甘肅黃鼠疫源地鼠疫宿主動(dòng)物致病性耶爾森菌調(diào)查分析

徐大琴，席進(jìn)孝，段 然，景懷琦，春 花，黃燕妍，王 利，張 晨，戎賓國(guó)，展東輝，馮甲貴，師占文，安君勝

甘肅阿拉善黃鼠鼠疫自然疫源地是甘寧黃土高原阿拉善黃鼠鼠疫自然疫源地的西南部分，地處甘肅省東北部，包括白銀市的會(huì)寧縣和平川區(qū)，疫源面積6 836.9 km2。會(huì)寧縣于1962年發(fā)生新中國(guó)成立以來(lái)最嚴(yán)重的1起肺鼠疫，發(fā)病26例，死亡11例，1963年從阿拉善黃鼠及其寄生蚤體內(nèi)檢出鼠疫菌，判定為阿拉善黃鼠鼠疫疫源地。監(jiān)測(cè)資料顯示，會(huì)寧縣自1963年檢出最后1株鼠疫菌后，至今再未檢出過(guò)鼠疫菌，僅于1974-1979年間共檢出91份陽(yáng)性血清，后于1997年檢出1份陽(yáng)性血清后，再未檢出過(guò)陽(yáng)性血清，動(dòng)物間鼠疫疫情呈現(xiàn)“靜息狀態(tài)”。平川區(qū)自1977年自阿拉善黃鼠及其寄生蚤方形黃鼠蚤蒙古亞種檢出3株鼠疫菌后，判定為阿拉善黃鼠鼠疫疫源地，以后的監(jiān)測(cè)一直未檢出鼠疫菌，并自1984年檢出16份陽(yáng)性血清后，再未檢出陽(yáng)性血清，動(dòng)物間鼠疫疫情呈現(xiàn)“靜息狀態(tài)”。阿拉善黃鼠是該疫源地的主要宿主，也是優(yōu)勢(shì)種，花鼠、達(dá)烏爾鼠兔、小家鼠、中華鼢鼠、子午沙鼠等也均有分布[1]。為了解該鼠疫源地內(nèi)鼠疫宿主動(dòng)物致病性耶爾森菌感染狀況，探索該疫源地鼠疫流行狀態(tài)，我們做了以下調(diào)查。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 2016-2018年間采集歷史疫區(qū)會(huì)寧縣劉寨鄉(xiāng)，平川區(qū)種田鄉(xiāng)，復(fù)興鄉(xiāng)鼠疫宿主動(dòng)物阿拉善黃鼠及花鼠、大倉(cāng)鼠、沙土鼠、子午沙鼠、中華鼢鼠、小灰鼠、達(dá)烏爾鼠兔、小家鼠、灰倉(cāng)鼠回盲部及內(nèi)容物、咽拭子或舌根部、血液標(biāo)本。

1.2 主要儀器設(shè)備及試劑 生物安全柜(SG403-INT型、The Baker Company)、PCR儀為德國(guó)senso梯度PCR儀LabCycler Standard plus型，臺(tái)式高速離心機(jī)為德國(guó)Eppendorf公司Eppendorf centrifuge5415D，電泳儀(DYY-C6型，北京六一儀器廠)，凝膠成像儀為美國(guó)伯樂(lè)(Bio-Rad公司)GEL Doc2000。改良磷酸鹽緩沖液(PBS)(購(gòu)自Fluka, peptone sorbitol bile broth),腦心浸液培養(yǎng)基(購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司)，耶爾森菌選擇性培養(yǎng)基(購(gòu)自O(shè)XOID, Yersinia selective agar base)Api20E生化鑒定條(購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司 bioMérieux)細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(DP302)(購(gòu)自天根生化北京有限公司)，PCR擴(kuò)增用Premix Tap酶(Version 2.0 plus dye)、2 000 bp DNA Ladder(DL2000)購(gòu)自TaKaRa公司。瓊脂糖為BioWest公司，分型血清購(gòu)自日本生研株式會(huì)社。間接血凝檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自蘭州生物制品研究所)(批號(hào)：20160201,20170401,20181101)。

