基于轉(zhuǎn)錄組的金花茶PEBP基因家族的鑒定及分析

劉合霞 刁慧玲 舒楊 譚肖玲 韋曉曉 李妍 龍開蕓 蘇雅萍 趙嬌妹 李博

摘要 磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白 （phosphatidyl ethanolamine binding protein， PEBP）在花的形態(tài)建成中具有重要作用，為了解該基因家族在金花茶開花過程中的調(diào)控作用，通過對金花茶的花瓣轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)進行生物信息學(xué)分析，從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選金花茶（Camellia nitidissima）PEBP基因，并對其蛋白質(zhì)性質(zhì)、功能結(jié)構(gòu)域、進化關(guān)系及開花過程中的表達模式進行了分析。結(jié)果表明，金花茶花瓣轉(zhuǎn)錄組中共含有9個PEBP基因家族成員，可以分為FT-like、TFL1-like、MFT-like、PEBP-like 4個亞基因家族;該蛋白家族主要由酸性、親水的穩(wěn)定蛋白構(gòu)成，定位于細胞核中;該基因家族Motif具有一定的保守型，且所包含的保守基序數(shù)目及種類存在一定差異。在金花茶開花過程中，CnPEBP 4基因的表達量不斷增高，該基因可能對金花茶花瓣形態(tài)建成具有一定的調(diào)控作用;而其他基因家族成員在金花茶花瓣組織中表達量較低或不表達。鑒定獲得了金花茶PEBP基因家族成員的序列和部分功能信息，為研究金花茶開花調(diào)控提供了理論參考，為金花茶開花調(diào)控機理的研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 PEBP基因家族;金花茶;保守基序;進化分析;表達量分析

中圖分類號 S-685.14? 文獻標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2021）13-0103-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.13.025

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Transcriptome wide Identification and Expression Profiling of PEBP Gene Family in Camellia nitidissima

LIU He xia， DIAO Hui ling， SHU Yang et al

（College of Biology and Pharmacy， Yulin Normal University， Yulin， Guangxi 537000）

Abstract Phosphatidyl ethanolamine binding protein （PEBP） plays an important role in the formation of flower.In order to konw the function of PEBP gene family of Camellia nitidissima in blossom， PEBP gene family was selected from the transcriptome database of petal in Camellia nitidissima with bioinformatics analysis， and their protein properties， functional domains， evolutionary relationships and expression patterns during flowering were analyzed.The results showed that there were a total of 9 PEBP gene families in the petals transcription of Camellia nitidissima， which could be divided into four sub gene families， such as FT like， TFL1 like， MFT like， PEBP like， etc.The protein family is mainly composed of acidic， hydrophilic and stable proteins located in the nucleus.In addition， the Motif of this gene family had a certain conservative type， and there were some differences in the number and types of conservative motifs.During the flowering process of Camellia nitidissima， the expression level of CnPEBP4 gene increases continuously， which may had a certain regulatory effect on the petal morphological formation of Camellia nitidissima， but other gene family members showed low or no expression.In this study， the sequence and partial functional information of the PEBP gene family members of Camellia nitidissima were identified， which provided theoretical reference for the study of flowering regulation and laid a foundation for the study of flowering regulation mechanism of Camellia nitidissima.

Key words PEBP gene family;Camellia nitidissima;Conserved motif;Phylogenetic analysis;Expression analysis

在植物分類系統(tǒng)中，金花茶（Camellia nitidissima）屬于山茶科（Theaceae）山茶屬（Camellia）植物，于1965年在我國廣西首次被發(fā)現(xiàn)，主要分布于我國廣西南部地區(qū)及越南北部地區(qū)，是山茶屬中唯一具有金黃色花瓣的珍稀植物類群，素有“茶族皇后”“植物界的大熊貓”的美譽[1]。金花茶花瓣金黃色，具有較高的觀賞價值，同時也是一種藥食兩用植物，含有茶多酚、茶多糖、黃酮類等生理活性成分，此外還含有對人體健康有益的多種微量元素，如鍺、錳、有機硒等元素[2]。金花茶具有清熱解毒、利尿消腫等功能，可用于治療咽喉腫痛、小便出血、月經(jīng)失調(diào)、高血壓、痢疾等疾病，另外，現(xiàn)代藥理學(xué)的研究也表明金花茶具有殺菌、抗癌、防治“三高”等作用[3-5]。金花茶的觀賞價值、經(jīng)濟價值及藥用價值均較高，因此對其進行保護、開發(fā)和利用具有重要意義[6-7]。其中，金花茶的花朵是主要開發(fā)利用資源，被制成各種茶類和保健品，市場銷售良好，因此研究金花茶開花過程中的調(diào)控機制，了解金花茶開花過程的分子調(diào)節(jié)機理，對于金花茶資源進一步的開發(fā)利用具有重要的理論價值。

