根際促生菌Enterobacter sp.EG16對(duì)小白菜生長(zhǎng)及硒吸收的影響

劉東昀，袁永強(qiáng)，仇榮亮，3，4，王詩忠，3*，黃雄飛，黃海燕

（1.中山大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，廣州 510006；2.廣東省環(huán)境污染控制與修復(fù)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510006；3.廣東省土壤重金屬污染修復(fù)工程技術(shù)研究中心，廣州 510275；4.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642；5.河南潤(rùn)友林業(yè)技術(shù)服務(wù)有限公司，鄭州 450008）

硒是人體必需的微量元素，然而我國(guó)硒分布卻極不均勻，超過七成省份缺硒，國(guó)民日均硒攝入量遠(yuǎn)低于健康成年人日均55 μg 的硒參考攝入值[1]。因此，提高我國(guó)居民的日均硒攝入對(duì)保障國(guó)民的健康十分重要。食用富含硒的功能食品是目前人們較為有效的硒攝入方式[2]，我國(guó)居民日常飲食以植物性食物為主，其中蔬菜在營(yíng)養(yǎng)金字塔中占有重要地位。隨著富硒蔬菜的推廣應(yīng)用，食用富硒蔬菜成為了一種有效的硒補(bǔ)充方式。

生物強(qiáng)化技術(shù)（Biofortification）是一項(xiàng)具有潛力和成本效益的農(nóng)業(yè)技術(shù)[3?5]，即通常使用硒酸鈉或亞硒酸鈉輔以不同的施用技術(shù)（浸種、土壤添加、葉面噴霧和水培營(yíng)養(yǎng)液等[1，6?7]）來提高農(nóng)作物對(duì)硒的積累[8?9]。雖然施加較高的外源硒會(huì)增加硒在植物體內(nèi)的累積，但研究表明，高濃度的硒通常會(huì)抑制植物的生長(zhǎng)[7]。如趙秀鋒等[10]在小白菜水培研究中發(fā)現(xiàn)，硒濃度超過4.0 mg·L?1時(shí)小白菜生長(zhǎng)會(huì)受到抑制。李登超等[11]則發(fā)現(xiàn)矮抗青在5 mg·L?1的硒環(huán)境中生長(zhǎng)較差。VERSINI 等[12]實(shí)驗(yàn)證明，20～100 mg·L?1濃度的含硒Hoagland營(yíng)養(yǎng)液會(huì)對(duì)黑麥草生長(zhǎng)有較強(qiáng)抑制作用。由此可知，盡管植物品種和培養(yǎng)環(huán)境各異，在水培條件下，外源硒濃度超過20 mg·L?1時(shí)一般都會(huì)對(duì)植物的生長(zhǎng)產(chǎn)生不利影響。因此，僅增強(qiáng)外源硒補(bǔ)充難以滿足生物強(qiáng)化的需求，還需要探索其他的生物強(qiáng)化措施。

植物根際促生菌（Plant grow?prompting rhizobac?teria，PGPR）是一類能夠定殖于植物根際，并通過分泌植物激素、鐵載體等方式促進(jìn)植物生長(zhǎng)、提高植物抗逆性的菌。這類菌在重金屬污染土壤的植物修復(fù)中展現(xiàn)了良好的應(yīng)用潛力。例如本研究團(tuán)隊(duì)篩選出的一種根際促生菌——Enterobactersp.EG16，該菌能分泌鐵載體，緩解鎘對(duì)植物的脅迫，并能促進(jìn)植物生長(zhǎng)[13?14]。近年來，一些研究發(fā)現(xiàn)PGPR 還具有輔助植物富硒的能力，如Bacillussp.B47 作為生物肥料接種于羅勒（Ocimum basilicumL.）根系后，植物莖部硒含量顯著高于單純土壤施硒肥[15]。而Bacillussp.E5 與叢枝菌根真菌共同接種會(huì)增加生菜莖部的硒含量，還會(huì)使葉綠素和抗氧化酶含量上升，生菜抗旱能力增強(qiáng)[16]。這些發(fā)現(xiàn)，促使PGPR 在生物強(qiáng)化上的應(yīng)用潛力受到越來越多的重視[17?18]。此外，EG16還能夠提高植物抗逆性。因此，將EG16應(yīng)用于硒的生物強(qiáng)化，是很有價(jià)值的嘗試。

