高效液相色譜法測定蘑菇酸解液中氨基葡萄糖的含量

□ 張 品 貴州省農業(yè)科學院油菜研究所

氨基葡萄糖是一種水溶性的氨基單糖，屬于已糖胺類，是結締組織和胃腸粘膜內糖蛋白的重要組成部分。由于氨基葡萄糖對人體關節(jié)軟骨再生作用顯著，無不良反應，被廣泛用于骨關節(jié)炎的治療[1]。市場上的氨基葡萄糖產品大多是通過貝類或其他海洋資源的外殼酸水解生產的[2]。目前，產品中氨基葡萄糖含量檢測不準確是臨床試驗結果不一致的重要原因。因此，如何準確測定氨基葡萄糖的含量成為一個值得考慮的問題。氨基葡萄糖的檢測方法有分光光度測定法、薄層色譜法、液相色譜或毛細管電泳與分光光度法、電導率法、安培法或熒光檢測法聯(lián)用等[3]，其中最常見的方法是使用適當?shù)难苌?，然后用分光光度法或熒光分光光度法進行液相色譜分離檢測[4-5]。由于氨基葡萄糖自身缺乏紫外吸收發(fā)色團，因此，采用高效液相色譜法，柱前衍生化是必要的。目前使用的衍生化試劑有鄰苯二甲醛、氯甲酸，9-芴甲基氯甲酸酯、9-芴甲基-N-琥珀酰亞胺基碳酸酯、丹酰氯、6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯類、2-氨基苯甲酸和異硫氰酸苯酯。為了進一步開發(fā)蘑菇的食用和藥用功能，拓展蘑菇的產品功能與應用領域，本試驗采用高效液相色譜法-紫外檢測法對蘑菇酸解液中的氨基葡萄糖進行定量分析，以期為蘑菇源氨基葡萄糖生產提供理論基礎和技術支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

1200型高效液相色譜儀，安捷倫（美國），配DAD檢測器；AL 204電子天平，梅特勒-托利多（瑞士）；Arium-Pro型純水系統(tǒng)，賽多利斯（德國）；0.45 μm水相微孔濾膜，CNW（德國）；SHA-2l冷凍水浴恒溫搖床，常州市瑞華儀器制造有限公司（中國）；FE 20型實驗室pH計，梅特勒-托利多（瑞士）。

1.1.2 試劑

D-（+）-氨基葡萄糖鹽酸鹽，純度99%，Sigma-Aldrich化學公司（美國）；9-芴甲基-N-琥珀酰亞胺基碳酸酯，Carlo Erba Reagenti（意大利）；乙腈，色譜純，Acros Organics（美國）；三乙胺，三氟乙酸，分析純，Acros Organics（美國）；實驗室用水，超純水。

1.2 色譜條件

ZORBAZ ODS C18色譜柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；柱溫：40 ℃；流速：0.8 mL/min；進樣量：10 μL；檢測波長：265 nm；流動相A：0.05%三氟乙酸水溶液；流動相B：乙腈；梯度洗脫：0～6 min，A∶B=70∶30；6～11 min，A∶B=70∶30→0∶100；11～15 min，A∶B=0∶100→70∶30；15～17 min，A∶B=70∶30。

1.3 實驗方法

氨基葡萄糖的測定方法是在AOAC官方方法2005.01的基礎上進行了一些小的修改。該方法基于9-芴甲基-N-琥珀酰亞胺基碳酸酯柱前衍生法。將不同用量的三乙胺加入1 mL的氨基葡萄糖標準品和待測樣品中，反應一段時間后，取100 μL溶液加入0.5 mL的15 mmol/L 9-芴甲基-N-琥珀酰亞胺基碳酸酯溶液，在50 ℃的超聲波水浴中反應30 min，冷卻至室溫后，加入4 mL流動相A、B體積比為1∶1的混合液，過0.45 μm濾膜后液相色譜法檢測。

2 結果與分析

2.1 游離氨基葡萄糖最佳釋放條件

本實驗是利用三乙胺將游離氨基葡萄糖釋放出來，然后用9-芴甲基-N-琥珀酰亞胺基碳酸酯進行衍生化。因此，釋放反應的條件即三乙胺添加量、釋放反應時間和待測樣品pH值，探討游離氨基葡萄糖的最佳釋放條件對衍生化和后續(xù)的定量測定具有重要意義。

