貴州省2017-2018年非傷寒沙門(mén)菌臨床分離株耐藥及分子分型研究

龍 利，游 旅，韋小瑜，，李世軍，王 丹，黃俊飛，童 毅，郭 華，王 銘，汪俊華

非傷寒沙門(mén)菌(Non-typhoidal Salmonella, NTS)是引起人類感染性腹瀉和食物中毒最為常見(jiàn)的腸道致病菌之一，其感染呈全球分布[1]。全球疾病、傷害和風(fēng)險(xiǎn)因素負(fù)擔(dān)研究估計(jì)，2017年發(fā)生NTS侵襲性疾病53.5萬(wàn)例，造成77 500例死亡[2]。相關(guān)研究顯示，我國(guó)食源性NTS感染每年發(fā)病約903.5萬(wàn)人次，每年死亡估計(jì)792人，且呈上升趨勢(shì)[3]。貴州省也是沙門(mén)菌感染的高發(fā)省份，以往對(duì)貴州省腹瀉患者的細(xì)菌病原學(xué)監(jiān)測(cè)顯示，NTS是引起感染性腹瀉的主要病原菌[4-5]。由NTS感染引起的暴發(fā)事件在貴州省時(shí)有發(fā)生，2011-2016年全省共有食源性疾病暴發(fā)事件486起，其中細(xì)菌性暴發(fā)事件52起，沙門(mén)菌位列細(xì)菌性暴發(fā)事件的前3位[6]。因此對(duì)NTS的監(jiān)測(cè)和防控預(yù)警都應(yīng)引起足夠的重視。

據(jù)報(bào)道，貴州省受污染的禽類制品、食品中NTS分離率較高，且表現(xiàn)出高耐藥性[7-8]，但關(guān)于臨床上NTS的耐藥性和分子分型的相關(guān)研究未有系統(tǒng)性的報(bào)道。本研究對(duì)2017-2018年貴州省NTS臨床分離株的耐藥性及PFGE分子分型進(jìn)行分析，為貴州省沙門(mén)菌的防控提供相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源 以貴州省17家哨點(diǎn)醫(yī)院為監(jiān)測(cè)點(diǎn)，除了2家為婦幼保健院，其余15家均為綜合性醫(yī)院。將符合以下兩條及以上的患者列為沙門(mén)菌監(jiān)測(cè)對(duì)象：1)24 h內(nèi)連續(xù)腹瀉3次及以上且伴有稀便、水樣便、粘液便等糞便性狀異常者；2)出現(xiàn)發(fā)熱，體溫達(dá)38 ℃以上，伴有頭痛、寒戰(zhàn)、全身乏力等癥狀；3)出現(xiàn)嘔吐、腹瀉、腹痛等癥狀。2017年1月至2018年12月，共收集到191株NTS菌株。質(zhì)控菌株布倫登盧普沙門(mén)菌(H 9812)和大腸埃希菌(ATCC 25922)。

1.2 主要試劑和儀器XbaI酶為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品；沙門(mén)菌顯色培養(yǎng)基為法國(guó)CHROM Agar公司產(chǎn)品；API20E生化鑒定條為法國(guó)生物梅里埃公司產(chǎn)品；沙門(mén)菌診斷血清為丹麥SSI公司產(chǎn)品；蛋白酶K為德國(guó)Merck公司產(chǎn)品；革蘭陰性需氧藥敏檢測(cè)板為上海星佰生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；CHEF MapperTM脈沖場(chǎng)電泳儀、Gel Doc2000凝膠成像系統(tǒng)為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.3 菌株的復(fù)核及血清分型 菌株接種至科瑪嘉沙門(mén)菌顯色培養(yǎng)基上，36 ℃培養(yǎng)過(guò)夜,從培養(yǎng)基上挑取淡紫色可疑菌落接種至克氏雙糖和動(dòng)力-靛基質(zhì)-尿素培養(yǎng)基進(jìn)行初步生化鑒定。符合沙門(mén)菌初步生化的菌株進(jìn)一步采用API20E生化鑒定板條進(jìn)行系統(tǒng)生化鑒定,對(duì)明確鑒定為非傷寒沙門(mén)菌的菌株轉(zhuǎn)種至血瓊脂平板，36 ℃培養(yǎng)18～24 h。挑取少許菌苔進(jìn)行沙門(mén)菌O、H相多價(jià)、單價(jià)玻片血清凝集，生理鹽水作陰性對(duì)照。根據(jù)White-Kauffmann-Le Minor抗原表確定對(duì)應(yīng)血清型別。

