靜態(tài)頂空-氣相色譜測(cè)定酒中甲醇方法的探究

□ 何焜鵬 何燕欣 廣東省食品工業(yè)公共實(shí)驗(yàn)室 廣東省食品工業(yè)研究所有限公司 廣東省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站

甲醇是一種對(duì)人體有害的物質(zhì)，易在體內(nèi)蓄積，長(zhǎng)期少量攝入甲醇也會(huì)造成體內(nèi)許多臟器的慢性損傷[1-2]。甲醇在人體內(nèi)可被乙醇脫氫酶代謝成甲醛，還可能被醛脫氫酶轉(zhuǎn)化為甲酸，從而引起代謝性酸中毒。甲醇毒性很大，人體攝入5 g就會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重中毒現(xiàn)象，超過12.5 g可導(dǎo)致死亡[3-4]?！妒称钒踩珖覙?biāo)準(zhǔn) 蒸餾酒及其配制酒》（GB 2757-2012）中對(duì)甲醇含量作出了限定，梁谷類≤0.6 g/L，其他類 別≤2.0 g/L（按100%酒精度折算）。通常采用《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中甲醇的測(cè)定》（GB 5009.262-2016）測(cè)定樣品中的甲醇。酒精、蒸餾酒及其配制酒可加入內(nèi)標(biāo)直接進(jìn)樣的測(cè)定，但發(fā)酵酒及其配制酒還需進(jìn)行蒸餾處理。酒在發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生氨基酸、果膠、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，鋅、硒等多種微量元素以及植物源抗氧化 劑[5-6]，這些復(fù)雜成分直接進(jìn)入色譜系統(tǒng)會(huì)造成儀器和色譜柱的污染，同時(shí)前處理過程中蒸餾操作會(huì)花費(fèi)大量的人力物力。通過頂空進(jìn)樣的方式，可以高效處理樣品并減少基質(zhì)對(duì)儀器的污染。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器設(shè)備

Agilent 7890B氣相色譜儀配置FID檢測(cè)器（安捷倫科技有限公司）；渦旋振蕩器（德國IKA公司）；G 1888頂空進(jìn)樣器（安捷倫科技有限公司）；十萬分之一天平（奧豪斯有限公司）。

1.1.2 試劑、標(biāo)準(zhǔn)品

甲醇標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥99.9%，BePure；乙醇，色譜純，霍尼韋爾公司；超純水，一級(jí)，Milli-Q。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 溶液配制

14%無水乙醇溶液：移取70 mL無水乙醇于500 mL容量瓶中，定容至刻度線，混勻待用。

甲醇儲(chǔ)備液（10 mg/mL）：準(zhǔn)確稱量0.25 g（精確到0.000 01 g）標(biāo)準(zhǔn)品，用14%無水乙醇溶液定容至 25 mL容量瓶。

1.2.2 樣品前處理

均勻混合樣品，從中準(zhǔn)確移取10.0 mL于20 mL頂空瓶，密封頂空瓶蓋，待測(cè)。

1.2.3 氣相色譜條件

色譜柱：CP-Wax 57（50 m×0.25 mm ×0.22 μm）；柱溫升溫程序：初始溫度50 ℃保持3 min以每分鐘5 ℃的速率上升至100 ℃保留3 min；進(jìn)樣口：溫度250 ℃；進(jìn)樣量1 mL，分流進(jìn)樣，分流比5∶1，分流流量為 12 mL/min；氫火焰離子化檢測(cè)器（FID）：溫度300 ℃，氫氣40 mL/min，空氣350 mL/min，尾吹30 mL/min；載氣：高純氮?dú)?，尾?5 mL/min；色譜柱流量1.5 mL/min；平衡條件：平衡溫度60 ℃，定量環(huán)溫度70 ℃，傳輸線區(qū)溫度80 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)定化合物分析

甲醇在特定的頂空條件下，目標(biāo)物在氣相和液相間形成動(dòng)態(tài)平衡，通過測(cè)定分析頂空瓶上層的氣體含量，對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行定量定性分析，其標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見圖1，與空白樣品的比較，其保留時(shí)間為5.336 min。

圖1 甲醇標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

2.2 色譜柱選擇的探究

本法選用多款色譜柱測(cè)定樣品中甲醇，探究適合該方法的色譜柱。配制濃度均為200 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)濃度點(diǎn)，采用1.2的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。使用DB-5（30 m×0.25 mm×0.25 μm）和DB-17（30 m×0.25 mm×0.25 μm）時(shí)，甲醇響應(yīng)值低且峰型差，分析得知，甲醇有較強(qiáng)的極性，采用弱極性柱、非極性柱、中極性柱不能很好的保留目標(biāo)化合物，為保證甲醇有較好的保留和分離，本方法將采用極性柱進(jìn)行測(cè)定。

使用DB-Wax（30 m×0.25 mm× 0.25 μm）測(cè)定甲醇，峰型尖銳且對(duì)稱，測(cè)定葡萄酒樣品時(shí)候發(fā)現(xiàn)甲醇和乙酸乙酯的峰完全重合，不能進(jìn)行定量定性分析。通過降低初始溫度、減緩升溫速率、調(diào)小色譜柱流速的方式，均不能很好的實(shí)現(xiàn)分離（見圖2）。此時(shí)考慮采用更好分離性能的色譜柱，CP-Wax 57 （50 m×0.25 mm×0.22 μm）成功實(shí)現(xiàn)了乙酸乙酯和甲醇的分離（見圖3），目標(biāo)物出峰尖銳對(duì)稱，在濃度均為 200 mg/L下響應(yīng)值與DB-WAX相近，相比DB-5和DB-17色譜柱響應(yīng)值較大，各種色譜柱的響應(yīng)值比較見表1。