硒生物強(qiáng)化的目標(biāo)是既要增加植物中硒含量，又要避免因硒過量而造成作物產(chǎn)量顯著下降[6，11]。農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境中硒濃度的關(guān)系是影響PGPR 輔助的硒生物強(qiáng)化方法能否推廣應(yīng)用的一個(gè)關(guān)鍵問題[19]。目前關(guān)于PGPR 硒生物強(qiáng)化的研究側(cè)重于探究微生物的功效，比如PGPR 促進(jìn)植物吸收鈣、鉀等元素、輔助植物抵抗干旱脅迫、改變硒的形態(tài)、促進(jìn)植物根毛增加等[15?16，20?21]。而目前的研究主要還存在兩個(gè)方面的不足：一方面，已知較高濃度的外源硒會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生抑制，雖然PGPR 具有一定的促生作用，但是PGPR 能否幫助植物抵御這種生理毒害還缺少研究；另一方面，當(dāng)硒和PGPR 共同作用時(shí)，隨著硒濃度的變化，PGPR是否能對(duì)植物具有持續(xù)穩(wěn)定的促生和富硒效果的研究還十分有限。所以，探討不同硒濃度下PGPR 對(duì)植物生長(zhǎng)和硒吸收的影響，不僅能深入了解PGPR 的促生機(jī)制，而且有利于PGPR 輔助的硒生物強(qiáng)化技術(shù)的推廣應(yīng)用。

本研究以小白菜為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，設(shè)置了不同硒濃度梯度下接種EG16的水培實(shí)驗(yàn)，以不接種EG16的處理作為對(duì)照，通過對(duì)比分析不同處理下小白菜的生長(zhǎng)狀況、生理變化和植物體的硒含量變化特征，探究不同硒條件下EG16對(duì)植物生長(zhǎng)及其對(duì)硒吸收的影響。本研究有助于揭示EG16 的促生機(jī)理，為PGPR 在植物富硒的生物強(qiáng)化應(yīng)用提供更多科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株為Enterobactersp.EG16（廣東省微生物菌種保藏中心，編號(hào)GDMCC1.808）。從低溫保藏冰箱中取出甘油保存的EG16，在LB 培養(yǎng)液[22]中活化。在活化至第二代后，取出5 mL 菌液接種至100 mL 無菌LB液體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)約48 h，形成菌懸液，備用。用紫外?可見分光光度法[23]測(cè)定菌懸液濃度。本研究中EG16 的菌懸液濃度約為7.65×109CFU·mL?1。

培養(yǎng)液為MS培養(yǎng)液，改進(jìn)自趙德修等[24]的方法，即不加入有機(jī)成分、蔗糖和植物激素。一部分MS 培養(yǎng)液用無菌水分別稀釋成1/2 MS 培養(yǎng)液和1/5 MS 培養(yǎng)液，備用。

供試植物為小白菜（Brassica chinensisL.），由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所提供。種子用溫水浸泡2 h 后，選取大粒飽滿的種子種植于家庭園藝營(yíng)養(yǎng)土（綠源園藝有限公司）中，待幼苗長(zhǎng)至2～4 片葉時(shí)，連根取出整個(gè)植株并洗凈根部，隨后進(jìn)行煉苗。植株先后轉(zhuǎn)移至1/5 MS 培養(yǎng)液和1/2 MS 培養(yǎng)液中各培養(yǎng)5～7 d，最后轉(zhuǎn)移至原濃度的MS 培養(yǎng)液中培養(yǎng)1 周。待植物長(zhǎng)至4～6 片葉后植物煉苗結(jié)束，可進(jìn)行后續(xù)處理。

1.2 水培實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)為兩因子交叉設(shè)計(jì)，兩個(gè)因子分別為不同硒濃度處理和接種EG16 處理。在無菌MS 培養(yǎng)液加入若干1 000 mg·L?1硒（Ⅳ）儲(chǔ)備液（0.219 g的Na2SeO3溶于100 mL 無菌蒸餾水，并在超凈工作臺(tái)中過0.22μm 無菌濾頭除菌），分別配制成含硒量為2、5、10、20 mg·L?1的MS 培養(yǎng)液。每個(gè)濃度的培養(yǎng)液分別取100 mL 裝入若干個(gè)100 mL 錐形瓶中。小白菜煉苗結(jié)束后，挑選株高[（10.9±0.1）cm，n=50]、葉片數(shù)[（4.21±0.25）片，n=50]、鮮質(zhì)量[（1.29±0.48）g，n=50]較為一致的植株，在超凈臺(tái)分別用無菌水和0.5%次氯酸鈉（0.5 mL 活性氯含量7.5%的次氯酸鈉溶液加入95.5 mL 的無菌水中，現(xiàn)配現(xiàn)用）沖洗根部若干次，進(jìn)行根部滅菌處理，之后用無菌水洗去殘余次氯酸鈉。將小白菜定植于裝有含2、5、10、20 mg·L?1硒的培養(yǎng)液的錐形瓶中，分別記為Se2、Se5、Se10、Se20。以不含硒的無菌MS 培養(yǎng)液水培作為對(duì)照，記為CK。接種PG?PR 處理的小白菜則需要進(jìn)行根系定殖處理[25]，即沖洗根部殘余次氯酸鈉后，將小白菜的根系浸泡在1 mL 的EG16 菌懸液中10～15 min，再將小白菜定植于裝有含2、5、10、20 mg·L?1硒的培養(yǎng)液的錐形瓶中，定植環(huán)節(jié)殘留的菌懸液全部注入培養(yǎng)體系，分別記為ESe2、ESe5、ESe10、ESe20。在不含硒的MS 培養(yǎng)液中水培接種了EG16 的小白菜作為含菌對(duì)照，記為E1。共10 種處理，每個(gè)處理5 個(gè)重復(fù)，共50 個(gè)樣品（n=50）。最后，將定植后的小白菜置于人工溫室培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度26 ℃，濕度60%，光照強(qiáng)度維持在60 μmol·m?2·s?1，日均光照時(shí)間12 h，培養(yǎng)21 d后收獲。