在高等植物中，磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白（Phosphatidy ethanolamine-binding protein， PEBP）基因家族廣泛存在，該基因家族具有調(diào)控植物開花及株型分化的功能[8]。PEBP基因可劃分為FT（FLOWERING LOCUS T）、TFL1（TERMINAL FLOWER 1）和MFT（MOTHER OF FT AND TFL1）[9]等亞基因家族，不同亞基因家族的功能存在著差別，如MFT亞基因家族可調(diào)控繁殖器官發(fā)育，其主要在種子中發(fā)揮作用;而FT和TFL1亞基因家族在調(diào)控開花中發(fā)揮作用，F(xiàn)T促進開花，TFL1則抑制開花[10]。目前，有關(guān)于PEBP基因在擬南芥中的組成及功能研究較多[11]，但隨著對PEBP研究的不斷深入，許多不同類別植物的PEBP基因家族都已被鑒定，如白云杉（Picea glauca）、挪威云杉（Piceaabies）、花旗松（Pseudotsugamenziesii）等裸子植物[12]，獼猴桃（Actinidia chinensis）[13]、大豆（Glycine max）[14]、楊樹（Populustremula）[15]、葡萄（Vitis vinifera）[16]等雙子葉植物，玉米（Zea mays）[9]、水稻（Oryza sativa）[17-18]等單子葉植物。通過對被鑒定出的PEBP家族成員的結(jié)構(gòu)及功能進行分析，發(fā)現(xiàn)這些物種中PEBP基因家族成員的同源性較高，且調(diào)控開花的作用機制相似。

目前，有關(guān)于山茶科植物中PEBP基因的研究報道較少，只有茶樹的PEBP基因被鑒定及克隆[19]。隨著金花茶花芽及花瓣等組織轉(zhuǎn)錄組測序的完成，為金花茶PEBP家族基因的研究提供了有力的資源[20-21]。該研究通過生物信息學(xué)方法對金花茶PEBP基因家族進行鑒定，分析PEBP基因家族成員的理化性質(zhì)、蛋白質(zhì)保守基序、系統(tǒng)進化關(guān)系及開花過程中的表達模式，旨在為進一步了解金花茶PEBP基因家族成員的組成及其開花調(diào)控機理的進一步研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 獲取已知擬南芥PEBP基因家族成員的蛋白質(zhì)序列，這些序列主要通過NCBI數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載，然后將其作為Query序列，以對不同發(fā)育時期金花茶花瓣轉(zhuǎn)錄組測序所獲得的編碼序列為目標(biāo)序列，搜索金花茶轉(zhuǎn)錄組中PEBP基因家族。

1.2 方法

1.2.1 金花茶PEBP基因家族成員鑒定。

搜索金花茶轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中PEBP基因家族的過程，通過本地Blast比對來完成，閾值參數(shù)設(shè)為 E<10-5;然后檢測候選的蛋白序列是否存在PEBP蛋白保守結(jié)構(gòu)域，排除不符合要求的基因，該檢測過程利用在線軟件NCBI （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/）[22]來完成。

1.2.2 金花茶PEBP蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及保守結(jié)構(gòu)元件分析。

對金花茶PEBP基因家族成員蛋白質(zhì)的性質(zhì)，如等電點、脂肪系數(shù)、不穩(wěn)定系數(shù)、平均親水系數(shù)、分子量等進行分析，主要通過在線網(wǎng)站ExPASy（http：//web.expasy.org/protparam/） [23] 完成。同時對蛋白質(zhì)進行亞細胞定位預(yù)測;利用在線工具MEME（http：//meme suite.org/）[24]來預(yù)測金花茶PEBP基因家族成員的保守結(jié)構(gòu)元件，其中Motifs 數(shù)量設(shè)為10個，保守位點寬度為6～50;PEBP基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)和Motif序列，通過TBtools軟件來展示。

