玉米秸稈田間原位腐解菌劑研制及功能驗(yàn)證

徐杰 王澤懿 劉文越 狄魯濱 黃雨陽

摘要 以玉米農(nóng)田土壤為篩選樣本，以玉米秸稈為篩選碳源，通過多重篩選試驗(yàn)組合，成功構(gòu)建一組高效降解纖維素的復(fù)合型菌劑Y8，并進(jìn)行室內(nèi)搖瓶試驗(yàn)、室外對比性坑試，從實(shí)際應(yīng)用的角度探討菌劑Y8的降解能力。經(jīng)菌落和菌體形態(tài)觀察及生理生化初步鑒定，這8株纖維素降解菌株均屬于芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）。在搖瓶試驗(yàn)中，該菌劑對玉米秸稈的降解率達(dá)44.70%;田間試驗(yàn)中菌劑對秸稈的降解率可達(dá)60%以上。研究結(jié)果表明，菌劑Y8可明顯提高玉米秸稈田間原位腐解效率，并在一定程度上抑制植物病原菌的生長。

關(guān)鍵詞 復(fù)合型菌劑;原位腐解;酶解活力;玉米秸稈;研制;功能驗(yàn)證

中圖分類號 S-141.4? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2021）13-0074-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.13.019

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Development and Functional Verification of in situ Decomposing Agent for Corn Stalk in the Field

XU Jie，WANG Ze yi， LIU Wen yue et al

（College of Resources and Environment， Northeast Agricultural University， Harbin， Heilongjiang 150030）

Abstract Taking corn farmland soil as the screening sample and corn straw as the carbon source，through multiple screening experiments， a group of compound bacterifier Y8 with high efficiency for cellulose degradation was successfully constructed.The indoor shaking bottle experiment and outdoor comparative pits were conducted to explore the degradation capacity of bacterifier Y8 from the perspective of practical application.The morphological observation and physiological and biochemical identification of the colonies and bacteria showed that all the 8 cellulose degrading strains belonged to Bacillus sp..In the flask shaking experiment， the degradation rate of the bacterial agent to corn straw was 44.70%.In the field experiment， the degradation rate of bacterial agent to straw could reach more than 60%.The research results showed that the fungus Y8 could significantly improve the efficiency of corn stalk decomposing in situ in the field， and inhibit the growth of plant pathogenic bacteria to a certain extent.

Key words Compound bacteria agent;Decomposing in situ; Enzyme activity;Corn straw;Development;Functional verification

玉米是東北地區(qū)種植面積最大的糧食作物，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018年黑龍江省玉米播種面積為631.7萬hm2[1]。如此大量的玉米種植面積必然會導(dǎo)致收割后產(chǎn)生的玉米秸稈難以有效處理利用[2]。雖然秸稈作為可以直接利用的可再生資源，但目前最多的處理方式仍然是直接田間焚燒。秸稈焚燒加劇了空氣污染，促使了“復(fù)合型霧霾”頻發(fā)，浪費(fèi)了秸稈中大量的有機(jī)營養(yǎng)物質(zhì)[3-4]。為了減少此現(xiàn)象的發(fā)生，目前政府大力提倡將秸稈直接還田，但由于秸稈中含有大量的木質(zhì)纖維素類物質(zhì)，導(dǎo)致其自然腐解效率低，嚴(yán)重影響播種效果。該研究所研制的菌劑旨在提高玉米秸稈的田間原位腐解效率，同時(shí)降低玉米常見病害的感染率，改善土壤肥力，緩解秸稈焚燒帶來的環(huán)境生態(tài)壓力。

