基于木質(zhì)素單體含量的園林生物質(zhì)降解菌評(píng)價(jià)

吳桐，路強(qiáng)強(qiáng)，趙葉子，陳智坤，刑國(guó)強(qiáng)，賈銳魚

（1.陜西省科學(xué)院土壤資源與生物技術(shù)應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西省西安植物園（陜西省植物研究所），西安 710061；2.西安科技大學(xué)地質(zhì)與環(huán)境學(xué)院，西安 710043；3.西安市閻良區(qū)國(guó)強(qiáng)瓜菜專業(yè)合作社，西安 710089）

園林生物質(zhì)是園藝生產(chǎn)及農(nóng)林作業(yè)所產(chǎn)生的廢棄物，是地球生物圈儲(chǔ)量最為豐富的碳水化合物資源[1]。按照化學(xué)組成分類，園林生物質(zhì)主要是由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素構(gòu)成的大分子交聯(lián)體——木質(zhì)纖維素，是參與生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)的重要有機(jī)物[2]。其中纖維素是由D?葡萄糖以β?1，4 糖苷鍵鍵合而成的大分子多糖，是構(gòu)成植物細(xì)胞壁的主要骨架；半纖維素是由多種單糖構(gòu)成的異質(zhì)多聚體，起保護(hù)纖維素的作用[3]；從物質(zhì)組成與生物合成途徑看，木質(zhì)素主要是由愈創(chuàng)木基（Guaiacyl nuit，G）、紫丁香基（Sy?ringy unit，S）和對(duì)羥基（p?Hydroxyphenyl，H）3 種苯丙烷結(jié)構(gòu)單元通過酚基氧化和脫氫聚合，并以C—O 鍵和C—C 鍵耦合而成的多酚高分子物質(zhì)。其中，G 型木質(zhì)素主要沉積于木質(zhì)部疏導(dǎo)組織的管道壁，具剛性和疏水特性，給予細(xì)胞壁更強(qiáng)的抵抗性[4]，S 型則沉積于纖維薄壁，具有明顯的親水性和靈敏度[5]，H型于胞間層和細(xì)胞角隅內(nèi)，且以微量形式存在而未表現(xiàn)出功能特性[6]，3 種木質(zhì)素單體起到共同支撐木質(zhì)部輸導(dǎo)組織結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的作用。

木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)特異性決定了其高效降解是各菌系酶間協(xié)同作用的結(jié)果[7?8]。目前，具木質(zhì)纖維素降解能力的微生物主要包括真菌、細(xì)菌和放線菌，其中真菌起主導(dǎo)作用，放線菌次之，細(xì)菌降解能力最弱[9]。降解型真菌包括木腐菌（Wood?rot fungi）、木霉菌（Trichoderma）和曲霉菌（Aspergillus）等，其通過產(chǎn)胞內(nèi)纖維素酶、半纖維素酶、胞外木質(zhì)素酶等，經(jīng)菌絲作用侵入木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)腔體間隙，在酶水解和物質(zhì)代謝中發(fā)揮解聚功能[10?11]。王加友等[12]篩選的真菌藍(lán)狀菌屬（Talaromyces stollii）SY?403 在降解處理玉米秸稈40 d 時(shí)，失重率達(dá)42.67%；于慧娟等[13]篩選的高纖維素胞外酶真菌Z?5，對(duì)秸稈的降解率最高達(dá)47%。細(xì)菌則是通過分泌胞間纖維素酶等，并附著于木質(zhì)纖維素表面進(jìn)行糖苷鍵的裂解[14]，酶活力較高的細(xì)菌主要有梭菌屬（Clostridium）、單胞菌屬（Xan?thomonas）、桿菌屬（Bacillus）等[15]。KUMAR 等[16]篩選的假單胞菌（Pseudoxanthomonassp）R?28發(fā)酵5 d后，對(duì)濾紙和純纖維素廢料的降解率分別為96%和95%；亦有細(xì)菌產(chǎn)木質(zhì)素過氧化物酶，可促進(jìn)木質(zhì)素降解[17]，BILLINGS等[18]從熱帶雨林土壤中分離得到以木質(zhì)素為主要碳源的甲苯單胞菌屬（Toluomonas）新種，具有較強(qiáng)的木質(zhì)素過氧化物酶活力。降解型放線菌多為中、高溫菌，主要包括諾卡氏菌屬（Nocardia）、小單孢菌屬（Micromonospora）及鏈霉菌屬（Streptomyces）等，主要來自土壤和腐殖質(zhì)環(huán)境，其通過提高纖維素水溶性、增強(qiáng)菌絲穿透性，達(dá)到解聚木質(zhì)纖維素的作用[19]。劉曉飛等[20]從寒地黑土篩選所得放線菌GS?3?39 可實(shí)現(xiàn)對(duì)玉米芯的高效發(fā)酵，其堆肥降解率高達(dá)27.26%；另外，放線菌降解特性在于其對(duì)高溫、高堿等極端環(huán)境的適應(yīng)，尤其在堆肥高溫環(huán)境中，其有效活菌數(shù)占總菌群的80%以上[21]。而園林生物質(zhì)的高效酶解更是各菌種協(xié)同作用的結(jié)果。