1.3 取樣與測(cè)定

小白菜在移栽前和收獲后，均測(cè)量樣品的株高、葉片數(shù)等生理性狀。樣品收獲后用剪刀剪為地上部和地下部。將地下部用自來水洗凈，使用EPSON Flatbed Scanner V750根系掃描儀進(jìn)行掃描，分析根系性狀（總根長(zhǎng)、總根體積、根系直徑、分支數(shù)）。

剪取每個(gè)樣品同一葉片的同一位置，參照唐延林等[26]的方法測(cè)量葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量。

稱取約0.5 g的地上部組織，用考馬斯亮藍(lán)法[27]測(cè)量蛋白質(zhì)含量。使用南京建成生物工程研究所的相應(yīng)試劑盒提取并測(cè)定SOD（Superoxide dismutase，超氧化物歧化酶）、CAT（Catalase，過氧化氫酶）、POD（Per?oxidase，非特異性過氧化物酶）活性和MDA（Malondi?aldehyde，丙二醛）含量。

其余小白菜地上部和地下部分別冷凍干燥（新芝SCIENTZ?10N），然后碾碎成粉末狀。濕式消解法[28]消解后，用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP?MS，型號(hào)PerkinElmer NexION 350D）測(cè)定總硒含量。同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照樣，并用芹菜樣（GBW10048）作為質(zhì)量控制樣品，實(shí)測(cè)芹菜的質(zhì)控樣硒含量為（0.111±0.010）mg·kg?1[標(biāo)準(zhǔn)值為（0.118±0.070）mg·kg?1]。計(jì)算出生物富集系數(shù)（Bioconcentration factor，BCF）和生物轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)（Translocation factor，TF）來表示小白菜對(duì)硒的富集和轉(zhuǎn)運(yùn)能力，計(jì)算公式如下：

生物富集系數(shù)=植物體總硒濃度（mg·g?1）/培養(yǎng)液總硒濃度（mg·L?1）

生物轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)=植物地上部總硒濃度（mg·g?1）/植物地下部總硒濃度（mg·g?1）

1.4 數(shù)據(jù)處理

用SPSS（Version 22）軟件進(jìn)行雙因素方差分析（Two?way ANOVA），各實(shí)驗(yàn)組間數(shù)據(jù)差異用Duncan方法進(jìn)行檢驗(yàn)。用Origin 2018繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物生長(zhǎng)指標(biāo)的變化

由圖1 可知，硒對(duì)小白菜的株高、葉片數(shù)、鮮質(zhì)量均產(chǎn)生顯著影響（PSe≤0.01）。收獲后，CK 處理的株高為13.5 cm，葉片數(shù)為5.93 片，鮮質(zhì)量為2.27 g。而Se2、Se5 處理的株高比CK 處理分別高7.43%、17.1%，葉片數(shù)分別高18.5%、19.7%，鮮質(zhì)量分別高62.8%、33.3%。可見，硒濃度低于5 mg·L?1時(shí)，硒的加入對(duì)小白菜地上部的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。但隨著硒濃度的繼續(xù)升高，小白菜生長(zhǎng)受到硒的抑制越來越明顯。具體表現(xiàn)為，Se10 處理雖然鮮質(zhì)量和葉片數(shù)仍大于CK處理，但株高卻比CK處理低11.4%，小白菜生長(zhǎng)受到部分抑制；而Se20 處理株高、葉片數(shù)、鮮質(zhì)量均低于CK處理，此時(shí)小白菜生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制。其中，小白菜的萎蔫是株高等物理指標(biāo)數(shù)據(jù)減少的主要原因。這說明較低濃度硒會(huì)促進(jìn)生長(zhǎng)，而較高濃度的硒則對(duì)小白菜產(chǎn)生脅迫。根據(jù)培養(yǎng)時(shí)的觀察，Se20 處理的小白菜在移植后第7 d 便開始出現(xiàn)葉片發(fā)黃、植株萎蔫等生理現(xiàn)象。移植14 d后，該處理的部分植株開始死亡，到第21 d收獲時(shí)，該處理的大部分植株已完全枯黃死亡。這也說明了高濃度硒對(duì)小白菜產(chǎn)生不利影響。