利用微生物本身或其代謝產(chǎn)物降解秸稈受到了學(xué)術(shù)界廣泛的關(guān)注，目前對放線菌和真菌的篩選及研究較多[5]。王洪媛等[6]經(jīng)過富集篩選、檢測等一系列手段得到3株具有較強(qiáng)降解纖維素能力的真菌菌株;李文哲等[7]從腐爛的木材中分離出了4株纖維素分解真菌。國內(nèi)用于處理秸稈等富含木質(zhì)纖維素成分的物質(zhì)時(shí)，大多應(yīng)用真菌類菌劑尤其是以木霉屬和曲霉屬制得的菌劑為主。然而，真菌生長受水分嚴(yán)格限制，干燥條件下真菌的降解能力會明顯減弱[5]。相反，細(xì)菌生長條件不同于真菌一般嚴(yán)格，且具有芽孢的細(xì)菌一般抗逆性較強(qiáng)，可在不良的環(huán)境條件下生長[8]。細(xì)菌中也不乏存在一些具有高效降解纖維素類物質(zhì)能力的菌株，然而，對以細(xì)菌為主體纖維素降解菌劑報(bào)道相對較少。該研究利用富含纖維素降解菌的田間土壤對其進(jìn)行富集處理及馴化培養(yǎng)，通過一系列生理生化檢測獲得具有高效降解能力的細(xì)菌菌株，并將其復(fù)配成菌劑，以搖瓶試驗(yàn)、田間坑試等方式對該復(fù)合菌劑進(jìn)行功能驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 土樣、試驗(yàn)用秸稈。

土壤樣品采集自黑龍江省哈爾濱市郊區(qū)枯枝落葉覆蓋較多的土壤、田間堆放玉米秸稈及種植玉米的土壤，表層土下5 cm處取樣，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。試?yàn)使用的玉米秸稈收集于大田，長度為15～20 cm。

1.1.2 培養(yǎng)基。富集培養(yǎng)基：蛋白胨5 g、牛肉膏2.5 g、NaCl 2.5 g、秸稈粉20 g、瓊脂20 g、去離子水1 000 mL。

純化分離培養(yǎng)基：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、瓊脂20 g、去離子水1 000 mL。纖維素降解菌篩選培養(yǎng)基：CMC-Na 15 g、NH4NO3 1 g、MgSO4 0.5 g、KH2PO4 1 g、酵母膏1 g、瓊脂20 g、去離子水1 000 mL。產(chǎn)酶培養(yǎng)基：MgSO4 0.3 g、FeCl3 0.01 g、NaCl 0.1 g、KH2PO4 1 g、NaNO3 2.5 g、CaCl2? 0.1 g、秸稈粉20 g、蛋白胨1 g、去離子水1 000 mL。

1.1.3 植物病原菌。用于抑菌試驗(yàn)的植物病原菌包括玉米大斑病病原菌大斑病凸臍蠕孢菌[Exserohilum turcicum（Pass.）Leonard et Suggs]、玉米鞘腐病病原菌尖孢鐮孢菌（F.oxysporum）。

1.1.4 搖瓶試驗(yàn)所用市售菌劑。農(nóng)富康秸稈發(fā)酵劑（河南農(nóng)富康生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 菌株的富集與初篩。稱取5 g土壤樣品加入富集培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r/min的條件下進(jìn)行反復(fù)多代馴化富集培養(yǎng)。將土壤懸液進(jìn)行濃度梯度稀釋并涂布于CMC-Na培養(yǎng)基，觀察菌落周圍透明圈的有無及大小，保留透明圈較大的菌株，三區(qū)劃線純化并保存。

1.2.2 菌株CMC/天然纖維素酶活力測定。將初篩所得菌株制成種子液，并按2.5%的比例分別接入產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、 160? r/min振蕩培養(yǎng)， 每隔24 h取培養(yǎng)液，采用3， 5-二硝基水楊酸法（DNS）[8] 分別測定菌株CMC、天然纖維素酶活力。

1.2.3 菌株抑菌性檢測。

將植物病原菌接種至PDA培養(yǎng)基一側(cè)，待真菌菌絲蔓延至培養(yǎng)基50%時(shí)，將所得菌株分別接種于病原菌菌落1.0～1.5 cm處，觀察細(xì)菌對病原菌生長抑制情況。