水解所得還原糖換算酶活力和木質(zhì)纖維素降解失重率是評(píng)價(jià)微生物降解能力最為常用的指標(biāo)。FANG 等[22]從園林廢棄物中篩選到復(fù)合微生物群落DM ?1，在培養(yǎng)16 d 后其木質(zhì)素酶活力依然高達(dá)67.44 U·mL?1；馬欣雨等[23]從腐爛秸稈中分離的高效纖維素降解菌NX9，經(jīng)液態(tài)發(fā)酵15 d，其降解失重率達(dá)到53.88%。同時(shí)，也有通過測(cè)定各物質(zhì)組分含量評(píng)價(jià)微生物降解效率，如王天珍[24]利用樺褐孔菌（Ino?notus obliquus）降解甘蔗渣，培養(yǎng)發(fā)酵14 d時(shí)，木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的含量較未添加菌株的空白組分別減少了29.6%、24.3%和21.0%。ZHANG 等[25]利用商品酶的選擇酶解特性和氣相色譜?質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC?MS），對(duì)木質(zhì)纖維素酶解過程中木質(zhì)素結(jié)構(gòu)的解聚變化進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素含量減少與聚合物結(jié)構(gòu)變化存在顯著關(guān)系。然而，木質(zhì)素結(jié)構(gòu)變化將會(huì)導(dǎo)致怎樣的單體含量變化目前仍未知，且未見通過木質(zhì)素單體結(jié)構(gòu)變化表征降解效率的報(bào)道。為此，本文以降解剩余物中木質(zhì)素單體含量的動(dòng)態(tài)變化作為量化指標(biāo)，并結(jié)合酶活力和失重率綜合評(píng)價(jià)各降解菌的酶解效率。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品采集

降解菌株篩選所用腐殖質(zhì)層取自祁連山國(guó)家公園（海拔2 350 m）天然青海云杉（Qinghai Pine）林下表層0～10 cm土壤。

1.1.2 培養(yǎng)基選擇

篩選所用培養(yǎng)基配制為：羧甲基纖維素鈉10 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、磷酸二氫鉀1 g、瓊脂20 g、純水1 L；培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為：溶菌肉湯LB、營(yíng)養(yǎng)瓊脂NA、馬鈴薯PDA和剛果紅培養(yǎng)基。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的篩選與鑒定

1.2.1.1 菌種篩選分離

取腐殖質(zhì)層土壤10 g 于含有90 mL 無菌水的250 mL 錐形瓶中，無菌封口后搖床振蕩1 h，靜置，并于無菌操作臺(tái)制備濃度依次為10?1～10?7的稀釋液，分別吸取200 μL 涂布于篩選培養(yǎng)基（各濃度均3 個(gè)平行），于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并每日觀察其生長(zhǎng)情況，經(jīng)多次純化和傳代分離后得到單一菌株。