在小白菜根際接種EG16（接種量7.65×109CFU，下同）后，如圖1 所示，E1 處理的小白菜株高為12.8 cm，葉片數(shù)為7.00片，鮮質(zhì)量為3.80 g，葉片數(shù)和鮮質(zhì)量高于CK 處理，尤其是鮮質(zhì)量顯著高于CK 處理67.6%，表明EG16 的加入對(duì)小白菜有較好促生作用。根據(jù)圖1B，在2 mg·L?1的外源硒環(huán)境下，ESe2 處理的葉片數(shù)高于其他處理，尤其是高于同硒濃度下不接種EG16 的Se2 處理。結(jié)合方差分析中PSe<0.01、PSe×E<0.01 的結(jié)果，可以推測(cè)EG16 和硒的共同作用會(huì)更加有利于小白菜葉片生長(zhǎng)。當(dāng)硒濃度大于或等于10 mg·L?1，接種了EG16 的小白菜生長(zhǎng)同樣受到抑制，具體表現(xiàn)為ESe10、ESe20 處理的葉片數(shù)和鮮質(zhì)量均顯著小于CK處理。因此，接種EG16不會(huì)影響硒對(duì)小白菜低促高抑的作用。據(jù)觀察，ESe20 處理的植株樣品在移植第7 d 起也出現(xiàn)了如Se20 處理生長(zhǎng)不良的現(xiàn)象。但該處理的植物存活時(shí)間相對(duì)較久，在移植14 d后存活的植株數(shù)多于Se20 處理。到第21 d 收獲時(shí)，ESe20 處理尚有超過一半的植株存活，說明EG16 具有緩解高濃度硒對(duì)小白菜生長(zhǎng)脅迫的潛力。綜合以上結(jié)果，在本研究的水培條件下，硒對(duì)小白菜生長(zhǎng)由促進(jìn)轉(zhuǎn)向抑制的濃度閾值范圍在5～10 mg·L?1。

2.2 植物根系形態(tài)變化

根據(jù)圖2，CK 處理的小白菜總根長(zhǎng)可達(dá)525 cm，根系直徑約0.173 cm，總根體積達(dá)28.5 cm3，分支數(shù)達(dá)3 566 個(gè)。與CK 處理相比，Se2、Se5 處理組的小白菜總根長(zhǎng)分別增加了39.6%、25.9%，總根體積分別增加了43.2%、80.4%，分支數(shù)分別增加了42.2%、49.6%，根系直徑僅增加了1.35%、17.2%，硒濃度的增加對(duì)根系產(chǎn)生了較大促生作用。Se10 處理總根長(zhǎng)比CK 處理減少19.1%，根系直徑卻增加43.0%，總根體積增加18.5%，分支數(shù)僅增加1.53%，該處理對(duì)小白菜根系的促生效果較弱。Se20 處理組中小白菜根系的生長(zhǎng)受到顯著抑制，總根長(zhǎng)、總根體積、分支數(shù)分別比CK 處理減少了80.9%、66.8%、73.9%。方差分析發(fā)現(xiàn)，硒對(duì)所有根系性狀變化均產(chǎn)生了顯著影響，說明硒對(duì)小白菜根系生長(zhǎng)同樣具有低促高抑作用。

由圖2可知，當(dāng)加入EG16菌后，E1處理的小白菜總根長(zhǎng)為615 cm，根系直徑為0.215 cm，總根表面積為38.2 cm2，分支數(shù)達(dá)5 314個(gè)。單因素方差分析顯示接種處理對(duì)4 個(gè)根系指標(biāo)均沒有顯著影響，但各項(xiàng)根系性狀數(shù)據(jù)均比CK處理高，說明EG16的加入一定程度上利于根系生長(zhǎng)。

根據(jù)雙因素方差分析，硒與EG16 兩個(gè)因素的交互作用對(duì)總根長(zhǎng)、總根體積、分支數(shù)產(chǎn)生顯著影響，而根系直徑只受到硒處理的顯著影響。此外，ESe2、ESe5、ESe10、ESe20 處理的根系直徑比CK 處理分別增加了15.6%、14.6%、36.3%、41.8%，可見接菌處理的小白菜根系隨硒濃度增加而變粗。而其他根系指標(biāo)中，ESe2、ESe5 處理的小白菜總根體積比CK 處理分別增加43.3%、95.3%，分支數(shù)分別增加13.3%、91.8%。同時(shí)，ESe5 處理的小白菜總根長(zhǎng)比CK 處理增加44.5%，且其他的根系指標(biāo)均比E1 處理和同硒濃度環(huán)境下的Se5 要高。ESe10、ESe20 處理比CK 處理總根長(zhǎng)分別低78.9%、26.1%，總根體積分別低71.7%、23.7%，分支數(shù)分別低66.9%、24.1%，根系生長(zhǎng)受到明顯抑制?？梢娊臃NEG16對(duì)小白菜的根系生長(zhǎng)具有一定促進(jìn)作用。

