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    細(xì)胞周期蛋白L1對(duì)人絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

    2021-08-06 03:31:34楊閃閃唐冉冉江華湯秋勤
    實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志 2021年14期
    關(guān)鍵詞:細(xì)胞周期胎盤試劑盒

    楊閃閃 唐冉冉 江華 湯秋勤

    1南京醫(yī)科大學(xué)(南京210029);2南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院(南京市婦幼保健院)(南京210004)

    胎兒生長(zhǎng)受限(fetal growth restriction,F(xiàn)GR)指胎兒應(yīng)有的生長(zhǎng)潛力受損,估測(cè)的胎兒體質(zhì)量小于同孕齡第10 百分位數(shù)的小于孕齡兒[1]。我國(guó)FGR 平均發(fā)病率為6.39%[2]。 FGR 會(huì)增加胎兒窘迫、早產(chǎn)、死產(chǎn)等多種不良妊娠結(jié)局,對(duì)子代遠(yuǎn)期健康也會(huì)造成不良影響[3]。FGR 發(fā)病機(jī)制尚不明確,母親對(duì)胎兒的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)主要通過胎盤轉(zhuǎn)運(yùn),胎盤發(fā)育缺陷或功能障礙往往導(dǎo)致FGR[4]。滋養(yǎng)層細(xì)胞是胎盤最主要和最重要的成分,了解滋養(yǎng)層細(xì)胞功能的影響因素,從胎盤層面尋找FGR 防治的新分子并深入研究相關(guān)機(jī)制十分必要。

    細(xì)胞周期蛋白L1(cyclin L1,CCNL1)定位于3q25.31,是細(xì)胞周期蛋白家族成員之一,參與前體mRNA 的剪切及RNA 的加工,并與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的作用相關(guān)[5]。多個(gè)GWASs 研究在《Nature Genetics》等雜志上報(bào)道了CCNL1 為新生兒出生體重相關(guān)基因[6-9],位于CCNL1 附近的rs900400 與出生體重降低顯著相關(guān),每個(gè)風(fēng)險(xiǎn)等位基因可使出生體重降低35 g[8]。本研究通過體外實(shí)驗(yàn)將滋養(yǎng)細(xì)胞過表達(dá)和干擾CCNL1 基因后,觀察滋養(yǎng)細(xì)胞遷移、侵襲、增殖能力及細(xì)胞周期、凋亡的變化,為FGR 發(fā)病機(jī)制的研究提供新的思路。

    1 材料與方法

    1.1 主要試劑和細(xì)胞人絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞(HTR8?/SVneo)為本實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)存細(xì)胞株。CCNL1 過表達(dá)慢病毒及其對(duì)照慢病毒購(gòu)自漢恒生物科技有限公司、CCNL1 小干擾RNA 及其小干擾對(duì)照RNA 購(gòu)自銳博生物科技有限公司;轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000 和Trizol 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR 試劑盒和蛋白Marker 購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司;電泳、轉(zhuǎn)膜相關(guān)試劑購(gòu)自賽維爾生物科技有限公司;實(shí)驗(yàn)所用抗體購(gòu)自美國(guó)SANTA CRUZ 公司;CCK?8 試劑盒購(gòu)自日本Dojindo 公司;Transwell 試劑盒購(gòu)自美國(guó)Corning 公司;細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司;細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)HTR?8/SVneo 培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基,于37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

    1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前1 d 將HTR?8/SVneo 細(xì)胞分別消化并接種于六孔板,待細(xì)胞融合度達(dá)60%~ 70%,按照Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑說明書和慢病毒轉(zhuǎn)染方法操作。將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞分為CCNL1過表達(dá)對(duì)照組(CCNL1?NC)、CCNL1 過表達(dá)組(CCNL1?OE);干擾對(duì)照組(CCNL1?SiNC)、干擾組1(CCNL1?Si1)、干擾組2(CCNL1?Si2)、干擾組3(CCNL1?Si3)。

    1.2.3 總RNA 提取及實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)轉(zhuǎn)染24 h 后,按照Trizol 法提取細(xì)胞中的RNA 并測(cè)定濃度,參照Thermo 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,反轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照SYBGreen 說明書操作,于Thermo 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 進(jìn)行分析,以2?△△Ct平均值作為其mRNA 表達(dá)水平。