1.2.1.2 剛果紅透明圈試驗(yàn)

將各菌株點(diǎn)接于剛果紅培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d 后，用1 mol·L?1NaCl 溶液脫色30 min，分別測(cè)定菌落直徑（d）和降解圈直徑（D）[26]。

1.2.1.3 理化性質(zhì)試驗(yàn)

根據(jù)所篩選目的性要求，依據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[27]，選取以下特征指標(biāo)進(jìn)行鑒定試驗(yàn)：葡萄糖發(fā)酵、木糖發(fā)酵、半乳糖發(fā)酵、淀粉水解和纖維素水解。

1.2.1.4 菌種鑒定

分別提取細(xì)菌和真菌基因組DNA，以27F（AGAGTTTGATCMTGGCTCAG）、1492R（TACGGY?TACCTTGTTACGACTT）和ITS1（5′ ?TCCGTAGGT?GAACCTGCGG ?3′）、ITS4（5′?TCCTCCGCTTATT?GATATGC?3′）作為16S rDNA 和18S rDNA 引物，利用細(xì)菌和真菌基因組DNA 的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，并用BLAST 軟件進(jìn)行NCBI 序列數(shù)據(jù)比對(duì)。引物擴(kuò)增與測(cè)序由北京六合華大基因科技有限公司提供技術(shù)支撐。

1.2.2 酶活力測(cè)定

纖維素酶活力（CMC）和總酶活力（FPA）測(cè)定：離心使菌體與酶液分離，試管中分別加入1%的羧甲基纖維素鈉（或50 mg 濾紙條）、1.5 mL 檸檬酸鈉緩沖溶液（0.05 mol·L?1pH 5）、粗酶液0.5 mL，以加入0.5 mL無菌水為對(duì)照，3 組平行，50 ℃水浴1 h 后向各試管加入3 mL DNS 試劑，于熱水浴中煮沸5 min 后取出，冷卻至室溫后定容至20 mL，搖勻，吸取300 μL 溶液到酶標(biāo)板，于波長(zhǎng)540 nm 下測(cè)吸光值，在葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出還原糖含量，通過公式換算酶活力值[28]。

酶活力定義：1 mL 酶液催化底物生成1 μg 葡萄糖為一個(gè)酶活力單位，以U·mL?1表示。

1.2.3 產(chǎn)酶條件優(yōu)化

通過5因素4水平正交實(shí)驗(yàn)組合對(duì)菌株的產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，選取的因素分別為：碳源（包括葡萄糖、淀粉、羧甲基纖維素鈉和蔗糖）、氮源（包括硝酸鉀、硫酸銨、酵母粉和蛋白胨）、溫度（25～40 ℃）、時(shí)間（12～48 h）和pH（3～9），通過紫外分光光度計(jì)以O(shè)D600值作為結(jié)果，以極差法作為分析方法，并以CMC 和FPA 酶活力進(jìn)行結(jié)果驗(yàn)證。

1.2.4 枯莖降解試驗(yàn)

將陰干枯莖（取自西安植物園水景區(qū)自然枯萎蘆葦?shù)那o稈、枯葉、花穗）剪碎至1～2 cm，蒸餾水浸泡過夜以沖洗可溶性有機(jī)物，85 ℃烘干待用。稱取枯莖（mP）3 g、硫酸銨0.4 g、硫酸鎂0.1 g 于500 mL 錐形瓶，加入60 mL 磷酸緩沖液（5 mmol·L?1pH 7）后121 ℃滅菌，冷卻后加入菌液6 mL（3 組平行），以加入6 mL 蒸餾水作為空白對(duì)照組（CK），混勻后置于50 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)15 d，定期觀察枯莖發(fā)酵降解情況，分別于第5、10、15 d 取出，過濾發(fā)酵物，蒸餾水沖洗去除菌體，將剩余物置于105 ℃烘干至恒質(zhì)量，稱取未降解質(zhì)量（mS），測(cè)定其降解率（Dr）[29]：