2.3 植物葉綠素含量的變化

葉綠素含量在一定程度上反映了植物光合作用的能力。根據(jù)圖3，CK 處理的小白菜葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素平均含量分別為5.98、2.62、2.87 mg·g?1；E1 處理的葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量分別為5.87、2.69、2.80 mg·g?1。硒濃度低于10 mg·L?1時(shí)，不論是否接種EG16，小白菜各類葉綠素含量均和CK 處理差異不顯著。但當(dāng)硒濃度達(dá)到10 mg·L?1時(shí)，接種EG16 對(duì)葉綠素含量產(chǎn)生了明顯影響。與CK 處理相比，Se10 處理葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素分別減少25.9%、7.53%、23.3%，而ESe10 的各項(xiàng)葉綠素卻分別增加19.1%、53.7%、21.5%?？梢?0 mg·L?1的硒處理可能會(huì)降低小白菜的葉綠素含量，而EG16 的加入則有利于其葉綠素的合成。但在硒濃度達(dá)到20 mg·L?1時(shí)，Se20、ESe20 兩個(gè)處理的葉綠素a 比CK 處理分別減少17.3%、28.5%，類胡蘿卜素分別減少10.3%、25.6%。因此，在20 mg·L?1硒濃度條件下，無論接種EG16與否，小白菜各類葉綠素含量均降低，生長(zhǎng)受到抑制。

2.4 蛋白質(zhì)含量和抗氧化酶的變化

根據(jù)圖4A，CK 處理的小白菜地上部蛋白質(zhì)含量為1.38 mg·g?1，隨著硒濃度增加，除Se2、Se10 處理略低于CK（減少6.91%、2.38%）外，小白菜蛋白質(zhì)含量呈上升趨勢(shì)，其中Se5、Se20 處理蛋白質(zhì)含量比CK 處理分別增加了16.5%、21.3%。根據(jù)雙因素方差分析，硒處理對(duì)蛋白質(zhì)含量產(chǎn)生影響顯著。在接種EG16的處理中，E1處理的蛋白質(zhì)含量為1.21 mg·g?1，低于CK處理11.9%。隨著硒濃度的上升，蛋白質(zhì)含量也逐步上升，且ESe20處理的蛋白質(zhì)比同硒濃度的Se20處理高8.00%。可見EG16和Se的共同作用會(huì)導(dǎo)致低硒環(huán)境中小白菜的蛋白質(zhì)含量減少，但可提高高濃度硒環(huán)境中小白菜的蛋白質(zhì)含量。

根據(jù)圖4B，本研究中EG16 和硒的加入，對(duì)小白菜體內(nèi)的SOD無顯著影響。但POD、CAT的變化則有所不同。根據(jù)圖4C，CK處理中CAT的活性為44.7 U·g?1，且隨著硒濃度的增加呈現(xiàn)先降低后增加再降低的趨勢(shì)。其中Se10 處理的CAT 活性為59.6 U·g?1，在所有不接種EG16處理中活性最強(qiáng)。僅接種EG16時(shí)，小白菜的CAT 活性顯著降低，具體表現(xiàn)為E1 的CAT 活性為38.2 U·g?1，顯著低于CK 處理。在接種EG16 的基礎(chǔ)上，硒對(duì)CAT 活性的影響表現(xiàn)為低促高抑，其中ESe5 處理的CAT 活性達(dá)到60.2 U·g?1，是所有接種菌處理中活性最高的。當(dāng)硒濃度≤5 mg·L?1時(shí)，同濃度硒條件下，接種處理的CAT 活性均大于不接種處理；但當(dāng)硒濃度≥10 mg·L?1時(shí)，接種的CAT 活性則都小于同硒濃度的不接種處理。由此可知，單獨(dú)的EG16 接種可降低小白菜CAT 活性；EG16 和≤5 mg·L?1的硒共同作用時(shí)，可提升CAT 活性且提升幅度大于單獨(dú)的硒處理；而EG16 和≥10 mg·L?1的硒共同作用時(shí)，盡管CAT 活性仍高于CK 處理，但增強(qiáng)效果不如單獨(dú)的硒處理。

根據(jù)圖4D，CK 處理POD 活性達(dá)873 U·g?1，與之相 比，ESe10、ESe20處理的POD活性顯著增高47.7%、82.4%，同時(shí)也比同硒濃度的Se10、Se20 處理活性高。除ESe20 處理外，其他處理的POD 均與CK處理無顯著差異?？梢姡?dāng)硒濃度≤5 mg·L?1時(shí)，EG16和硒對(duì)小白菜POD 活性的作用較小，但當(dāng)硒濃度≥10 mg·L?1時(shí)，硒與EG16 菌共同作用會(huì)顯著提高POD 的活性。

2.5 MDA含量的變化

MDA 作為膜脂過氧化作用的指標(biāo)，其含量越高一般說明植物遭受的傷害越大。根據(jù)圖5，CK處理的MDA 含量為12.4 nmol·g?1，隨著Se 濃度的上升，小白菜體內(nèi)的MDA 含量分別比CK 處理增加了4.59%、5.25%、36.1%、69.8%。在硒濃度≤5 mg·L?1時(shí)，接種EG16 有效降低了MDA 含量，此時(shí)E1、ESe2、ESe5 處理的MDA 含量比CK 處理分別降低了33.1%、24.3%、0.3%。但當(dāng)硒濃度≥10 mg·L?1時(shí)，接種處理的MDA含量均大于同硒濃度的不接種處理?？梢姡谝欢ǖ奈鴿舛确秶鷥?nèi)，接種EG16能緩解小白菜的生理脅迫。