1.2.3 金花茶PEBP基因家族系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建。

采用Neighbor joining法，利用MEGA10軟件[25]，對搜尋獲得的金花茶PEBP蛋白序列，下載獲得的水稻和擬南芥PEBP蛋白質(zhì)序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，將Boot strap參數(shù)值設(shè)定為1 000，其他參數(shù)設(shè)為默認值。

1.2.4 金花茶PEBP基因家族表達模式分析。

利用開花過程中金花茶花瓣轉(zhuǎn)錄組測序獲得的PEBP基因家族的表達量數(shù)據(jù)來繪制表達量熱圖[20]，該過程主要使用R語言軟件來完成。開花過程分為幼蕾期（S1）、初蕾期（S2）、顯色期（S3）、半開期（S4）、盛開期（S5）5個時期（圖1）[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 金花茶PEBP基因家族的鑒定與分析

以擬南芥PEBP蛋白質(zhì)序列為Query序列進行本地Blast比對，搜索金花茶花瓣轉(zhuǎn)錄組中的PEBP基因家族成員，共獲得13條PEBP序列，經(jīng)CCD 在線數(shù)據(jù)庫分析后，最終鑒定獲得9個PEBP基因家族成員。按照轉(zhuǎn)錄組中unigene的ID號，根據(jù)從小到大的順序?qū)鸹ú鑀EBP基因家族成員進行編號，即CnPEBP 1～CnPEBP 9（表1）。對金花茶PEBP基因編碼蛋白的理化性質(zhì)進行預(yù)測分析，結(jié)果顯示，金花茶9個PEBP基因的編碼氨基酸數(shù)目及編碼蛋白質(zhì)理論分子量分別為109～282個、12.33～28.04 kD;該蛋白家族的理論等電點為4.81～8.87，其中CnPEBP 2、CnPEBP 3、CnPEBP 4、CnPEBP 5及CnPEBP 7的理論等電點值大于7，為堿性蛋白;且該蛋白家族的不穩(wěn)定指數(shù)和脂肪系數(shù)分別為32.88～49.82、69.72～90.88，其中有5個蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)小于40，為穩(wěn)定蛋白;除了CnPEBP 6以外，平均親水系數(shù)均小于0，說明各蛋白均為親水性蛋白。對金花茶PEBP蛋白家族的亞細胞定位預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)主要包括3種類型，即CnPEBP 2定位于細胞質(zhì)，CnPEBP 1、CnPEBP 4、CnPEBP 5、CnPEBP 6和CnPEBP 7定位在細胞核，CnPEBP 3、CnPEBP 8、CnPEBP 9定位于細胞核及細胞質(zhì)中。以上對金花茶PEBP蛋白基本理化特性的分析結(jié)果表明， PEBP基因編碼的蛋白在氨基酸序列長度和蛋白特性變化上存在一定差異，該蛋白家族主要由酸性、親水的穩(wěn)定蛋白構(gòu)成，且主要定位于細胞核中。

2.2 金花茶PEBP保守基序分析

利用MEME在線工具對篩選得到的9個金花茶PEBP基因家族成員的保守基序進行分析，發(fā)現(xiàn)共有10個保守基序存在于PEBP基因家族中，將其命名為 Motif 1～Motif 10，鑒定的基序長度為6～50個氨基酸，每個PEBP中保守基序的數(shù)目為3～6個（圖2、3），其中Motif 7出現(xiàn)次數(shù)最少，只有2次，Motif 4、Motif 8出現(xiàn)3次，Motif 2、Motif 5、Motif 6、Motif 9均出現(xiàn)4 次，Motif 1出現(xiàn)7次，Motif 3出現(xiàn)的次數(shù)最多，為9次。綜合PEBP基因家族進化分析，發(fā)現(xiàn)PEBP蛋白的亞組成員共享1個或多個相同的基序，屬于同一亞組的PEBP基因成員表現(xiàn)出相似的Motif組成，說明它們在功能上可能具有相似性;此外，有些基序只出現(xiàn)在特定的子群中。金花茶PEBP基因家族的保守基序分析結(jié)果表明，該基因家族Motif具有一定的保守型，且所包含的保守基序數(shù)目及種類存在一定差異。

