基于18S rRNA基因的蕪湖市瘧疾病例溯源研究

胡婷婷，劉 淦，王文靜，李 磊，李夢珠，楊進孫，孫恩濤，陶香林

瘧疾是一種危害性極強的人獸共患性疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，2017年發(fā)生2.31億例瘧疾病例，造成41.6萬人死亡，2018年發(fā)生2.28億例，造成40.5萬人死亡，2018年疫情與2017年基本持平但情況仍不容樂觀[1]。各國之間頻繁的交流，增加了瘧疾向低風(fēng)險地區(qū)傳播及藥物抗性蟲株于全球范圍內(nèi)傳播擴散的風(fēng)險[2]。瘧疾溯源有助于追溯藥物抗性蟲株起源、明確瘧疾發(fā)源地及傳播路徑，及時制定應(yīng)對措施阻斷其傳播[3]。

單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)組合、微衛(wèi)星標記、單倍型網(wǎng)絡(luò)是目前用于瘧疾溯源的常規(guī)分子標記。Daniels等[4]曾選擇SNP作為分子標記進行溯源，但如何高通量獲取這些樣本的SNP仍需要測序技術(shù)及生物信息學(xué)分析方法的優(yōu)化。微衛(wèi)星標記的方法相對簡便，但各實驗室標準未完全統(tǒng)一，故在推廣應(yīng)用上存在限制性[5]。單倍型網(wǎng)絡(luò)進行溯源時，因頻繁的重組，使研究核基因組中單核苷酸多態(tài)性單倍型之間的祖先關(guān)系變得很復(fù)雜。綜上，以上方法均存在一定弊端，故選擇簡便性、特異性的分子標記物用于瘧原蟲的溯源迫在眉睫。

隨著分子生物學(xué)研究逐漸深入，發(fā)現(xiàn)不同地域間的瘧原蟲存在表型差異，且越來越多的研究選擇通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹研究瘧疾的地理起源[6-7]。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的分子標記物有mtDNA、SSU rRNA、18S rRNA等，而18S rRNA基因在確定瘧疾病原發(fā)源地時，準確性、特異性相較其他溯源分子標記物更有優(yōu)勢：18S rRNA極為保守，常作為靶基因應(yīng)用于瘧原蟲基因檢測以及真核生物種屬之間的親緣關(guān)系比較。鑒于其進化緩慢，18S rRNA基因通常也適用于古老生物的進化分析。原蟲的18S rRNA 基因在不同蟲種間的變化比原核生物、真菌和動植物間的差異大，可用來確定原蟲之間的親緣關(guān)系[8]。18S rRNA基因在瘧原蟲的各個發(fā)育階段都有表達，據(jù)此設(shè)計瘧原蟲種間特異引物相對合理，相對于瘧原蟲其他標記基因而言，更適合構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[9-14]。Snounor、Stephaine等的相關(guān)研究證明瘧原蟲18S rRNA基因是追溯瘧原蟲地理起源可靠的分子標記物[15-16]。本研究構(gòu)建瘧原蟲18S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹，建立基于瘧原蟲18S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析的溯源方法，研究瘧原蟲的地理起源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 瘧原蟲基因序列 收集皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院2018年8月至2019年9月期間4例輸入性瘧疾患者的血樣，收集樣本經(jīng)皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院倫理委員會批準。對血樣采取提取、擴增、測序等一系列操作獲得基因序列，其余地區(qū)基因數(shù)據(jù)從GenBank中搜集整理。

1.1.2 病歷資料 患者一：男，53歲，安徽省蕪湖市人，于 2019年9月從非洲回國，因頭暈頭痛、全身肌肉酸痛等癥狀到蕪湖市弋磯山醫(yī)院就診，確診為瘧疾感染?；颊叨耗?，48歲，安徽省蕪湖市人，長期于非洲工作，回國后因右上腹持續(xù)隱痛到蕪湖市弋磯山醫(yī)院就診，確診為瘧疾感染?；颊呷耗?，53歲，安徽省蕪湖市人，于2019年1月從非洲回國，因發(fā)熱、頭痛等癥狀到蕪湖市弋磯山醫(yī)院就診，確診為瘧疾感染?；颊咚模耗?，65歲，安徽省南陵縣人，在非洲尼日利亞居住4月有余，回國后因不慎摔倒出現(xiàn)大小便失禁、意識模糊癥狀到蕪湖市弋磯山醫(yī)院就診，確診為瘧疾感染。