圖2 DB-Wax測(cè)定葡萄酒中甲醇的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖（甲醇和乙酸乙酯重合）

圖3 CP-Wax 57測(cè)定葡萄酒中甲醇的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖（甲醇和乙酸乙酯實(shí)現(xiàn)分離）

表1 不同色譜柱測(cè)定甲醇的響應(yīng)值

2.3 頂空平衡溫度與平衡時(shí)間的探究

配制均為200 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)濃度點(diǎn)，控制頂空平衡時(shí)間為30 min。頂空進(jìn)樣設(shè)置的平衡溫度范圍為40～230 ℃，平衡溫度過高，頂空瓶?jī)?nèi)壓力升高，樣品沸騰，可能導(dǎo)致頂空瓶?jī)?nèi)樣品氣體泄漏或頂空瓶破裂等情況，故本試驗(yàn)在40～80 ℃進(jìn)行試驗(yàn)探究。在40 ℃、50 ℃、60 ℃、 70 ℃和80 ℃的平衡溫度下統(tǒng)計(jì)相同濃度標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)平行6次測(cè)定的平均響應(yīng)值，探究本實(shí)驗(yàn)較優(yōu)的頂空平衡溫度，測(cè)試結(jié)果見圖4?？刂祈斂掌胶鉁囟葹?0 ℃，標(biāo)準(zhǔn)濃度點(diǎn)在平衡時(shí) 間 為10 min、20 min、30 min、 40 min和50 min下進(jìn)行測(cè)試，在不同平衡時(shí)間下平行測(cè)定6次響應(yīng)值，用于探究較優(yōu)的平衡時(shí)間，測(cè)試結(jié)果見圖5。從圖得知，當(dāng)平衡溫度為 60 ℃平衡時(shí)間30 min時(shí)，甲醇達(dá)到最大的響應(yīng)值，繼續(xù)提高溫度和增加平衡時(shí)間均不能提高目標(biāo)物的響應(yīng)值。因此，將頂空平衡溫度為60 ℃，頂空平衡時(shí)間為30 min作為本方法的頂空 條件。

圖4 頂空平衡溫度與響應(yīng)值關(guān)系

圖5 頂空平衡時(shí)間與響應(yīng)值關(guān)系

2.4 方法的線性范圍及檢出限

從甲醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（10 mg/mL）中 分 別 吸 取0.06 mL、0.25 mL、 0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL和2.50 mL用14%乙醇溶液定容至 25 mL，配制成25 mg/L、100 mg/L、 200 mg/L、400mg/L、800 mg/L、 1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作使用液。準(zhǔn)確移取10.0 mL于頂空瓶上機(jī)測(cè)定。以標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為橫坐標(biāo)，甲醇峰面積為縱坐標(biāo)，繪制校正曲線見圖6，線性回歸方程為Y=0.072 0X+1.150 0，線性擬合R=0.997 82，線性良好，符合《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制范圍 食品理化檢測(cè)》（GB/T 27404- 2008）附 錄F.2中對(duì)相關(guān)系數(shù)的要求。將標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋，以信噪比S/N=3時(shí)的濃度為本方法的檢出限0.4 mg/L。與《食品中甲醇的測(cè)定》（GB 5009.262-2016）中檢出限為7.5 mg/L相比，本方法可測(cè)定更低濃度的樣品。

圖6 甲醇的校正曲線圖

2.5 樣品加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

從市場(chǎng)購得的多種樣品按照1.2方法，在3個(gè)不同添加水平下，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)和精密度實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。結(jié)果均符合《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制范圍 食品理化檢測(cè)》（GB 27404-2008）附錄F.1中對(duì)回收率和精密度的要求。

表2 不同基質(zhì)不同添加濃度下甲醇的回收率和精密度（n=6）

2.6 檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)定結(jié)果比對(duì)

將本方法結(jié)果與《食品中甲醇的測(cè)定》（GB 5009.262-2016）的結(jié)果進(jìn)行比較，平行測(cè)定6次。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，確認(rèn)本方法與標(biāo)準(zhǔn)方法的結(jié)果是否有較大差異，結(jié)果見表3。從數(shù)據(jù)得知，在不同基質(zhì)下，本方法的結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)方法相近，相對(duì)偏差較小，能滿足檢測(cè)的要求。

表3 多種基質(zhì)在不同方法下的測(cè)定值（n=6）

3 結(jié)論

本方法采用頂空進(jìn)樣方式測(cè)定酒中甲醇含量，對(duì)色譜柱的選擇、頂空條件的確定、樣品回收率及穩(wěn)定性、方法比對(duì)等方面進(jìn)行了探究。改進(jìn)了《食品中甲醇的測(cè)定》（GB 5009.262-2016）中發(fā)酵酒、配制酒及顏色較深酒的前處理時(shí)需要蒸餾、定容等繁瑣的步驟。采用頂空進(jìn)樣方式，減少了各種基質(zhì)中脂類、糖分、蛋白質(zhì)等物質(zhì)對(duì)色譜系統(tǒng)的污染。目標(biāo)化合物的線性相關(guān)系數(shù)良好、樣品的加標(biāo)回收在正常范圍內(nèi)，精密度高，符合《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制范圍-食品理化檢測(cè)》（GB 27404-2008）中的要求,且簡(jiǎn)單高效，適用于檢測(cè)各種酒中甲醇的含量。