′)，6.72(1H，s，H-3)，6.70(1H，d，J= 2.0 Hz，H-8)，6.35(1H，d，J= 2.2 Hz，H-6)，3.85(3H，s，7-OCH3)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：182.3(C-4)，165.6(C-2)，164.7(C-7)，161.7(C-5)，157.7(C-9)，150.3(C-4′)，146.2(C-3′)，121.9(C-1′)，119.6(C-6′)，116.4(C-5′)，114.0(C-2′)，105.1(C-10)，103.6(C-3)，98.4(C-6)，93.0(C-8)，56.5(-OCH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]報(bào)道對(duì)照基本一致，因此鑒定化合物3為木犀草素-7-甲醚。

化合物4黃色粉末；ESI-MS：m/z315.10 [M-H]-；分子式為C16H12O7；UV(MeOH)λmax(logε)230(10.000)，226(3.732)，222(3.622)；1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：12.48(1H，s，-OH)，7.73(1H，d，J= 2.1 Hz，H-2′)，7.57(1H，dd，J= 8.5，2.2 Hz，H-6′)，6.89(1H，d，J= 8.0 Hz，H-5′)，6.68(1H，d，J= 2.0 Hz，H-8)，6.33(1H，d，J= 2.2 Hz，H-6),3.85(3H，s，7-OCH3)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：176.4(C-4)，165.3(C-7)，160.8(C-5)，156.5(C-9)，148.3(C-4′)，147.7(C-2)，145.6(C-3′)，136.5(C-3)，122.4(C-1′)，120.5(C-6′)，116.0(C-2′)，115.7(C-5′)，104.5(C-10)，97.9(C-6)，92.3(C-8)，56.5(7-OCH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報(bào)道對(duì)照基本一致，因此鑒定化合物4為鼠李素。

化合物7黃色粉末；ESI-MS：m/z301.00 [M-H]-；分子式為C15H10O7；UV(MeOH)λmax(logε)223(3.096)；1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：7.67(1H，d，J= 2.3 Hz，H-2′)，7.54(1H，dd，J= 8.5，2.3 Hz，H-6′)，6.88(1H，d，J= 8.4 Hz，H-5′)，6.4(1H，d，J= 2.0 Hz，H-8)，6.19(1H，d，J= 2.0 Hz，H-6)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：176.3(C-4)，164.4(C-7)，161.2(C-5)，156.6(C-9)，148.2(C-4′)，147.3(C-2)，145.5(C-3′)，122.4(C-1′)，120.5(C-6′)，116.1(C-2′)，115.5(C-5′)，103.4(C-10)，98.7(C-6)，93.8(C-8)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報(bào)道對(duì)照基本一致，因此鑒定化合物7為槲皮素。

化合物8黃色粉末；ESI-MS：m/z285.00 [M-H]-；分子式為C15H10O6；UV(MeOH)λmax(logε)229(4.129)，226(3.703)，223(3.508)；1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：12.97(1H，s，5-OH)，7.41(1H，dd，J= 8.1，2.0 Hz，H-6′)，7.39(1H，d，J= 2.0 Hz，H-2′)，6.89(1H，d，J= 8.1 Hz，H-5′)，6.66(1H，s，H-3)，6.44(1H，d，J= 2.2 Hz，H-8)，6.19(1H，d，J= 2.2 Hz，H-6)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：182.1(C-4)，164.6(C-7)，164.4(C-2)，161.9(C-9)，157.8(C-4′)，150.2(C-9)，146.2(C-3′)，122.0(C-1′)，119.5(C-6′)，116.5(C-5′)，113.8(C-2′)，104.2(C-10)，103.3(C-3)，99.3(C-6)，94.3(C-8)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道對(duì)照基本一致，因此鑒定化合物8為木犀草素。