1.2.5 木質(zhì)素單體含量測(cè)定

木質(zhì)素單體結(jié)構(gòu)苯丙烷基的α、β 位羥基在高溫條件下可與乙硫醇發(fā)生硫代酸解反應(yīng)，形成分子量不等的木質(zhì)素硫化烷衍生物。其中，愈創(chuàng)木基（G 型）硫化物的分子離子峰（m/z）為269、紫丁香基（S 型）硫化物的分子離子峰（m/z）為299，可利用GC?MS 技術(shù)進(jìn)行定性分離和離子峰定量測(cè)定，從而表征木質(zhì)素各單體含量[30]。

樣品制備[31]：10 mg 樣品中加入1 mL 硫代酸解試劑（2.5%三氟化硼乙醚、10%乙硫醇、87.5%1?4 二氧六環(huán)），100 ℃水浴反應(yīng)4 h，每隔0.5 h 搖動(dòng)攪拌一次。快速冷卻后添加0.2 mL 二十四烷（1 mg·mL?1）作為內(nèi)標(biāo)，加入0.3 mL 碳酸氫鈉溶液（0.4 mol·L?1）使pH 為3～4，再加入1 mL 二氯甲烷分別萃取3 次，放置5 min以分層，轉(zhuǎn)移有機(jī)相（下部顏色較深物質(zhì)）到另一小瓶中，加入50～70 mg 無水硫酸鈉，氮吹濃縮后將殘留物重新溶解在0.3 mL 二氯甲烷中，并加入35μL 嘧啶和75μL N，O?（三甲基硅烷基）雙乙酰胺，室溫靜置4 h，進(jìn)行GC?MS分析。

GC 條件：進(jìn)樣溫度250 ℃，進(jìn)樣量1 μL，分流進(jìn)樣（10∶1），色譜柱恒定流速為1.8 mL·min?1，柱箱初始溫度為160 ℃，然后以20 ℃·min?1的速度升至250 ℃并保持5 min。MS 條件：電子電離（EI）模式，離子源溫度230 ℃，界面溫度250 ℃，電子能量70 eV，溶劑延遲3.5 min，掃描范圍40～650 amu。采用Lapierre[32]的方法對(duì)目標(biāo)單體進(jìn)行量化，將響應(yīng)因子K定義為內(nèi)標(biāo)物相對(duì)濃度與樣品相對(duì)面積的比值，為1.5。

式中：K為響應(yīng)系數(shù)；Cs和Ci為樣品和內(nèi)標(biāo)物的濃度，mg·mL?1；As和Ai為二者的峰面積，mV·min。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種篩選與產(chǎn)酶優(yōu)化

2.1.1 菌種篩選與鑒定

經(jīng)定向篩選、剛果紅染色及酶活力測(cè)定發(fā)現(xiàn)，菌株QL?1 和QL?4 的透明圈最為明顯，對(duì)應(yīng)D/d值分別為（2.84±0.20）和（3.16±0.13），其初始酶活力及相關(guān)理化特性表征結(jié)果見表1。

表1 菌種基本特性Table 1 Basic characteristics of strains

菌株形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，QL?1 具細(xì)菌形態(tài)特征，菌落呈乳白色、表面光澤，呈圓形凸起、邊緣扁平，有較明顯氣味；而QL?4 表面為煙綠色，背面為白色或淡黃色，呈絨毛狀，具真菌形態(tài)特征。經(jīng)16S rDNA 和18S rDNA 的基因組PCR 擴(kuò)增測(cè)序及NCBI 數(shù)據(jù)庫Blast相似性對(duì)比發(fā)現(xiàn)，菌株QL?1與標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)seudo?monas mandelii相似性最高達(dá)99.72%，鑒定為曼氏假單胞菌，QL?4與標(biāo)準(zhǔn)菌株Asperqillus fumiqatus相似性達(dá)100%，鑒定為煙曲霉。菌株QL?1 和QL?4 為篩選菌中酶活力最高的細(xì)菌和真菌，為便于木質(zhì)素單體含量和綜合降解效率的對(duì)比評(píng)價(jià)，本文以下研究工作均基于該兩菌株開展。