1.1.3 主要試劑和儀器 瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(天根)、磁珠法基因組血液DNA抽提試劑盒(上海生工)、T載體PCR產(chǎn)物克隆試劑盒(上海生工生物有限公司)、小型磁力架(上海生工)、離心機(Eppendorf 5430/R)、EPS-100核酸電泳儀Power Supply(上海天能 Tanon)、PCR擴增儀(Eppendorf)、、通用化學(xué)發(fā)光、熒光和可見光成像系統(tǒng) FluorChem FC3(美國 Protein Simple公司)。

1.2 方 法

1.2.1 瘧原蟲基因提取和擴增 磁珠法基因組血液DNA抽提試劑盒(上海生工)瘧原蟲基因組DNA提取、內(nèi)外引物瘧原蟲18S rRNA基因巢式PCR擴增(瘧原蟲屬特異性引物(外)rPLU5、rPLU6、惡性瘧原蟲種特異性引物(內(nèi))rFAL1、rFAL2)。引物序列見表1。巢式PCR擴增反應(yīng)程序和體系參照朱垚吉等[10]。

表1 瘧疾患者血樣18S rRNA基因擴增引物序列

1.2.2 基因克隆測序分析 純化PCR產(chǎn)物、連接純化產(chǎn)物形成重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入DH5α感受態(tài)細胞，用含氨芐抗生素的固體培養(yǎng)皿篩選出陽性質(zhì)?？寺?，采用雙脫氧鏈末端終止法(正反向)測序，于NCBI上進行測序結(jié)果BLAST比對分析。

1.2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析 用于瘧疾溯源的18S rRNA基因參比序列從GenBank獲取，建樹所選的參比序列的地理來源包含亞洲、非洲、北美洲等地區(qū)。參比序列與血樣測序所得序列采用Clustal X、Edit Sequence軟件進行序列分析、編輯及截取。用MEGA X對基因序列進行同源性分析以及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，進化距離選項選擇Maximum Composite Likelihood，根據(jù)基因特征選擇鄰接法(N-J)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap法進行1 000次自舉檢驗。惡性瘧原蟲株來源及核苷酸序列見表2。

表2 惡性瘧原蟲株來源及核苷酸序列

2 結(jié) 果

2.1 血樣標本18S rRNA基因PCR擴增產(chǎn)物 利用合成的引物擴增4份血樣的18S rRNA基因，產(chǎn)物長度均為206 bp，經(jīng)測序和NCBI-BLAST比對，結(jié)果顯示4例患者均是感染惡性瘧原蟲。

2.2 測序標本信息 對4份血樣PCR擴增產(chǎn)物進行測序后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹并分析，結(jié)果顯示本研究采集的4份瘧疾患者血樣(序列號：MT991411-MT991414)均為非洲本地感染(見圖1)。

“*”表示本實驗研究的4份血樣所得序列

2.3 基因變異特征 4份惡性瘧血樣18S rRNA基因雙向測序、剪接、拼接得到18S rRNA的靶序列，其余惡性瘧地理株序列從 GenBank 中獲得。用Clustal X(1.81)軟件對這些序列進行排序比較及分析。惡性瘧18S rRNA靶序列長度為206 bp，其中A占比31.4%，G占比16.4%，T占比40.4%，C占比11.8%；A+T占比71.8%，C+G占比28.2%，即堿基以A+T較多見，基因變異以顛換堿基數(shù)較多見，轉(zhuǎn)換與顛換率為0.6，主要發(fā)生在第三堿基位點，見表3。