2.3 金花茶PEBP蛋白系統(tǒng)進化分析

利用金花茶9個PEBP蛋白序列，擬南芥6個PEBP蛋白、水稻18個PEBP蛋白一起構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，進而探究金花茶PEBP基因家族的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖4），金花茶PEBP基因家族被分為ClassⅠ（FT-like）、ClassⅡ（TFL1-like）、ClassⅢ（MFT-like）、ClassⅣ（PEBP-like）4個亞族，每個亞族所含有的基因數(shù)分別是4、2、1、2個。FT-like亞族包括CnPEBP 6、CnPEBP 7、CnPEBP 8、CnPEBP 9蛋白、擬南芥AtFT和AtTSF蛋白、水稻中發(fā)現(xiàn)的FT同源蛋白;第2個獨特的單系分支（TFL1-like）由金花茶CnPEBP 2和CnPEBP 5 2個蛋白、擬南芥AtTFL1、AtATC、AtBFT蛋白以及水稻中發(fā)現(xiàn)的假定同源蛋白組成;MFT-like亞族則包括CnPEBP 3蛋白，擬南芥AtMFT，水稻中發(fā)現(xiàn)的MFT同源蛋白;第4個亞枝由含有保守PEBP蛋白結(jié)構(gòu)域的CnPEBP 1、CnPEBP 4、水稻OsUPF蛋白質(zhì)組成，該結(jié)構(gòu)域是細菌和古細菌所特有的結(jié)構(gòu)域。另外，系統(tǒng)進化分析還發(fā)現(xiàn)，金花茶與擬南芥的親緣關(guān)系較近，與水稻親緣關(guān)系較遠，該結(jié)果符合植物分類標(biāo)準(zhǔn)。

2.4 金花茶PEBP基因家族表達分析

為了解金花茶PEBP基因家族在金花茶花瓣發(fā)育過程中的表達情況，對PEBP基因家族在開花過程中花瓣組織的表達量進行了研究，結(jié)果表明，該家族成員存在特異表達模式，主要可以劃分為3種類型（圖5）。在金花茶開花過程中，CnPEBP 4表達量不斷增高，該基因可能對金花茶花瓣形態(tài)建成具有一定的調(diào)控作用;CnPEBP 3與CnPEBP 7的表達模式相近，它們在金花茶開花的某個階段表達量有所提高;而CnPEBP 1、CnPEBP 2、CnPEBP 5、CnPEBP 6、CnPEBP 8、CnPEBP 9在各種花瓣組織中表達量較低或不表達，它們的表達模式類似，結(jié)果表明，金花茶PEBP基因家族在花瓣發(fā)育過程中的表達量存在差異。

3 討論

PEBP基因家族在植物的成花轉(zhuǎn)變、花形態(tài)建成以及種子發(fā)育和萌發(fā)中發(fā)揮重要作用，該基因家族成員數(shù)量在單子葉和雙子葉植物中存在較大差異，在單子葉植物中PEBP基因數(shù)量相對較多[11]。該研究通過本地數(shù)據(jù)庫Blast比對，搜尋得到9個金花茶PEBP基因家族成員，其成員數(shù)目多于葡萄、黃瓜（Cucumis sativus）、毛果楊（Populus trichocarpa）等雙子葉植物，但遠少于小果野蕉（Musa acuminata）、玉米、高粱（Sorghum bicolor）等單子葉植物[12]。對金花茶PEBP蛋白的理化性質(zhì)進行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)除了CnPEBP 6，其余金花茶PEBP蛋白均為親水性蛋白，該特性符合植物PEBP蛋白的親水特征[26];植物蛋白質(zhì)不同的亞細胞定位與其生物學(xué)功能密切相關(guān)，亞細胞定位結(jié)果發(fā)現(xiàn)金花茶PEBP蛋白主要分布于細胞質(zhì)及細胞核中，與番茄（Solanum lycopersicum）[27]、擬南芥[28]的PEBP蛋白亞細胞定位結(jié)果類似，與小麥[26]、龍眼（Dimocarpus longan）[29]的PEBP蛋白亞細胞定位結(jié)果不同。