2.6 不同處理對(duì)植物硒總量的影響

植物體內(nèi)的硒總量反映了植物吸收硒的能力。除了Se20 和ESe20 兩個(gè)處理，小白菜硒含量（包括地上部、地下部）隨著外源硒濃度的升高而上升；生物富集系數(shù)先增大后降低，并在5 mg·L?1時(shí)達(dá)到最大，而生物轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)則下降（表1），且這些變化趨勢(shì)不受接種EG16 的影響。單因素方差分析發(fā)現(xiàn)，硒濃度的變化對(duì)生物轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)、生物富集系數(shù)、地上部和地下部硒含量均有顯著影響（表2），因此外源硒濃度是影響小白菜吸收硒的重要因素。當(dāng)硒濃度不超過5 mg·L?1時(shí)，同硒濃度下，接種處理的地下部硒含量雖然略低于不接種處理，但是地上部硒含量差別很小，最終表現(xiàn)為生物轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)較高（表1），根據(jù)雙因素方差分析，硒與EG16 的共同作用對(duì)生物轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)有顯著影響（表2，PSe×E<0.01）。這說明EG16的接種有利于硒從小白菜的地下部向地上可食用部分的轉(zhuǎn)運(yùn)。

表1 植物地上部、地下部的總硒含量Table 1 Concentrations of Se in aboveground and underground parts of plants

表2 硒含量的雙因素方差分析Table 2 Two?way ANOVA for Se content

當(dāng)硒濃度大于10 mg·L?1時(shí)，同硒濃度下的地下部硒含量均高于不接種的處理（表1），盡管方差分析表明，EG16以及EG16和硒的共同作用對(duì)地下部硒含量的影響并不顯著，但從結(jié)果看，接種EG16有利于硒在植物地下部的富集。當(dāng)硒濃度升高至20 mg·L?1時(shí)，與Se20 處理相比，ESe20 處理中地下部硒含量顯著上升，地上部硒含量卻有所下降（表1）。ESe20 處理的生物富集系數(shù)明顯大于Se20 處理，但轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)卻低于Se20 處理。即在20 mg·L?1的硒濃度下，接種處理的小白菜將硒富集于小白菜地下部的能力明顯增強(qiáng)，但將硒從地下部轉(zhuǎn)運(yùn)至地上部的能力顯著降低，最終地上部的硒含量低于不接種處理。方差分析表明，EG16 單獨(dú)作用（PE<0.01）與菌和硒的共同作用（PSe×E<0.01）對(duì)地上部硒含量影響顯著（表2）。說明EG16的接種可能對(duì)植物硒的轉(zhuǎn)運(yùn)造成了影響。結(jié)合Se20處理中小白菜大多萎蔫，而ESe20處理小白菜大多存活的現(xiàn)象，在硒濃度為20 mg·L?1環(huán)境下植物硒含量的變化也可能與植物生長(zhǎng)狀態(tài)的不同有關(guān)。

3 討論

植物體內(nèi)的硒主要來源于生長(zhǎng)環(huán)境，施加外源硒是普遍采用的富硒生物強(qiáng)化措施。雖然硒是否為植物的必需元素目前還存在爭(zhēng)議，但諸多研究均證實(shí)硒的加入對(duì)植物生長(zhǎng)具有一定促進(jìn)作用，且較高濃度的外源硒會(huì)增加植物體硒的累積[1，6?7]。然而較高濃度的硒通常也會(huì)抑制植物的生長(zhǎng)。如本研究發(fā)現(xiàn)，硒濃度≤5 mg·L?1時(shí)促進(jìn)小白菜生長(zhǎng)，而硒濃度≥10 mg·L?1時(shí)則抑制生長(zhǎng)。其他的研究也有類似發(fā)現(xiàn)，趙秀鋒等[10]在小白菜水培研究中發(fā)現(xiàn)當(dāng)硒濃度為0～2 mg·L?1時(shí)，硒不僅促進(jìn)小白菜的生長(zhǎng)，還緩解了小白菜受到的鉛脅迫；但當(dāng)硒濃度超過4 mg·L?1時(shí)，小白菜的生長(zhǎng)將受到抑制。對(duì)水稻的研究則發(fā)現(xiàn)，當(dāng)土壤中硒濃度低于5 mg·kg?1時(shí)對(duì)水稻生長(zhǎng)有利，但高于5 mg·kg?1時(shí)會(huì)影響水稻抗脅迫的能力[7]。由于植物品種和培養(yǎng)環(huán)境的不同，不同研究中硒對(duì)植物產(chǎn)生毒害的閾值有所不同，但這些研究結(jié)果共同說明，硒濃度較高時(shí)會(huì)對(duì)植物生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制。因此在實(shí)際的富硒蔬菜培育過程中，需要注意外源硒的施用濃度，避免較高的外源硒施用造成硒脅迫，導(dǎo)致蔬菜產(chǎn)量下降。