1.4 藥物敏感性試驗(yàn) 采用美國(guó)臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI2017)推薦的微量肉湯稀釋法測(cè)定最小抑菌濃度(MIC)。本實(shí)驗(yàn)共測(cè)定10類16種抗生素，環(huán)丙沙星、鏈霉素、氨芐西林、氯霉素、磺胺異惡唑、復(fù)方新諾明、萘啶酸、阿莫西林/克拉維酸鉀、頭孢曲松、多西環(huán)素、慶大霉素、阿奇霉素、四環(huán)素、頭孢西丁、頭孢吡肟、亞胺培南。ATCC 25922作為質(zhì)控菌株，Whonet 5.6軟件分析結(jié)果，操作過(guò)程參照文獻(xiàn)[9]。3類或以上抗生素同時(shí)耐藥定義為多重耐藥株(Multi-drug resistance，MDR)。

1.5 PFGE分子分型 根據(jù)國(guó)際PulseNet網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室公布的沙門(mén)菌PFGE標(biāo)準(zhǔn)分型方法，對(duì)分離的非傷寒沙門(mén)菌進(jìn)行PFGE分子分型，H 9812作為質(zhì)控菌株。XbaI 37 ℃酶切3 h，Gelred染色30 min，純水脫色10 min，用Gel Doc 2000凝膠成像系統(tǒng)拍攝圖像并將其保存。上傳條帶至 BioNumerics軟件包(Version7.6)對(duì)指紋圖譜進(jìn)行識(shí)別、處理，使用非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法(unweighted pair group method with arithmetic averages,UPGMA)進(jìn)行菌株聚類分析。

2 結(jié) 果

2.1 NTS地區(qū)分布及血清型分布 2017-2018年共分離出NTS 191株，其中2017年105株(55.0%)，2018年86株(45.0%)。共分出18種血清型，有8株血清型未分型，其中鼠傷寒沙門(mén)菌87株(45.5%)，腸炎沙門(mén)菌56株(29.3%)，這兩種血清型為貴州省NTS主要血清型。貴陽(yáng)市、安順市、黔東南州以鼠傷寒沙門(mén)菌和腸炎沙門(mén)菌為主；六盤(pán)水市以腸炎沙門(mén)菌和倫敦沙門(mén)菌為主；遵義市以鼠傷寒沙門(mén)菌為主，其次為德?tīng)柋吧抽T(mén)菌；畢節(jié)市和黔南州以腸炎沙門(mén)菌為主。菌株的地區(qū)分布和血清型分布見(jiàn)表1。