PEBP基因家族的系統(tǒng)進化分析表明，大部分植物PEBP基因被劃分為FT-like、TFL1-like、MFT-like 3個亞族[9]。在該研究中，金花茶的9個CnPEBP基因則被分成FT-like、TFL1-like、MFT-like、PEBP-like 4個亞家族，其中FT-like亞家族中成員最多，含有4個CnPEBP基因，TFL1-like和PEBP-like亞家族成員次之，各含有2個CnPEBP基因，MFT-like亞家族成員最少，只有1個CnPEBP基因。構(gòu)建的金花茶PEBP基因家族系統(tǒng)進化樹與陸地棉（Gossypium hirsutum）PEBP基因家族類似[30]，與許多植物PEBP基因家族的劃分類型相比，它們都多含了1個PEBP-like亞家族，并且2個物種的PEBP-like亞家族均含保守的PEBP結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域具有細菌和古細菌特有結(jié)構(gòu)域（PEBP_bacteria and archaea），與大部分植物所含的真核生物特有結(jié)構(gòu)域（PEBP_eukaryote）不同。綜合金花茶PEBP蛋白的理化性質(zhì)及具有的保守結(jié)構(gòu)域類型進行分析，結(jié)果顯示，金花茶TFL1-like亞家族及MFL-like亞家族均為不穩(wěn)定蛋白;除了CnPEBP 7，F(xiàn)T-like亞家族及PEBP-like亞族蛋白均為穩(wěn)定蛋白;穩(wěn)定蛋白及不穩(wěn)定蛋白所含的保守結(jié)構(gòu)域類型完全不同，因此認為金花茶PEBP蛋白所含保守結(jié)構(gòu)域類型對金花茶PEBP蛋白穩(wěn)定性及亞家族分類有一定的影響。

目前，在多種植物中鑒定了眾多PEBP基因并對其功能進行了研究，發(fā)現(xiàn)亞基因家族的功能各不相同。比如FT-like亞基因家族可促進開花，TFL1-like亞基因家族抑制開花，MFT-like亞基因家族促進種子萌發(fā)[10]。該研究對金花茶PEBP基因家族在開花過程中花瓣組織的表達情況進行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該家族成員存在特異性表達模式，主要可以劃分為3種類型。PEBP-like亞家族基因CnPEBP 4在金花茶開花過程中表達量不斷增高，根據(jù)其表達量推斷該基因可能對金花茶花瓣形態(tài)建成具有一定的調(diào)控作用;MFT-like亞家族基因CnPEBP 3與FT-like亞家族基因CnPEBP 7的表達模式相近，它們在金花茶開花的某個階段表達量有所提高;而其余的PEBP基因表達量較低或不表達，例如金花茶TFL1-like亞家族的基因CnPEBP 2和CnPEBP 5。TFL1基因具有抑制開花的功能，其mRNA水平隨著營養(yǎng)生長向生殖生長的過渡會下降，例如，蘋果（Malus × domestica.）[31]、日本杏（Prunus armeniacal）[32]、枇杷（Eriobotrya japonica）[32]等薔薇科植物TFL1基因的表達量會隨著花芽分化而顯著降低，在該研究中金花茶TFL1-like亞家族也具有類似的情況，基因的低表達量對開花過程難以發(fā)揮抑制作用，從而保證金花茶能夠正常開放。MFT或FT同源基因在龍眼[33]、麻風(fēng)樹（Jatropha curcas）[34]等植物繁殖器官中中度表達的情況較為常見，類似的同源基因可能具有維持繁殖器官發(fā)育的作用[34-35]，因此推斷在金花茶開花某個階段中度表達的MFT like亞家族基因CnPEBP 3、FT-like亞家族基因CnPEBP 7可能也具有維持繁殖器官發(fā)育的功能，但具體的生物學(xué)功能仍需研究。該研究獲取了金花茶PEBP基因家族成員的序列和部分功能信息，為進一步了解金花茶PEBP基因家族成員的組成及其開花調(diào)控機理打下基礎(chǔ)。

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