為了探尋更加有效的硒生物強(qiáng)化措施，研究者們開始關(guān)注PGPR，如今已發(fā)現(xiàn)一些菌株能較好地促進(jìn)植物的生長(zhǎng)。如MOTESHAREZADEH 等[15]發(fā)現(xiàn)接種Bacillussp.B47 可以增強(qiáng)羅勒（Ocimum basilicumL.）吸收硒、鉀與磷的能力，并使羅勒鮮質(zhì)量增加。郭雨晴等[29]在荒漠植物根際土中分離并篩選出了Arthro?bactersp.BP4 等多種PGPR，這些菌的接種有助于高粱幼苗鮮質(zhì)量的增加。本研究使用的PGPR，即EG16，也有相似的能力。接種EG16 能顯著增加小白菜鮮質(zhì)量（圖1C）、促進(jìn)根系生長(zhǎng)（圖2）、降低生理脅迫（圖5），這說明單獨(dú)接種EG16 對(duì)小白菜具有良好的促生作用。PGPR 一般通過固氮、溶磷、產(chǎn)生鐵載體和分泌植物激素等方式促進(jìn)植物生長(zhǎng)[30?31]。本研究水培環(huán)境的氮、磷、鐵等元素總量固定且多為植物可直接吸收的可溶態(tài)，因此EG16 對(duì)小白菜的促生作用可能與其分泌植物激素的功能有關(guān)。本研究團(tuán)隊(duì)此前證實(shí)，EG16 具有分泌生長(zhǎng)素IAA（Indole?3?ace?tic acid，吲哚乙酸）的能力[14]。這為探究EG16 的促生機(jī)制提供了一些線索，但具體的作用機(jī)制還有待后續(xù)研究。

通過水培實(shí)驗(yàn)，本研究發(fā)現(xiàn)，EG16的接種不會(huì)改變硒對(duì)小白菜產(chǎn)生的低促高抑的影響（圖1、圖2）。但在不同的硒濃度下，EG16 和Se 的共同作用會(huì)對(duì)小白菜的生長(zhǎng)產(chǎn)生不同的作用。與單獨(dú)施加硒或接種EG16的處理相比，EG16和低濃度（≤5 mg·L?1）硒共同作用確實(shí)會(huì)對(duì)小白菜產(chǎn)生更好的促生效果。表現(xiàn)為小白菜葉片數(shù)增多（圖1B）、根系分支更多（圖2）和受到的生理脅迫減低（圖4、圖5）?？梢?，EG16 在富硒蔬菜的培養(yǎng)應(yīng)用上有著極大的潛力。

當(dāng)培養(yǎng)液中硒濃度較高（≥10 mg·L?1）時(shí)，小白菜生長(zhǎng)受到較強(qiáng)抑制。不論接種EG16 與否，大部分生長(zhǎng)指標(biāo)均有明顯下降（圖1、圖2），受到的生理脅迫也有所增強(qiáng)（圖5）。但接種處理的小白菜抗逆性顯著增強(qiáng)，尤其表現(xiàn)為POD 活性顯著上升（圖4）。POD 具有歧化H2O2、保護(hù)植物細(xì)胞膜作用[32]，其活性的增加能一定程度上緩解植物所受的生理脅迫[33]。其他研究也曾發(fā)現(xiàn)PGPR 促進(jìn)植物體內(nèi)抗氧化酶的活性增強(qiáng)，從而增強(qiáng)植物抗逆性的現(xiàn)象[17，34]。如DURAN等[16]通過在生菜根部接種Bacillussp.E5 從而提升生菜的抗旱能力；黃瓜接種了短芽孢桿菌CH1 后，SOD、POD、CAT 活性明顯高于不接種處理[35]。小白菜的長(zhǎng)勢(shì)也印證了抗逆性的增強(qiáng)產(chǎn)生了作用，收獲時(shí)接種處理（ESe20 處理）的小白菜中枯萎的植株數(shù)量顯著少于不接種處理（Se20 處理）。這表明EG16 能協(xié)助植物抵御較高硒濃度帶來的生長(zhǎng)脅迫，這種功能使得EG16在硒污染地區(qū)的植物修復(fù)上也具有一定的應(yīng)用潛力。

EG16 不僅影響小白菜生長(zhǎng)，還對(duì)硒的吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)也具有一定的調(diào)控作用。本研究中，在2～5 mg·L?1的低硒環(huán)境下，EG16 和硒的共同作用雖然沒有明顯增加小白菜地上部硒的吸收，但增強(qiáng)了小白菜將硒轉(zhuǎn)運(yùn)至可食用部分的能力（表1、表2），從生長(zhǎng)指標(biāo)上看，其對(duì)小白菜也有較好的促生作用（圖1、圖2）。而當(dāng)硒濃度為10 mg·L?1時(shí)，EG16 的接種增加了小白菜地上和地下部的硒含量（表1、表2），但小白菜的生長(zhǎng)卻受到了一定的抑制（圖1、圖2）。因此在實(shí)際的富硒蔬菜培養(yǎng)過程中，使用0～5 mg·L?1硒濃度配合接種EG16可達(dá)到較好的硒生物強(qiáng)化效果。