表1 貴州省2017-2018年非傷寒沙門(mén)菌各地區(qū)血清型分布

2.2 NTS藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果 96.8%(185/191)的菌株對(duì)至少一種抗生素產(chǎn)生耐藥。對(duì)磺胺異惡唑(82.7%，158/191)、鏈霉素(81.7%，156/191)、氨芐西林(80.6%，154/191)、四環(huán)素(68.1%，130/191)、多西環(huán)素(63.4%，121/191)高度耐藥。NTS對(duì)一代喹諾酮類藥物萘啶酸耐藥率較高，達(dá)48.2%(92/191)，對(duì)三代氟喹諾酮類藥物環(huán)丙沙星耐藥率為13.1%(92/191)，中介率達(dá)68.1%(130/191)。頭孢菌素類藥物中，第三代頭孢曲松耐藥率最高，為7.9%，第四代頭孢吡肟和第二代頭孢西丁耐藥率分別為6.3%(12/191)、1.6%(3/191)。出現(xiàn)7株對(duì)環(huán)丙沙星和頭孢曲松共同耐藥的菌株，占所有菌株的3.7%(7/191)，在這7株菌中，有3株還對(duì)阿奇霉素耐藥。此外，還出現(xiàn)2株菌對(duì)亞胺培南耐藥。優(yōu)勢(shì)血清中，鼠傷寒沙門(mén)菌和腸炎沙門(mén)菌兩者均對(duì)鏈霉素、氨芐西林、磺胺異惡唑產(chǎn)生較高的耐藥率，在78%～91%之間。鼠傷寒沙門(mén)菌對(duì)氯霉素(66.3%，58/87)、復(fù)方新諾明(59.3%，52/58)、多西環(huán)素(80.2%，70/87)、四環(huán)素(81.4%，70/87)耐藥性較高，腸炎沙門(mén)菌對(duì)萘啶酸耐藥性高度耐藥，耐藥率達(dá)96.5%(54/56)。各種抗生素的藥敏結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 貴州省2017-2018年非傷寒沙門(mén)菌耐藥情況(%)

2.3 耐藥譜 191株NTS菌株共形成69種耐藥譜型，主要譜型為：氨芐西林+鏈霉素+磺胺異惡唑+萘啶酸(28株，14.7%)和氨芐西林+氯霉素+鏈霉素+磺胺異惡唑+四環(huán)素+多西環(huán)素+復(fù)方新諾明(27株，14.1%)。87株鼠傷寒沙門(mén)菌形成38種耐藥譜型，以氨芐西林+氯霉素+鏈霉素+磺胺異惡唑+四環(huán)素+多西環(huán)素+復(fù)方新諾明(21株，24.1%)為主要耐藥譜型，其次為氨芐西林+氯霉素+磺胺異惡唑+多西環(huán)素(11株，12.6%)。56株腸炎沙門(mén)菌形成18種耐藥譜型，氨芐西林+鏈霉素+磺胺異惡唑+萘啶酸(27株，48.2%)為主要耐藥譜型，其次為氨芐西林+鏈霉素+磺胺異惡唑+萘啶酸+四環(huán)素+多西環(huán)素(7株，12.5%)。

2.4 多重耐藥 2017-2018年貴州省NTS多重耐藥率為84.3%(161/191)，鼠傷寒沙門(mén)菌多重耐藥率為90.8%(79/87)，腸炎沙門(mén)菌多重耐藥率為83.9%(47/56)。多重耐藥菌株中，對(duì)5類抗生素耐藥的最多，占比為38.5%(62/161)，其次為4耐類，占比為32.3%(52/161)。一部分菌株出現(xiàn)對(duì)6類及以上的抗生素耐藥，6耐類抗生素的菌株有22株，7耐類抗生素的菌株有13株，8耐類抗生素的菌株有5株，9耐類抗生素的菌株有1株。各市(州)均分離到多重耐藥菌株，多重耐藥率最高的是銅仁市(91.4%，53/58)，其次是安順市(90.5%，19/21)和六盤(pán)水市(90.0%，9/10)，其余市(州)多重耐藥率分別為：貴陽(yáng)市(88.2%，30/34)、黔東南州(85.0%，17/20)、黔南州(83.3%，10/12)、遵義市(64.3%，18/28)、畢節(jié)市(62.5%，5/8)。

2.5 PFGE分子分型和聚類分析 所有NTS菌株經(jīng)XbaI酶切電泳后，188株菌株得到較好分離，有3株未跑出條帶。按照PFGE圖譜相似度為100.0%時(shí)為同一型別，對(duì)主要血清型鼠傷寒沙門(mén)菌和腸炎沙門(mén)菌分別進(jìn)行PFGE圖譜聚類分析。