1.3 菌株分離及鑒定 參照文獻(xiàn)[2-3]方法將4 ℃改良磷酸鹽緩沖液(PBS)冷增菌20 d后的標(biāo)本分別接種于耶爾森菌選擇性培養(yǎng)基(CIN)平板上及進(jìn)行標(biāo)本核酸的提取。將劃線接種好的CIN平板置25 ℃培養(yǎng)48 h，選擇可疑菌落接種于腦心浸液培養(yǎng)基，25 ℃培養(yǎng)24 h后用接種針挑起菌落至懸浮基物中，仔細(xì)研勻以達(dá)到均一的細(xì)菌懸液，參照Api20E腸桿菌鑒定系統(tǒng)說(shuō)明書接種于生化鑒定條，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h后判讀結(jié)果[4]。

1.4 PCR初篩 提取的標(biāo)本核酸進(jìn)行ail、foxA、Inv、Caf1基因的PCR初篩。

PCR擴(kuò)增體系：premix12.5 μL,上、下游引物各0.5 μL，純水10.5 μL，模板1 μL。

PCR擴(kuò)增參數(shù)：95 ℃預(yù)變性5 min, 94 ℃變性15 s、57 ℃退火15 s,72 ℃延伸30 s,25個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增結(jié)束后于1.5%瓊脂糖凝膠(加入Goldview染料，濃度為5 μL/100 mL)電泳，判定結(jié)果,陽(yáng)性結(jié)果判定同文獻(xiàn)[5]。

1.5 菌株毒力鑒定及鼠血清F1抗體測(cè)定 PCR結(jié)果陽(yáng)性與Api20E結(jié)果鑒定一致的標(biāo)本分離出的菌株進(jìn)行毒力基因檢測(cè)，主要包括ail、耐熱性腸毒素A基因(ystA)、耐熱性腸毒素B基因(ystB)、黏附素基因(yadA)、轉(zhuǎn)化活化因子(virF)及rfbc[6]參考文獻(xiàn)[7]方法采集和處理鼠類血清，并按照鼠疫菌F1抗體間接血凝檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)F1抗體，判定標(biāo)準(zhǔn)參照《鼠疫診斷標(biāo)準(zhǔn)WS279-2008》。

2 結(jié) 果

2.1 標(biāo)本采集及菌株分離結(jié)果 2016-2018年間，會(huì)寧縣和平川區(qū)采集的鼠疫宿主動(dòng)物舌根部、回盲部及內(nèi)容物標(biāo)本數(shù)和菌株分離鑒定情況詳見(jiàn)表1。

表1 2016-2018年采集標(biāo)本來(lái)源及菌株分離鑒定結(jié)果

2.2 菌株毒力基因檢測(cè) 自花鼠回盲部及內(nèi)容物檢出的1株小腸結(jié)腸炎耶爾森菌為非致病性菌株，其毒力型別為(ail-ystA-ystB+yadA-virF-rfbc-)。