化合物11黃色粉末；ESI-MS：m/z487.30 [M+Na]+；分子式為C21H20O12；UV(MeOH)λmax(logε)222(2.942)；1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：7.60(1H，d，J= 1.7 Hz，H-2′)，7.56(1H，dd，J= 8.4，2.0 Hz，H-6′)，6.85(1H，d，J= 8.4 Hz，H-5′)，6.43(1H，s，H-8)，6.21(1H，s，H-6)，5.43(1H，d，J= 7.4 Hz，H-1′′)，3.10～3.61(6H，m，H-sugar)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：177.8(C-4)，165.4(C-7)，161.5(C-5)，156.8(C-9)，156.6(C-2)，149.2(C-4′)，145.5(C-3′)，133.7(C-3)，121.9(C-1′)，121.5(C-6′)，116.7(C-5′)，115.8(C-2′)，104.1(C-10)，101.4(C-1′′)，99.3(C-6)，94.1(C-8)，78.0(C-3′′)，76.9(C-5′′)，74.5(C-2′′)，70.3(C-4′′)，61.3(C-6′′)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道對(duì)照基本一致，因此鑒定化合物11為異槲皮苷。

化合物12淡黃色粉末；ESI-MS：m/z315.00 [M-H]-；分子式為C16H12O7；UV(MeOH)λmax(logε)231(4.147)，228(3.873)，226(3.649)；1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：3.77(3H，s，OCH3)，6.19(1H，d，J= 2.0 Hz，H-6)，6.40(1H，d，J= 1.5 Hz，H-8)，6.91(1H，d，J= 8.5 Hz，H-5′)，7.43(1H，dd，J= 2.5，8.5 Hz，H-6′)，7.54(1H，d，J= 2.5 Hz，H-2′)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：60.1(OCH3)，94.1(C-8)，99.0(C-6)，104.6(C-10)，115.9(C-2′)，116.2(C-5′)，121.1(C-6′)，121.2(C-1′)，138.1(C-3)，145.7(C-3′)，149.2(C-4′)，156.1(C-2)，156.8(C-9)，161.7(C-5)，164.7(C-7)，178.4(C-4，C=O)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道對(duì)照基本一致，因此鑒定化合物12為3-甲氧基槲皮素。

化合物16白色粉末；ESI-MS：m/z219.10 [M+Na]+；分子式為C10H12O4；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：14.04(1H，s，-OH)，6.05(1H，d，J= 2.3 Hz，H-3)，5.91(1H，d，J= 2.3 Hz，H-5)，3.85(3H，s，4-OCH3)，3.82(3H，s，6-OCH3)，2.61(3H，s，-COCH3)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：203.1(C=O)，167.5(C-4)，166.0(C-6)，162.8(C-2)，105.9(C-1)，93.4(C-3)，90.7(C-5)，55.5(-OCH3)，32.9(-COCH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]報(bào)道對(duì)照基本一致，因此鑒定化合物16為2-羥基-4，6-二甲氧基苯乙酮。

化合物17白色粉末；ESI-MS：m/z181.10 [M-H]-；分子式為C9H10O4；1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：13.83(br s，-OH)，5.97(1H，d，J= 2.2 Hz，H-5)，5.86(1H，d，J= 2.2 Hz，H-3)，3.8(3H，s，-OCH3)，2.52(3H，s，-CH3)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：202.7(C=O)，166.8(C-2)，165.6(C-4)，163.8(C-6)，105.0(C-1)，96.0(C-3)，91.7(C-5)，56.3(-OCH3)，33.0(-CH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]報(bào)道對(duì)照基本一致，故鑒定化合物17為2，4-二羥基-6-甲氧基苯乙酮。

化合物18無(wú)色油狀物；ESI-MS：m/z235.10 [M+Na]+；分子式為C10H12O5；1H NMR(600 MHz，(CD3)2CO)δ：6.76(1H，d，J= 2.0 Hz，H-2)，6.72(1H，d，J= 8.0 Hz，H-5)，6.57(1H，dd，J= 8.1，2.2 Hz，H-6)，4.31(1H，m，H-8)，3.67(3H，s，-OCH3)，2.91(1H，dd，J= 13.8，4.9 Hz，H-7a)，2.78(1H，dd，J= 13.9，7.3 Hz，H-7b)；13C NMR(150 MHz，(CD3)2CO)δ：174.1(C-9)，144.7(C-3)，143.7(C-4)，129.0(C-1)，120.8(C-6)，116.8(C-2)，114.9(C-5)，71.9(C-8)，51.1(-OCH3)，40.0(C-7)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[22]報(bào)道對(duì)照基本一致，因此鑒定化合物18為丹參素甲酯。