2.5.1 鼠傷寒沙門(mén)菌聚類分析結(jié)果 87株鼠傷寒沙門(mén)菌經(jīng)PFGE分型后，共獲得60種帶型，命名為JPXX01.GZ0001～JPXX01.GZ0060。11種帶型包括2株及以上的菌株，優(yōu)勢(shì)帶型JPXX01.GZ0047有11株(12.6%),包括貴陽(yáng)市4株，銅仁市4株，遵義市2株；JPXX01.GZ0051有5株(5.7%)，JPXX01.GZ0038、JPXX01.GZ0042、JPXX01.GZ0046各有3株(3.4%)，6種帶型各有2株(2.3%)，其余53種帶型均為1株(1.1%)。3種帶型跨年份交叉出現(xiàn)，5種帶型跨地區(qū)出現(xiàn)，JPXX01.GZ0047、JPXX01.GZ0050、JPXX01.GZ0051存在跨地區(qū)跨年份帶型相同的菌株。觀察同一帶型菌株的耐藥譜發(fā)現(xiàn)，有4種帶型的同源菌株耐藥譜完全一致；而有一部分耐藥譜相同的菌株沒(méi)有聚類特征，如主要耐藥譜氨芐西林+氯霉素+鏈霉素+磺胺異惡唑+四環(huán)素+多西環(huán)素+復(fù)方新諾明分布在11個(gè)型別中(見(jiàn)圖1)。

注：“Resistance profile”中ACSSuTNDG分別表示氨芐西林、氯霉素、鏈霉素、磺胺異惡唑、四環(huán)素、萘啶酸、多西環(huán)素、慶大霉素，CIP、SXT、AMC、AZM、CRO、FOX、FEP、IMP分別表示環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明、阿莫西林/克拉維酸鉀、阿奇霉素、頭孢曲松、頭孢西丁、頭孢吡肟、亞胺培南，”——“表示敏感

2.5.2 腸炎沙門(mén)菌聚類分析結(jié)果 56株腸炎沙門(mén)菌經(jīng)PFGE分型后，共獲得21種帶型，命名為JEGX01.GZ0001～JEGX01.GZ0021。6種帶型包含2株及以上的菌株，其中JEGX01.GZ0005有13株(23.3%),為優(yōu)勢(shì)帶型，包括銅仁市5株，黔東南州3株，安順市3株，黔南州2株；次優(yōu)勢(shì)帶型JEGX01.GZ0007有12株(21.4%)，分布于5個(gè)地市(州)；JEGX01.GZ0004有8株(14.3%)，JEGX01.GZ0001有4株(7.1%)，2種帶型各有2株(3.6%)，其余15種帶型均為1株(1.8%)。有3種帶型存在跨地區(qū)跨年份帶型相同的菌株。結(jié)合PFGE帶型與耐藥譜分析結(jié)果顯示，氨芐西林+鏈霉素+磺胺異惡唑+萘啶酸和氨芐西林+鏈霉素+磺胺異惡唑+四環(huán)素+萘啶酸+多西環(huán)素為JEGX01.GZ0005的主要耐藥譜，JEGX01.GZ0007的優(yōu)勢(shì)耐藥譜為氨芐西林+鏈霉素+磺胺異惡唑+萘啶酸，其余帶型的耐藥表型分布較為分散，見(jiàn)圖2。

注：“Resistance profile”中ACSSuTNDG分別表示氨芐西林、氯霉素、鏈霉素、磺胺異惡唑、四環(huán)素、萘啶酸、多西環(huán)素、慶大霉素，CIP、SXT、AMC、AZM、CRO、FOX、FEP、IMP分別表示環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明、阿莫西林/克拉維酸鉀、阿奇霉素、頭孢曲松、頭孢西丁、頭孢吡肟、亞胺培南