表3 惡性瘧地理株18S rRNA基因堿基對轉(zhuǎn)換、顛換數(shù)

2.4 基因同源性及遺傳距離 使用MEGA X軟件選擇Maximum Composite Likelihood法計算同源性及遺傳距離，結(jié)果如表4所示：來自非洲的惡性瘧原蟲株與來自亞洲-2的惡性瘧原蟲株同源性較近、遺傳距離較小；非洲與亞洲-1、非洲與北美洲的惡性瘧原蟲株同源均性較遠、遺傳距離均較大。

表4 非洲、亞洲、北美洲惡性瘧地理株18S rRNA基因序列的同源性及遺傳距離比較

2.5 18S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹 N-J法基于18S rRNA基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖1。23個惡性瘧原蟲株大致分成3大分支：來自亞洲的部分惡性瘧原蟲株(GenBank登錄號為：KT991230、KT991172、KT991186、GU816249)與來自非洲的惡性瘧原蟲株關(guān)系密切，形成一大分支；其余亞洲的惡性瘧原蟲株形成一大分支，且分布在進化樹的外支；來自北美洲的惡性瘧原蟲株形成另一分支。

在亞洲的惡性瘧原蟲分離株中我們發(fā)現(xiàn)了2種拓撲類型，將其命名為亞洲-1(Asia1)、亞洲-2(Asia2)。在系統(tǒng)發(fā)育樹中我們發(fā)現(xiàn)，亞洲-2與來自非洲的惡性瘧原蟲株聚為一支，推及其同源性及遺傳距離，可以看出亞洲-2與非洲的同源性近、遺傳距離小；相反地，亞洲-1與亞洲-2的同源性較遠、遺傳距離大。

3 討 論

瘧疾是瘧原蟲感染導(dǎo)致的傳染病，主要為按蚊叮咬傳播，少數(shù)為輸血傳播，存在高、低風(fēng)險區(qū)交互傳播風(fēng)險[15-16]。瘧疾溯源對于追溯瘧疾發(fā)源地或者追溯藥物抗性蟲株起源及傳播路徑的相關(guān)技術(shù)研究十分重要。

本研究基于瘧原蟲18S rRNA基因進行PCR擴增，對擴增結(jié)果進行測序分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析瘧原蟲的地理起源，相對于Moritoshi Iwagami等通過構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)分析瘧原蟲的地理起源而言，操作簡單[26-28]。由系統(tǒng)發(fā)育樹可知，所選4例惡性瘧原蟲株與系統(tǒng)發(fā)育樹內(nèi)非洲的瘧原蟲株遺傳關(guān)系較近，聚集在同一亞支，查詢患者病歷資料后發(fā)現(xiàn)實際輸入地與發(fā)育樹展示結(jié)果相符。亞洲的惡性瘧原蟲分離株呈現(xiàn)出2種拓撲類型，說明基因變異和遺傳距離可導(dǎo)致同一地區(qū)瘧原蟲株的基因序列呈現(xiàn)出地理聚集差異和不同的空間聚類特征，在系統(tǒng)發(fā)育樹中并不按照地理聚集[29-30]。北美洲的不同瘧原蟲株按照地理來源分別聚集在相同的進化亞支內(nèi)。以上證明，瘧原蟲種群會根據(jù)地理位置分成不同的亞群，且人類活動會影響種群的分配，即根據(jù)該特性構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹來判斷瘧疾地理起源具有可行性[31]。以上結(jié)果表明18S rRNA基因是進行瘧疾溯源研究的準確性、特異性的分子標記。未來可通過18S rRNA 的全基因測序進行系統(tǒng)發(fā)育分析，深入研究18S rRNA作為分子標記來判定瘧疾是本地還是外地輸入性的實用性。系統(tǒng)發(fā)育分析能夠快速準確地定位感染的地理來源，是確定輸入性疫情來源的有價值的公共衛(wèi)生工具[32-33]。

利益沖突：無