1.2.4 菌種鑒定。采用革蘭氏染色法[9]、芽孢染色法[10]等對各功能菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化鑒定。

1.2.5 復(fù)合菌劑的構(gòu)建。

1.2.5.1 拮抗試驗(yàn)。將菌株兩兩組合并在基礎(chǔ)性培養(yǎng)基平板上交叉劃線，37 ℃溫箱培養(yǎng)24 h，觀察菌體交叉處菌株的生長情況，若生長良好則說明兩菌株之間不存在拮抗作用。

1.2.5.2 液體菌劑的制備及絮凝。將40 mL的種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、400 r/min的條件下擴(kuò)大培養(yǎng)48 h。參考文獻(xiàn)[11]進(jìn)行發(fā)酵液絮凝處理并對絮凝后的物質(zhì)進(jìn)行剛果紅檢測。

1.2.6 復(fù)合菌劑的功能驗(yàn)證。

1.2.6.1 室內(nèi)搖瓶試驗(yàn)。

稱取復(fù)合菌劑、市售菌劑各0.5 g，加入150 mL蒸餾水使其溶解，并與20 g玉米秸稈混合于200 mL錐形瓶中，在30 ℃、160 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)。在搖瓶培養(yǎng)第10天、第20天、第25天、第30天、第40天分別取樣，清洗，烘干，稱重。

1.2.6.2 室外田間試驗(yàn)。

進(jìn)行對比性室外坑試，分階段觀察秸稈形態(tài)變化。按表1中所示的用量將試劑加入高20 cm、長40 cm的土坑中，并覆土處理。在第30天、第45天、第60天分別測定土壤溫度、玉米秸稈干重，試驗(yàn)于夏季5—7月進(jìn)行。

其中，處理①，空白對照，只加入100 g玉米秸稈，其他試劑均不添加;處理②，在土坑中加入100 g玉米秸稈及所研制腐解菌劑10 g;處理③，加入100 g玉米秸稈、10 g所研制菌劑并添加營養(yǎng)液、水各1 000 mL;處理④，加入100 g玉米秸稈、1 000 mL水;處理⑤，加入100 g玉米秸稈、10 g所研制菌劑、1 000 mL營養(yǎng)液;處理⑥，加入100 g玉米秸稈、10 g所研制菌劑、1 000 mL水。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株初篩結(jié)果 采用剛果紅染色法對富集所得菌株進(jìn)行初篩，初步獲得具有纖維素降解能力的菌株17株。結(jié)果見表2。

研究表明，在某種程度上菌株透明圈直徑（D）與菌落直徑（d）比值的大小能夠代表菌株纖維素降解能力強(qiáng)弱，比值越大，纖維素降解能力越強(qiáng)[12]。如圖1所示，菌株D10-1、菌株50-15的透明圈基本將整個(gè)培養(yǎng)基覆蓋，D/d值分別達(dá)3.27、3.70，說明2個(gè)菌株在菌落較小時(shí)仍可形成較大直徑的透明圈，具有較強(qiáng)分解羧甲基纖維素的能力。為進(jìn)一步評估初篩所得菌株纖維素降解能力，對這17株菌株進(jìn)行CMC酶活力、天然纖維素酶活力檢測。

2.2 CMC酶活力、天然纖維素酶活力測定

剛果紅染色法可以對菌株是否具有纖維素降解能力進(jìn)行定性分析，不能保證篩選所得菌株在實(shí)際應(yīng)用中具有良好的降解玉米秸稈能力[13]。為確保所篩選菌株降解的實(shí)際能力對菌株進(jìn)行定量分析，根據(jù)定性及定量結(jié)果綜合分析，挑選最適、分解能力最強(qiáng)的菌株。