2.1.1 三乙胺添加量和釋放反應時間對檢測結果的影響

三乙胺添加量和釋放反應時間對檢測結果的影響如圖1、圖2所示。由圖1可知，氨基葡萄糖衍生物的高效液相色譜峰面積隨三乙胺添加量的增大而增大，當三乙胺添加量由0.75 μL 增加至1.00 μL時高效液相色譜峰面積保持不變。加入0.75 μL三乙胺，游離氨基葡萄糖在10 h內完全釋放。隨著釋放反應時間的延長16 h，氨基葡萄糖衍生物的最終高效液相色譜峰面積無明顯變化，具體見圖2。因此，最適三乙胺添加量和釋放反應時間分別為0.75 μL和10 h。

圖1 三乙胺添加量對檢測結果的影響

圖2 釋放反應時間對檢測結果的影響

2.1.2 待測樣品pH值對檢測結果的影響

待測樣品pH值對游離氨基葡萄糖的釋放和衍生化均有重要影響，具體見圖3。釋放速率隨pH值的增加而增加，當pH值由7增加至12時，高效液相色譜峰面積急劇減少，結果顯示最適pH值為5～7。在此條件下，氨基葡萄糖衍生物的高效液相色譜峰面積最大。

圖3 待測樣品pH值對檢測結果的影響圖

2.2 工作曲線和方法的精密度

氨基葡萄糖有2種天然異構體（α和β），這2種異構體在水溶液中可以相互轉化[6-7]，導致氨基葡萄糖的典型色譜圖有2個峰。保留時間（Rr）分 別 為11.310 min和11.587 min。 這2個峰的面積之和用來定量氨基葡萄糖。氨基葡萄糖標準曲線在0.02～1.20 mg/mL濃度范圍內線性關系良好，相關系數(shù)r2為0.999 3， 回歸方程為y=1 020.70x+23.807（n=7）。采用高效液相色譜法，對原料液制備的不同盲樣標準樣品進行測定。日內相對誤差在0.26%～2.09%，日間相對誤差在0.09%～3.66%。結果重復性良好，如表1所示，平均精確度為（100.88±1.26）%。用高效液相色譜法測定蘑菇酸解液中氨基葡萄糖的含量，結果顯示氨基葡萄糖濃度分別為（0.083 1± 0.007 5）mg/mL、（0.518 6± 0.009 3）mg/mL和（1.029 8± 0.042 8）mg/mL，回收率分別為（101.25±0.99）%、（100.36±1.82）%和（99.94±1.84）%，具體見表2。

表1 高效液相色譜法測定標準品溶液中氨基葡萄糖

表2 高效液相色譜法測定蘑菇酸解液中氨基葡萄糖

2.3 氨基葡萄糖衍生物的穩(wěn)定性

氨基葡萄糖衍生物的穩(wěn)定性結果見圖4。樣品1、2、3分別代表低、中、高濃度樣品。采用單因素方差分析和post-hoc Tukey’s HSD檢驗對結果進行分析，不同小寫字母表示樣本之間存在顯著差異（P＜0.05）。由圖4可知，氨基葡萄糖衍生物樣品在4 ℃貯存7 d、14 d和30 d后，高效液相色譜峰面積無顯著性差異（a=0.05） ，說明在4 ℃貯存30 d內，氨基葡萄糖衍生物穩(wěn)定性較好。

圖4 氨基葡萄糖衍生物樣品在4 ℃ 30 d內的高效液相色譜峰面積變化

3 結論

本文建立了一種蘑菇酸解液中的氨基葡萄糖含量測定方法，采用高效液相色譜法樣品經(jīng)三乙胺釋放游離氨基葡萄糖，9-芴甲基-N-琥珀酰亞胺基碳酸酯衍生化，然后采用ZORBAZ ODS C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以0.05%三氟乙酸水溶液和乙腈為流動相進行梯度洗脫，流速為 0.8 mL/min，檢測波長為265 nm，柱溫40 ℃，進樣量10 μL，以保留時間進行定性分析、外標法進行定量分析。結果顯示，氨基葡萄糖線性范圍為0.02～1.20 mg/mL（r2=0.999 3），日內相對誤差為0.26%～2.09%，日間相對誤差為0.09%～3.66%，平均準確度為（100.88±1.26）%，回收率為99.94%～101.25%。