2.3 血清F1抗體檢測(cè) 鼠疫間接血凝試驗(yàn)方法(IHA)檢測(cè)阿拉善黃鼠血清312份，鼠疫F1抗體結(jié)果均為陰性。

3 討 論

由于3種致病性耶爾森菌之間存在相互拮抗作用，同一疫源地內(nèi)的動(dòng)物感染了某一種致病性耶爾森菌，就不會(huì)感染其他種致病性耶爾森菌[8]。會(huì)寧縣1962-2019年間有2次動(dòng)物間鼠疫流行，1962-1963年共檢出鼠疫菌16株，分離地點(diǎn)均在劉寨鄉(xiāng)[9]，且目前鼠疫流行狀態(tài)呈“靜息”[10]。會(huì)寧縣在1963年從黃鼠及其寄生蚤體內(nèi)檢出鼠疫菌后至今再未檢出鼠疫菌，自1974年被動(dòng)血凝試驗(yàn)用于動(dòng)物病的診斷后，共檢出陽(yáng)性血清92份，1997年檢出1份陽(yáng)性血清后，至今再未檢出陽(yáng)性血清；平川區(qū)自1977年檢出3株鼠疫菌后，一直未檢出鼠疫菌，1982年檢出6份陽(yáng)性，最高滴度為1∶40，1984年檢出16份陽(yáng)性，最高滴度為1∶80，后再未檢出陽(yáng)性血清。然而與會(huì)寧縣、平川區(qū)相鄰的寧夏西吉縣、海原縣分別于2003年、2004年檢出10份、3份陽(yáng)性血清[10]，推斷該疫源地局部地區(qū)有鼠疫動(dòng)物病間斷性微弱流行，鼠疫菌有可能以非典型變異的方式保存。本次調(diào)查通過(guò)了解該疫源地內(nèi)鼠疫宿主動(dòng)物致病性耶爾森菌感染狀況，探索該疫源地鼠疫流行狀態(tài)。有研究表明[11]該疫源地先后發(fā)現(xiàn)18種嚙齒動(dòng)物，隸屬2目7科11屬18種，其中阿拉善黃鼠為優(yōu)勢(shì)種。本次調(diào)查共采集到10種嚙齒動(dòng)物標(biāo)本(阿拉善黃鼠、花鼠、大倉(cāng)鼠、沙土鼠、子午沙鼠、中華鼢鼠、小灰鼠、達(dá)烏爾鼠兔、小家鼠、灰倉(cāng)鼠)，僅在花鼠的回盲部及內(nèi)容物標(biāo)本中檢出1株非致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌，這與張濤等研究[12]阿拉善黃鼠檢出率低，回盲部及內(nèi)容物標(biāo)本小腸結(jié)腸炎耶爾森菌檢出率高結(jié)果一致。本次調(diào)查因采集樣本量少，無(wú)法分析自同一只花鼠的回盲部及內(nèi)容物標(biāo)本檢出菌，而舌根部標(biāo)本卻未檢出菌，我們將做進(jìn)一步的調(diào)查分析。本次調(diào)查均在春夏季進(jìn)行，檢菌率低(0.1%)，小家鼠的小腸結(jié)腸炎耶爾森檢菌率高，可達(dá)13.9%[12]，本次調(diào)查只捕獲一只小家鼠，我們將做進(jìn)一步調(diào)查。據(jù)查證，會(huì)寧縣1962-2019年間有2次動(dòng)物間鼠疫流行，1962-1963年分別自阿拉善黃鼠體內(nèi)共檢出鼠疫菌5株，分離地點(diǎn)均在劉寨鄉(xiāng)。本次調(diào)查結(jié)果會(huì)寧縣自劉寨鄉(xiāng)檢出的1株非致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌，其毒力型別為(ail-ystA-ystB+yadA-virF-rfbc-)，這與檢出鼠疫菌鄉(xiāng)鎮(zhèn)一致，這雖然不足以說(shuō)明與段然等研究[13]結(jié)果檢出自鼠疫疫源地嚙齒類動(dòng)物的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌不致病一致，但為進(jìn)一步研究提供了線索。本次調(diào)查小腸結(jié)腸炎耶爾森菌檢出率低僅為0.1%，未檢出假結(jié)核耶爾森菌，且312份阿拉善黃鼠血清F1抗體結(jié)果均為陰性，結(jié)合王夢(mèng)迪等研究[14]結(jié)果推測(cè)該疫源地鼠疫菌可能以動(dòng)物宿主、媒介蚤、生態(tài)因子、生態(tài)環(huán)境等方式保存下來(lái)，以現(xiàn)在的監(jiān)測(cè)手段很難發(fā)現(xiàn)動(dòng)物間鼠疫的流行。甘肅黃鼠疫源地黃鼠平均密度自1963以來(lái)，呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)，其中1963-1981年間黃鼠平均密度為1.29只/hm2，1982-2019年間黃鼠平均密度為0.60只/hm2[8]。黃鼠密度下降的原因與90年代開(kāi)墾荒田、興修水利等和多年來(lái)連續(xù)滅鼠措施的實(shí)施密切相關(guān)，既改變了黃鼠最適生存生境，也使黃鼠數(shù)量減少，黃鼠分布呈小島狀或點(diǎn)狀，媒介蚤類在宿主間的交換機(jī)會(huì)也相應(yīng)減少，最終影響鼠疫自然疫源地內(nèi)由病原、宿主、媒介構(gòu)成三位體的生態(tài)系統(tǒng)，削弱了動(dòng)物間鼠疫的流行強(qiáng)度[15]。本次調(diào)查，雖未能從病原學(xué)角度解釋該疫源地動(dòng)物間鼠疫流行狀態(tài)，但從多年監(jiān)測(cè)分析該疫源地核心地帶動(dòng)物間鼠疫呈現(xiàn)間斷性微弱流行，結(jié)合其他學(xué)者徐丹丹、李瑞的研究結(jié)果[16-17]，該疫源地流行狀況可能與疫源地動(dòng)物、媒介、植被、土壤、氣象等綜合因素相關(guān)，我們將進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

利益沖突：無(wú)