通過對酶活力的測定數(shù)據(jù)（表3）及水解圈直徑大小（表2）進(jìn)行分析，選擇其中8株具有較高活性菌株，分別為菌株D10-1、YD-1、50-15、BH5、A422、P3、P1、木13。

2.3 抑菌性檢測

大斑病凸臍蠕孢菌、尖孢鐮孢菌是導(dǎo)致玉米大斑病、玉米鞘腐病發(fā)生的主要病原菌，可造成玉米產(chǎn)量下降[14]。因此，對病原菌的防治是必要的。研究所篩選菌株對2株病原菌的生長抑制能力，結(jié)果如圖2所示，病原真菌在菌株YD-1的菌落周圍生長緩慢或停止生長，此現(xiàn)象表明菌株YD-1可明顯抑制玉米大斑病、玉米鞘腐病等玉米易感病原菌的生長。這些具有良好抑菌效果的菌株在高效降解玉米秸稈的同時(shí)又可為玉米的栽種提供良好的生長條件，改善土壤環(huán)境。

2.4 菌株鑒定

通過菌落形態(tài)特征、生理生化特征觀察對8株纖維素降解菌株進(jìn)行鑒定，為進(jìn)一步研究和利用所篩選菌株提供試驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。經(jīng)菌落和菌體形態(tài)觀察及生理生化初步鑒定（表4～5）， 8株纖維素降解菌株均屬于芽孢桿菌屬 （Bacillus sp.）。

芽孢是決定菌株抗逆性的關(guān)鍵因素，也是衡量菌株能否適應(yīng)自然環(huán)境的重要指標(biāo)[15]。由表5和圖3可知，篩選到的8株細(xì)菌都存在芽孢這一特殊結(jié)構(gòu)，具有一定抵抗不良環(huán)境的能力。

2.5 復(fù)合菌劑的制備及功能驗(yàn)證

2.5.1 拮抗試驗(yàn)及菌劑復(fù)配。

菌株間是否具有拮抗作用是實(shí)現(xiàn)菌株復(fù)配的前提，將不具有拮抗作用的菌株進(jìn)行組合，才能使菌劑發(fā)揮最大效果。從拮抗試驗(yàn)結(jié)果（表6）可以看出，只有菌株P(guān)1和菌株A422間表現(xiàn)為輕微的拮抗作用，其余不存在拮抗關(guān)系，可利用這8株菌株進(jìn)行復(fù)合菌劑構(gòu)建，實(shí)現(xiàn)降解效果最大化。

取相同體積8株菌株的發(fā)酵液與滅菌麩皮以1∶1比例混合，發(fā)酵48 h后晾干，制成固體菌劑，并命名為Y8。

2.5.2 室內(nèi)搖瓶試驗(yàn)。為檢驗(yàn)所得復(fù)合菌劑Y8對玉米秸稈的實(shí)際降解效果，進(jìn)行室內(nèi)秸稈降解搖瓶試驗(yàn)。從圖4可以看出，經(jīng)40 d搖瓶培養(yǎng)后，添加復(fù)合菌劑Y8、市售菌劑農(nóng)富康處理的秸稈降解率分別為44.70%、37.75%，而對照處理的秸稈降解率僅為28.25%，說明添加降解菌劑可提高秸稈的分解速率。同時(shí)，利用菌劑Y8進(jìn)行處理的秸稈分解效果優(yōu)于以市售菌劑進(jìn)行處理的效果，此試驗(yàn)結(jié)果表明所研制的復(fù)合型菌劑降解能力強(qiáng)于市售菌劑，降解效果最為明顯。