    1.2.4 蛋白質(zhì)提取及WB 法檢測(cè)轉(zhuǎn)染48 h 后,使用RIPA 和PMSF 提取蛋白,參照BCA 蛋白定量試劑盒說明書測(cè)定蛋白濃度,然后按照WB 法操作,最后用Image J 軟件分析,以目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值作為CCNL1 蛋白相對(duì)表達(dá)量。

    1.2.5 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染24 h后,將HTR?8/SVneo細(xì)胞接種于96孔板中,密度為3 000個(gè)/孔。分別于0(即細(xì)胞貼壁后)、24、48、72 h向每孔加入10 μL 的CCK?8 溶液,培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h 后,檢測(cè)450 nm 的吸光度值。

    1.2.6 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)提前將基質(zhì)膠4 ℃融化后加入Transwell 小室上層,37 ℃溫育凝固成膠狀。分別收集各組細(xì)胞,用不含F(xiàn)BS 的培養(yǎng)基稀釋后,按照3 × 104個(gè)/孔加入小室上層,下層加入600 μL完全培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)72 h 后,加入4%多聚甲醛內(nèi)固定,結(jié)晶紫染色,用棉棒將小室內(nèi)層未遷移過膜的細(xì)胞擦除,顯微鏡下拍照后統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

    1.2.7 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)Transwell 小室上層無需鋪基質(zhì)膠,其余步驟均同侵襲實(shí)驗(yàn)。

    1.2.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期用不含EDTA的胰酶消化后分別收集各組細(xì)胞,70%乙醇4 ℃固定過夜。離心后棄上清液,加入預(yù)冷PBS 輕輕振蕩重懸細(xì)胞。離心收集細(xì)胞后加入配置好的碘化丙啶染色液染色、濾網(wǎng)過濾,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

    1.2.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡用不含EDTA的胰酶消化后分別收集各組細(xì)胞,離心后棄上清液,加入預(yù)冷PBS 輕輕振蕩重懸細(xì)胞,離心收集細(xì)胞后加入Annexin V?PE 和7?AAD 避光、室溫孵后濾網(wǎng)過濾,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn),以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 CCNL1 轉(zhuǎn)染效果檢測(cè)qPCR 檢測(cè)和WB 檢測(cè)結(jié)果顯示,與CCNL1?NC 組相比,CCNL1?OE 組CCNL1mRNA 和蛋白表達(dá)水平升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖1、2;與CCNL1?SiNC 組相比,CCNL1?Si1 組、CCNL1?Si2 組、CCNL1?Si3 組CCNL1 mRNA 和蛋白表達(dá)水平降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖1、2。

    圖1 各組HTR?8/SVneo 細(xì)胞中CCNL1 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平Fig.1 Relative mRNA levels of CCNL1 in HTR?8/SVneo cells in each group

    圖2 各組HTR?8/SVneo 細(xì)胞中CCNL1 蛋白相對(duì)表達(dá)水平Fig.2 Relative protein levels of CCNL1 in HTR?8/SVneo cells in each group

    2.2 CCNL1 表達(dá)變化對(duì)HTR?8/SVneo 細(xì)胞增殖的影響CCK?8 實(shí)驗(yàn)顯示,轉(zhuǎn)染24、48、72 h 后,與CCNL1?NC 組相比,CCNL1?OE 組的細(xì)胞活性減弱,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見圖3A;轉(zhuǎn)染24、48、72 h 后,與CCNL1?SiNC 組相比,CCNL1?Si1 組、CCNL1? Si2 組、CCNL1?Si3 組的細(xì)胞活性增強(qiáng),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見圖3B。

    圖3 各組HTR?8/SVneo 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Results of HTR?8/SVneo cell proliferation in each group

    2.3 CCNL1 表達(dá)變化對(duì)HTR?8/SVneo 細(xì)胞侵襲的影響Transwell實(shí)驗(yàn)顯示,與CCNL1?NC組相比,CCNL1?OE 組穿膜侵襲細(xì)胞數(shù)降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),見圖4 和表1;與CCNL1?SiNC組相比,CCNL1?Si1 組、CCNL1? Si2 組、CCNL1?Si3組穿膜侵襲細(xì)胞數(shù)增多,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),見圖4 和表1。