3 討 論

NTS是一類危害動(dòng)物和人類健康的重要人獸共患致病菌，給全球的公共衛(wèi)生造成重大的負(fù)擔(dān)[2-3]。血清型分型是NTS重要的表型之一，也是流行病學(xué)研究的基礎(chǔ)，有助于實(shí)現(xiàn)病原微生物的溯源分析，對(duì)NTS的防控和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估具有重要意義。貴州省2017-2018年NTS臨床患者血清型分布呈現(xiàn)多樣性，主要血清型為鼠傷寒沙門(mén)菌和腸炎沙門(mén)菌，與廣州市、重慶市報(bào)道的結(jié)果相似[10-11]，與安徽省馬鞍山市報(bào)道的阿貢納沙門(mén)菌為當(dāng)?shù)氐膬?yōu)勢(shì)血清型有所區(qū)別[12]，說(shuō)明NTS血清型分布有一定的區(qū)域特點(diǎn)。貴州省各市(州)分離的菌株中，菌株數(shù)多的三個(gè)市(州)為銅仁市、貴陽(yáng)市、遵義市，其原因可能與各市(州)沙門(mén)菌的流行情況，標(biāo)本的采樣及分離技術(shù)、送檢是否及時(shí)有關(guān)，提示在今后的監(jiān)測(cè)工作中需加強(qiáng)對(duì)各監(jiān)測(cè)點(diǎn)的培訓(xùn)及監(jiān)測(cè)力度，完善相關(guān)工作。各地區(qū)主要血清型別有所差異，提示實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)全省NTS的動(dòng)態(tài)變化至關(guān)重要，針對(duì)各地區(qū)流行的血清型做好防控措施。

國(guó)內(nèi)外研究顯示，耐藥性NTS近年來(lái)引起了全球的關(guān)注，成為醫(yī)療機(jī)構(gòu)面臨的重大問(wèn)題[2,13]。本次藥敏結(jié)果顯示，磺胺異惡唑、鏈霉素、氨芐西林、四環(huán)素、多西環(huán)素耐藥率超過(guò)60%，此結(jié)果高于2016年中國(guó)26個(gè)省市食源性沙門(mén)菌的整體耐藥水平[14]。沙門(mén)氏菌受血清型的影響很大，部分血清型對(duì)某些抗菌藥物表現(xiàn)出較高水平的耐藥性。研究結(jié)果顯示，鼠傷寒沙門(mén)菌對(duì)氯霉素、復(fù)方新諾明、多西環(huán)素、四環(huán)素表現(xiàn)出高度耐藥，腸炎沙門(mén)菌對(duì)萘啶酸的耐藥率和環(huán)丙沙星的中介率高于其他血清型，具體原因尚不清楚。

喹諾酮類和頭孢菌素類抗菌藥物目前分別是臨床上治療成人和兒童NTS感染使用最廣泛的抗生素。在兒童中，頭孢菌素對(duì)于治療嚴(yán)重的腹瀉和侵襲性NTS感染至關(guān)重要，若對(duì)頭孢曲松這類超廣譜頭孢菌素耐藥將會(huì)給臨床上抗NTS感染增添更嚴(yán)重的問(wèn)題。不同地區(qū)報(bào)道的頭孢曲松耐藥性有所不同，但總體呈上升趨勢(shì)[15-16]。191株NTS菌株中，15株(7.9%)對(duì)頭孢曲松耐藥。各市(州)對(duì)頭孢曲松耐藥率在0%～19.0%之間，以安順市(19.0%)最高，黔東南州(15.0%)次之。喹諾酮類抗菌藥物中，萘啶酸耐藥率較高，環(huán)丙沙星耐藥率雖不是很高，但表現(xiàn)出非常高的中介率，這部分菌株應(yīng)引起我們的重視。值得注意的是，本次藥敏實(shí)驗(yàn)中，出現(xiàn)了對(duì)環(huán)丙沙星和頭孢曲松、阿奇霉素共同耐藥的菌株，阿奇霉素被證明治療NTS感染的效果與超廣譜頭孢菌素類和氟喹諾酮類藥相當(dāng)，同時(shí)對(duì)這3種重要的抗生素耐藥，若出現(xiàn)NTS暴發(fā)感染，臨床治療將變得非常困難。