2.5.3 田間坑試。

室外的條件多變且充滿不確定性，菌株能否正常定植生長、降解能力是否穩(wěn)定，都是需要考慮的因素。從30 d后田間坑試結(jié)果（圖5）可以看出，處理1為僅加入秸稈不做任何處理的樣品，30 d后秸稈基本沒有發(fā)生變化;處理2為只加入菌劑的樣品，由于降雨等因素的影響，含水量相對充足，30 d后秸稈降解率達(dá)到50%;處理3為加入菌劑并用水和營養(yǎng)液混合處理的樣品，30 d后土質(zhì)疏松、含水量較足、玉米秸稈在復(fù)合菌劑及土著微生物的共同作用下降解率可達(dá)60%以上。上述結(jié)果表明，所研制的復(fù)合菌劑在人為干預(yù)下降解效果可進(jìn)一步增強(qiáng)，即使無人為干預(yù)下仍可對秸稈的降解產(chǎn)生幫助。

3 討論

研究表明，單一菌株制成的菌劑其降解玉米秸稈的效果并不理想[16-19]。因此，需要構(gòu)建具有纖維素降解能力的多種菌株的組合，而篩選出合適的菌株是構(gòu)建復(fù)合菌劑的關(guān)鍵。目前文獻(xiàn)中提及的復(fù)合型菌系絕大多數(shù)以真菌為主，細(xì)菌、放線菌的應(yīng)用較少[20]。該研究以玉米農(nóng)田的土壤為菌種篩選來源，通過富集培養(yǎng)、剛果紅染色等方式進(jìn)行纖維素降解菌的初步篩選，測定多種纖維素酶活力確定高效降解菌株，通過抑菌性等試驗(yàn)豐富菌株功能，最終選擇了8株細(xì)菌作為構(gòu)建復(fù)合菌劑的菌種，并以拮抗試驗(yàn)為基礎(chǔ)進(jìn)行了復(fù)合菌劑的制作，通過室內(nèi)搖瓶試驗(yàn)、田間坑試，綜合評價(jià)復(fù)合菌劑的實(shí)際降解能力，為東北地區(qū)實(shí)現(xiàn)秸稈的高效處置提供微生物利用基礎(chǔ)。

試驗(yàn)過程中進(jìn)行了菌株對植物病原菌的抑菌性檢測，發(fā)現(xiàn)所選用的8株菌株中菌株YD-1對玉米大斑病、玉米鞘腐病病原菌的生長表現(xiàn)為明顯的抑制作用。當(dāng)在PDA培養(yǎng)基中接入病原菌并培養(yǎng)7 d左右，病原菌菌絲可蔓延至平板1/2處，但當(dāng)接入細(xì)菌，培養(yǎng)1～2 d后便可發(fā)生明顯的抑制現(xiàn)象，表明所選用的菌株對底物的適應(yīng)性較強(qiáng)，生長速度較快，符合實(shí)際生產(chǎn)所需。

4 結(jié)論

（1）以枯枝落葉覆蓋較多的土壤、田間堆放玉米秸稈及種植玉米的土壤為篩選菌種來源，通過多重篩選試驗(yàn)，得到具有較強(qiáng)木質(zhì)纖維素降解能力的8株細(xì)菌，分別為菌株D10-1、YD-1、50-15、BH5、A422、P3、P1、木13，經(jīng)菌落和菌體形態(tài)觀察及生理生化初步鑒定，這8株纖維素降解菌株均屬于芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）。

（2）菌株D10-1、YD-1酶活力相對較高，分別可達(dá)2.547、2.673 U/mL;菌株YD-1對玉米大斑病、玉米鞘腐病病原菌的生長表現(xiàn)為明顯的抑制作用;8株菌株彼此不存在明顯拮抗作用，可將其復(fù)配成復(fù)合菌劑。

（3）菌劑Y8的秸稈降解功能驗(yàn)證：室內(nèi)搖瓶試驗(yàn)40 d秸稈降解率為44.70%;田間坑試中菌劑Y8對秸稈的降解率可達(dá)60%以上。

參考文獻(xiàn)

[1]

李金霞，何長安，王海玲，等.黑龍江省玉米產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀及展望[J].農(nóng)業(yè)展望，2020，16（1）：67-70.