在培養(yǎng)液硒濃度達(dá)到20 mg·L?1時(shí)，不接種處理的地上部硒含量顯著增加，但地下部硒含量則變化較小。而接種處理的小白菜地下部硒含量顯著增加，但地上部硒含量卻變化較小，表現(xiàn)為從環(huán)境中吸收硒的能力增強(qiáng)，轉(zhuǎn)運(yùn)能力減弱（表1、表2）。結(jié)合此前的觀察到的接種處理的小白菜抗逆性增強(qiáng)、存活時(shí)間比不接種處理長(zhǎng)的現(xiàn)象，小白菜逐漸枯萎的過程對(duì)地上部和地下部硒含量的變化有一定影響。

研究表明，植物通常借助根系轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的主動(dòng)運(yùn)輸過程吸收亞硒酸鹽[36?37]，因此不接種處理小白菜在逐漸枯萎過程中，其主動(dòng)吸收硒的能力也逐漸下降，進(jìn)而使植物根部硒含量沒有隨環(huán)境中的硒濃度升高而明顯增加。而不接種處理向地上部轉(zhuǎn)運(yùn)硒的能力較強(qiáng)（表1），這可能與植物器官衰亡過程中養(yǎng)分在植物體內(nèi)的重新分配有關(guān)。有研究表明，植物的維管系統(tǒng)（包括木質(zhì)部和韌皮部）可將營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)從衰老或死亡器官轉(zhuǎn)運(yùn)并重新分配到其他的器官中[38?39]。而高濃度的硒會(huì)抑制植物生長(zhǎng)并損壞其運(yùn)輸系統(tǒng)，造成養(yǎng)分運(yùn)輸紊亂[40]。這可能使不接種處理的小白菜根部大量的硒也隨著養(yǎng)分一同被轉(zhuǎn)運(yùn)至地上部，進(jìn)而使生物轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)升高。相較之下，高濃度硒環(huán)境中接種處理（ESe20）的小白菜地上部硒含量變化較為平穩(wěn)?？赡苁荅G16 在高濃度硒環(huán)境下會(huì)保護(hù)植物的運(yùn)輸系統(tǒng)，避免過量的硒隨著養(yǎng)分進(jìn)入地上部，造成更嚴(yán)重的生理脅迫。這也許是PGPR 協(xié)助植物應(yīng)對(duì)高濃度硒脅迫而調(diào)控硒轉(zhuǎn)運(yùn)的一種策略。

微生物對(duì)植物吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)硒的調(diào)控還受其他因素影響，例如營(yíng)養(yǎng)供給及植物生長(zhǎng)狀況等。有研究表明，在鈣、鉀、鎂、磷等養(yǎng)分充足時(shí)，PGPR 會(huì)增強(qiáng)植物對(duì)大量營(yíng)養(yǎng)元素的吸收，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，進(jìn)而提高植物對(duì)硒的吸收[16]。此外，也有研究發(fā)現(xiàn)，部分PGPR可通過改變硒的形態(tài)影響植物對(duì)其吸收[20，41]。更重要的是，植物對(duì)硒的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)離不開磷酸鹽、硫酸鹽等轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與[36，42]，而微生物很可能會(huì)提高某些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性，從而提高對(duì)硒的吸收[43]。因此，在本研究工作的基礎(chǔ)上，還需針對(duì)EG16 調(diào)控植物對(duì)硒的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

（1）硒對(duì)小白菜的地上部和地下部生長(zhǎng)均產(chǎn)生低促高抑的影響，且這種影響不因接種EG16 與否而發(fā)生改變。當(dāng)濃度≤5 mg·L?1時(shí)，硒能促進(jìn)植物生長(zhǎng)，但當(dāng)硒濃度≥10 mg·L?1時(shí)，植物生長(zhǎng)受到抑制。

（2）僅接種EG16可促使小白菜鮮質(zhì)量增加、促進(jìn)根系生長(zhǎng)，還能緩解由MDA升高帶來的生理毒害。

（3）環(huán)境硒濃度較低（≤5 mg·L?1）時(shí)，與不接種處理相比，接種EG16處理的小白菜葉片數(shù)更多、根系更長(zhǎng)、分支數(shù)更多、CAT活性更高。此時(shí)EG16還對(duì)硒由地下向地上的轉(zhuǎn)運(yùn)有一定的促進(jìn)作用。EG16和硒的共同作用也呈現(xiàn)出較好的植物促生作用。

（4）環(huán)境硒濃度較高（≥10 mg·L?1）時(shí)，小白菜根系的硒含量顯著上升，但其生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制。而接種EG16 處理的小白菜存活率高于不接種處理，蛋白質(zhì)含量也更高，POD活性顯著增強(qiáng)，表明EG16能適度提高植物的抗逆能力。