NTS多重耐藥的流行已成為人類健康的重大威脅，本次研究多重耐藥率已超過(guò)80%，高于美國(guó)、歐盟報(bào)道的人源NTS分離株的多重耐藥性[15,17]。銅仁市、安順市、六盤(pán)水市的多重耐藥菌株高達(dá)90.0%，遠(yuǎn)高于國(guó)內(nèi)部分城市[7-8]。菌株的耐藥譜結(jié)果顯示，所有菌株共形成69種耐藥譜型，優(yōu)勢(shì)耐藥譜型與其他地區(qū)不同[9,13,18]，其原因可能與區(qū)域血清型別、抗生素的使用量和種類有關(guān)。在20世紀(jì) 80年代出現(xiàn)了一種典型的多重耐藥表型DT104，表現(xiàn)出對(duì)氨芐西林、氯霉素、鏈霉素、磺胺類和四環(huán)素類抗菌藥物同時(shí)耐藥(即ACSSuT)，具有這種耐藥模式的沙門(mén)氏菌感染者比敏感感染者可能住院時(shí)間更長(zhǎng)和死亡[19]。本次研究有72株(38.0%)菌株出現(xiàn)這種耐藥模式，若這種耐藥模式的菌株持續(xù)存在，將會(huì)影響貴州省NTS感染患者的臨床治療。碳青霉烯類抗菌藥物作為抗生素“多重耐藥的一道防線”，菌株對(duì)該類藥物產(chǎn)生抗性說(shuō)明耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重[10]。此次研究，出現(xiàn)2株菌株對(duì)亞胺培南產(chǎn)生耐藥，提示貴州省的NTS多重耐藥形勢(shì)嚴(yán)峻。

PFGE作為細(xì)菌分型的“金標(biāo)準(zhǔn)”，利用不同菌株的電泳圖譜具有高度特異性，成為流行病學(xué)監(jiān)測(cè)、感染控制和暴發(fā)調(diào)查中使用最廣泛的方法之一[20]。經(jīng)PFGE分型，除鼠傷寒、腸炎、德?tīng)柋吧抽T(mén)菌中有一部分菌株有聚類特征外，其他血清型的沙門(mén)菌沒(méi)有出現(xiàn)聚類現(xiàn)象，總體呈現(xiàn)多態(tài)性，與國(guó)內(nèi)外研究相似[21-22]。腸炎沙門(mén)菌聚類結(jié)果顯示，較多的菌株條帶相似度為100.0%，表明貴州省存在腸炎沙門(mén)菌散發(fā)流行的可能，應(yīng)做好早期預(yù)防和預(yù)警。鼠傷寒沙門(mén)菌PFGE型別分散、帶型復(fù)雜，該血清型的菌株防控難度較大，應(yīng)做好全方位的防控措施。這兩種血清型均有跨年份跨地區(qū)的同一帶型的菌株，表明可能在某些食品的原材料、加工、銷售等環(huán)節(jié)中存在持續(xù)的污染源，人員的流動(dòng)性、食品的貿(mào)易等使病原菌跨地區(qū)跨年份傳播和蔓延。帶型相同的菌株主要集中在菌株分離數(shù)較多的銅仁市、貴陽(yáng)市和遵義市，呈地域的聚集性。鼠傷寒沙門(mén)菌JPXX01.GZ0006型的兩株菌分離自同一天，均為銅仁市思南縣分離株，且耐藥表型相似，不排除這兩株菌來(lái)源于同一感染源。本研究中，PFGE分型與耐藥表型存在一定的相關(guān)性，根據(jù)這種關(guān)聯(lián)性有助于發(fā)現(xiàn)耐藥菌株。同時(shí)，耐藥表型不同卻出現(xiàn)相同的PFGE帶型，提示不同菌株基因組的特性有所差異，后續(xù)可結(jié)合耐藥基因檢測(cè)進(jìn)行更深入的研究。

利益沖突：無(wú)