    圖4 各組HTR?8/SVneo 細(xì)胞侵襲室驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Results of HTR?8/SVneo cell invasion in each group

    2.4 CCNL1 表達(dá)變化對(duì)HTR?8/SVneo 細(xì)胞遷移的影響Transwell實(shí)驗(yàn)顯示,與CCNL1?NC組相比,CCNL1?OE 組穿膜遷移細(xì)胞數(shù)降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),見圖5和表1;與CCNL1?SiNC組相比,CCNL1?Si1 組、CCNL1?Si2 組、CCNL1?Si3 組穿膜遷移細(xì)胞數(shù)增多,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),見圖5 和表1。

    圖5 各組HTR?8/SVneo 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.5 Results of HTR?8/SVneo cell migration in each group

    表1 各組HTR?8/SVneo 穿膜細(xì)胞數(shù)比較Tab.1 Comparison of the number of HTR?8/SVneo penetrating cells in each group ±s

    表1 各組HTR?8/SVneo 穿膜細(xì)胞數(shù)比較Tab.1 Comparison of the number of HTR?8/SVneo penetrating cells in each group ±s

    注:CCNL1?Si1 組與CCNL1?SiNC 組比較,aP <0.001;CCNL1?Si2組與CCNL1?SiNC 組比較,bP <0.001;CCNL1?Si3 組與CCNL1?SiNC組比較,cP <0.001

    組別CCNL1?OE 組CCNL1?NC 組t 值P 值CCNL1?Si1 組CCNL1?Si2 組CCNL1?Si3 組CCNL1?SiNC 組F 值P 值穿膜侵襲細(xì)胞數(shù)(個(gè))104.67±9.02 403.33±7.09 45.08<0.001 104.00±9.17a 153.67±9.45b 254.33±9.71c 53.33±7.51 272.33<0.001穿膜遷移細(xì)胞數(shù)(個(gè))74.33±9.07 205.00±12.53 14.63<0.001 112.67±8.50a 104.33±11.68b 123.67±7.02c 45.00±10.82 39.61<0.001

    2.5 CCNL1 表達(dá)變化對(duì)HTR?8/SVneo 細(xì)胞周期的影響流式分析結(jié)果顯示,分別與CCNL1?NC 組細(xì)胞的G1 期、S 期、G2 期相比,CCNL1?OE 組細(xì)胞的G1 期和G2 期細(xì)胞比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),S 期細(xì)胞比例降低(P<0.05),見圖6 和表2;分別與CCNL1?SiNC 組細(xì)胞的G1 期、S 期、G2 期相比,干擾組(CCNL1?Si1、CCNL1?Si2、CCNL1?Si3)的G1 期、S 期、G2 期細(xì)胞比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見圖6 和表2。

    表2 各組HTR?8/SVneo 細(xì)胞周期比例比較Tab.2 Comparison of cell cycle ratio of HTR?8/SVneo in each group ±s

    表2 各組HTR?8/SVneo 細(xì)胞周期比例比較Tab.2 Comparison of cell cycle ratio of HTR?8/SVneo in each group ±s

    注:CCNL1?OE 組與CCNL1?NC 組比較,dP <0.05

    組別CCNL1?OE 組CCNL1?NC 組t 值P 值CCNL1?Si1 組CCNL1?Si2 組CCNL1?Si3 組CCNL1?SiNC 組F 值P 值G1 期60.14±1.96 57.18±2.03 1.48 0.28 52.39±0.64 55.55±2.72 51.81±0.36 51.41±0.91 3.25 0.14細(xì)胞周期(%)S 期18.53±0.38d 21.61±0.41-0.77 0.02 24.59±1.92 24.49±1.10 26.97±1.00 26.52±0.81 2.02 0.25 G2 期21.33±1.57 21.21±2.44 0.06 0.96 23.03±1.28 19.96±1.61 21.23±1.36 22.08±1.71 1.50 0.34

    圖6 CCNL1 過表達(dá)或干擾對(duì)細(xì)胞周期的影響Fig.6 Effects of CCNL1 overexpression or interference on cell cycle