[2] SUN M X，XU X B，WANG C D，et al.Environmental burdens of the comprehensive utilization of straw：Wheat straw utilization from a life cycle perspective[J].Journal of cleaner production，2020，259：1-12.

[3] 彭春艷，羅懷良，孔靜.中國作物秸稈資源量估算與利用狀況研究進(jìn)展[J].中國農(nóng)業(yè)資源與區(qū)劃，2014，35（3）：14-20.

[4] 陳浩，李小剛，周游，等.農(nóng)作物秸稈還田資源化利用研究進(jìn)展[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015（6）：138-141.

[5] ZHUO F，ZHANG X F，LEI L L，et al.The effect of arbuscular mycorrhizal fungi and biochar on the growth and Cd/Pb accumulation in Zea mays[J].International journal of phytoremediation，2020，22（10）：1009-1018.

[6] 王洪媛，范丙全.三株高效秸稈纖維素降解真菌的篩選及其降解效果[J].微生物學(xué)報(bào)，2010，50（7）：870-875.

[7] 李文哲，朱巧銀，范金霞，等.纖維素高效降解菌群構(gòu)建及產(chǎn)酶底物優(yōu)化[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，47（1）：81-86.

[8] 于素素.低溫玉米秸稈降解菌的篩選及其復(fù)合菌系產(chǎn)酶條件優(yōu)化[D].沈陽：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2019.

[9] 譚嘯，章熙東.革蘭氏染色法觀察與區(qū)分細(xì)菌[J].生物學(xué)教學(xué)，2019，44（7）：71-72.

[10] 陳靜，沈善瑞，賴曉芳，等.細(xì)菌芽孢染色方法的比較[J].科教文匯，2019（8）：69-70，75.

[11] 曹哲統(tǒng)，李映，尹一鳴，等.3-羥基丙酸發(fā)酵液絮凝-脫色工藝研究[J].北京化工大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2017，44（1）：45-51.

[12] ZHANG H Y，DONG S R，LOU T T，et al.Complete genome sequence unveiled cellulose degradation enzymes and secondary metabolic potentials in Streptomyces sp.CC0208[J].Journal of basic microbiology，2018，59（3）：267-276.

[13] 尚婷婷，李全宏，鄧尚貴.高效降解纖維素菌系的篩選分離及復(fù)合菌系的構(gòu)建[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2014，30（31）：254-260.

[14] 李新.鞘腐病發(fā)生程度與玉米倒伏及產(chǎn)量損失間的相關(guān)性分析[J].農(nóng)業(yè)開發(fā)與裝備，2018（4）：102，105.

[15] RUSANEN A，LAPPALAINEN K，KRKKINEN J，et al.Selective hemicellulose hydrolysis of Scots pine sawdust[J].Biomass conversion and biorefinery，2019，9（2）：283-291.

[16] ZHENG G X，YIN T，LU Z X，et al.Degradation of rice straw at low temperature using a novel microbial consortium LTF 27 with efficient ability[J].Bioresource technology，2020，304：1-4.

[17] OLOWOMOFE T O，BABALOLA T F，OLUYIDE O O，et al.Isolation，screening and molecular identification of cellulose degrading bacteria from paper and pulp mill dumpsites[J].Frontiers in environmental microbiology，2019，5（3）：77-83.

[18] MARWA N，MISHRA N，SINGH N，et al.Effect of rhizospheric inoculation of isolated arsenic （As） tolerant strains on growth， As-uptake and bacterial communities in association with Adiantum capillus veneris[J].Ecotoxicology and environmental safety，2020，196：1-11.

[19] 宋德強(qiáng)，張雯婕，張玲，等.1株降解玉米秸稈放線菌的篩選[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（9）：16-18.

[20] 宋云皓，滿都拉，郜晉楠，等.玉米秸稈纖維素降解菌的篩選及復(fù)合菌系的構(gòu)建[J].飼料工業(yè)，2017，38（19）：33-37.