2.2 化合物抗氧化活性篩選結(jié)果

用DPPH法對(duì)從艾納香地上部分分離得到的18個(gè)化合物進(jìn)行體外抗氧化活性的篩選，從表1中可以看出，化合物3～5、7～12、18在100 μg/mL的濃度下初篩抑制率均大于50%，表現(xiàn)出較好的DPPH自由基清除能力。進(jìn)一步測(cè)定并計(jì)算這些化合物的IC50值，結(jié)果表明，化合物4的抗氧化活性最高，其IC50= 0.335±0.199 μg/mL，與陽(yáng)性藥維生素C的IC50(0.155 ± 0.030 μg/mL)值較為接近?；衔锊煌|(zhì)量濃度對(duì)DPPH自由基清除活性的影響如圖1所示，化合物3～5、7～12對(duì)DPPH自由基清除能力與濃度基本成正的量效關(guān)系，表明其抗氧化活性隨著化合物質(zhì)量濃度的提高而增強(qiáng)。但化合物18對(duì)DPPH自由基清除能力與濃度不成正的量效關(guān)系，在樣品濃度為1.23 μg/mL時(shí)，抑制率最大，達(dá)到93.189%。

圖1 化合物1～18的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of compounds 1-18

2.3 化合物酪氨酸酶抑制劑活性篩選結(jié)果

用酪氨酸酶催化左旋多巴(L-DOPA)氧化速率的方法對(duì)從艾納香地上部分分離得到的18個(gè)化合物進(jìn)行體外酪氨酸抑制劑活性的篩選，從表2中可以看出，化合物7、13、14、16、17在100 μg/mL的濃度下表現(xiàn)出較好的酪氨酸抑制劑活性。進(jìn)一步測(cè)定這些化合物的IC50值，結(jié)果表明，化合物7的酪氨酸抑制劑活性最好，其IC50值為20.973±3.219 μg/mL。化合物不同質(zhì)量濃度對(duì)酪氨酸抑制劑活性的影響如圖2所示，化合物7、13、14、16、17對(duì)左旋多巴的清除率與濃度成正的量效關(guān)系，表明其酪氨酸抑制劑活性隨著化合物質(zhì)量濃度的提高而增強(qiáng)。

表1 DPPH自由基清除能力篩選

續(xù)表1(Continued Tab.1)

圖2 不同濃度樣品對(duì)DPPH的清除率Fig.2 Effects of different concentration samples on DPPH radical scavenging activity

表2 酪氨酸酶抑制活性的篩選

圖3 不同濃度的樣品對(duì)酪氨酸酶的抑制活性Fig.3 Effects of different concentration samples on tyrosinase inhibitory activity

3 結(jié)論

本文從抗氧化、酪氨酸酶抑制活性兩個(gè)方面對(duì)此加以研究。本研究運(yùn)用各種色譜手段從艾納香地上部分分離純化得到18個(gè)化合物，其中化合物10、14和18為首次從艾納香屬植物中分離得到，化合物13為首次從艾納香中分離得到。活性測(cè)試結(jié)果發(fā)現(xiàn)化合物3～5、7～12、18表現(xiàn)出較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力，化合物7、13、14、16、17有較好的酪氨酸酶抑制劑活性。結(jié)果顯示化合物的DPPH自由基清除能力與酪氨酸酶抑制劑活性的關(guān)聯(lián)性不大，只有化合物7在兩種實(shí)驗(yàn)測(cè)試中均顯示較好的活性，其具體作用機(jī)理還需進(jìn)一步的研究。黃酮類化合物是一類很強(qiáng)的抗氧化劑，如槲皮素、木犀草素、圣草素等黃酮類化合物均具有較強(qiáng)的抗氧化性。有研究報(bào)道化合物3～5、7～9、11～13和化合物18具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力[23,24]。有研究顯示化合物4、5、7、13具有較好的酪氨酸酶的抑制作用[25,26]，其余化合物對(duì)酪氨酸酶的抑制作用未見(jiàn)報(bào)道。本文系統(tǒng)地針對(duì)艾納香中的化合物進(jìn)行了分離純化，并針對(duì)這些化合物進(jìn)行了抗氧化和酪氨酸酶抑制活性研究，該研究結(jié)果為艾納香資源進(jìn)一步在抗氧化和酪氨酸酶抑制方面的應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)和理論支持，也為艾納香在人體色素障礙性皮膚疾病領(lǐng)域和日化產(chǎn)品領(lǐng)域的開發(fā)和應(yīng)用提供一些思路和方向。