    2.6 CCNL1 表達(dá)變化對(duì)HTR?8/SVneo 細(xì)胞凋亡的影響流式分析結(jié)果顯示,CCNL1?OE組和CCNL1?NC 組中凋亡細(xì)胞比例分別為(8.52 ± 0.99)%和(11.42 ± 0.16)%,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見圖7。

    圖7 CCNL1 過表達(dá)或干擾對(duì)細(xì)胞凋亡的影響Fig.7 Effects of CCNL1 overexpression orInterference on cell apoptosis

    3 討論

    FGR 是一種常見的新生兒出生體重異常疾病,發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,目前仍未闡明。胎盤是胚胎生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵器官,承擔(dān)母體及胎兒之間營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)。研究[10-12]表明FGR 胎盤組織中存在著異常表達(dá)的基因,這些基因可通過調(diào)控胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的功能,改變滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲、遷移能力,打破胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞增殖/凋亡平衡而導(dǎo)致胎盤功能障礙,與FGR 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

    近年來,多個(gè)研究報(bào)道了CCNL1為新生兒出生體重相關(guān)基因,與FGR 的發(fā)生密切相關(guān)。研究[13]發(fā)現(xiàn)CCNL1 家族成員Cyclin D1 敲除后,小鼠出生體重下降,發(fā)育異常率增加,CCNL1 基因與FGR 間的關(guān)系引起人們關(guān)注。CCNL1 是細(xì)胞周期蛋白家族的一員,參與前體mRNA 的剪切及RNA 的加工,并與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的作用相關(guān)[14]。目前國(guó)內(nèi)外有很多研究發(fā)現(xiàn),CCNL1 在腫瘤進(jìn)展方面發(fā)揮重要作用,被認(rèn)為是腫瘤預(yù)后因子和調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖因子,研究發(fā)現(xiàn)CCNL1 可以改變多種腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移能力[15-18]。胎盤被認(rèn)一種類腫瘤組織,其功能細(xì)胞——滋養(yǎng)細(xì)胞具有與腫瘤細(xì)胞相似的侵襲及增殖行為,不同之處在于腫瘤不受控制,而人滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲局限于子宮內(nèi)膜和子宮肌層的上三分之一處[19]。故猜測(cè)CCNL1基因在胎盤的發(fā)育和功能中也發(fā)揮一定作用。但目前CCNL1 調(diào)控胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞功能作用機(jī)制并不完全清楚。

    本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),CCNL1 在HTR?8/SVneo 中過表達(dá)后,細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移能力降低,而CCNL1 在HTR?8/SVneo 中干擾后,細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移能力增強(qiáng)。細(xì)胞周期分為間期與分裂期兩個(gè)階段。間期又分為三期、即DNA 合成前期(G1 期)、DNA 合成期(S 期)與DNA 合成后期(G2 期),CCNL1 在HTR?8/SVneo 中過表達(dá)后,細(xì)胞阻滯于S 期。這些結(jié)果均表明CCNL1 在HTR?8/SVneo中是一個(gè)抑制增殖因子。推測(cè)過表達(dá)CCNL1基因會(huì)減少滋養(yǎng)層細(xì)胞侵入子宮蛻膜與子宮肌層能力,導(dǎo)致胎盤的淺著床,不利于子宮螺旋動(dòng)脈的重鑄,影響胎盤發(fā)育,限制母胎血液循環(huán)及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。國(guó)內(nèi)外學(xué)者和本課題組前期研究均發(fā)現(xiàn)胎盤的體積和重量與新生兒出生體重成正相關(guān),巨大兒胎盤明顯增大,而FGR 胎盤則明顯縮?。?0-21]。由此可見胎盤中高表達(dá)CCNL1 可影響胎盤發(fā)育從而導(dǎo)致FGR 的發(fā)生。

    綜上所述,CCNL1 能夠抑制HTR?8/SVneo 增殖,降低侵襲、遷移能力,可能影響細(xì)胞周期分布。本研究探討了CCNL1 對(duì)人絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,為從胎盤層面尋找FGR 防治提供了思路,有助于闡明在FGR 發(fā)生中的分子機(jī)制,并可能為FGR 防治提供潛在的干預(yù)靶標(biāo),以改善妊娠結(jié)局,提高新生兒的生存質(zhì)量。

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