2.1.2 產(chǎn)酶條件與酶活力

極差分析結(jié)果顯示，氮源是菌株QL?1 和QL?4的最主要影響因素，而培養(yǎng)時(shí)間則為最不重要的影響因素。另外，pH 為菌株QL?1 的次要影響因素，碳源則為QL?4的次要因子；均值結(jié)果顯示，QL?1和QL?4對(duì)應(yīng)的碳、氮源分別為葡萄糖、酵母粉和淀粉、蛋白胨，發(fā)酵條件為36 h、35 ℃、pH 7.0。

經(jīng)產(chǎn)酶條件優(yōu)化，兩菌株酶活力均有顯著提高（圖1），其中QL?1 的纖維素酶活力達(dá)到14.10 U·mL?1，較優(yōu)化前提高了7.27 倍，總酶活力則提高了8.15倍，達(dá)到20.22 U·mL?1；QL?4的纖維素酶活力、總酶活力分別達(dá)到8.15、9.20 U·mL?1，較優(yōu)化前提高了5.26 倍和5.75 倍?？傮w上，QL?1 的酶活力及優(yōu)化倍數(shù)均稍優(yōu)于QL?4。

2.2 枯莖降解效率

如圖2 所示，從降解時(shí)間看，菌株QL?1 在第5 d時(shí)降解失重率為6.96%，其降解失重峰值出現(xiàn)于第10 d，為9.48%；而QL?4在5 d時(shí)的降解失重率為7.66%，降解峰值亦出現(xiàn)在第10 d，為13.91%。兩菌株的共同特征為：培養(yǎng)至第10 d 時(shí)達(dá)到降解失重率峰值，而在第10～15 d 時(shí)，微生物代謝緩慢，降解趨于穩(wěn)定。由此可見，10 d為降解失重率的最大時(shí)效期。

從凈降解率看，菌株QL?4 和QL?1 在第5、10、15d的凈降解率分別為4.08%、10.11%、10.57%和3.38%、5.68%、6.05%。盡管凈降解率均隨時(shí)間逐漸增加，但QL?4在第5～10d的降解速率最快，為59.64%，而在第10～15 d 降解速率僅為4.35%；同樣，QL?1在第5～10 d的降解速率是第10～15 d的6.62倍。由此表明，若從時(shí)間成本和降解效率考量，10 d 仍可作為最佳降解時(shí)間。綜合失重率和凈降解率，均呈現(xiàn)真菌QL?4優(yōu)于細(xì)菌QL?1，且遠(yuǎn)高于CK的結(jié)果。

2.3 降解剩余物中的木質(zhì)素單體含量

2.3.1 木質(zhì)素單體含量占比

表2 為菌株降解剩余物中木質(zhì)素各單體的含量占比。從時(shí)間看，菌株QL?1 和QL?4 降解剩余物中木質(zhì)素各單體含量均隨降解時(shí)間增加而減少，表明其對(duì)木質(zhì)素具有一定的解聚作用；從組別看，在降解第5 d 時(shí)，QL?1 剩余木質(zhì)素各單體含量占比均少于QL?4，表明此時(shí)細(xì)菌的降解作用更為突出，然而到第10 d時(shí)，真菌表現(xiàn)出顯著的降解作用，其剩余物中G+S 單體含量從16.25%降至2.01%，而細(xì)菌試驗(yàn)組僅減少了2.86 個(gè)百分點(diǎn)，此后直到第15 d，兩菌株均表現(xiàn)為降解減少或不降解現(xiàn)象。以上結(jié)果表明，第10 d時(shí)兩菌株對(duì)木質(zhì)素單體的解聚效率最高。

表2 降解剩余物中木質(zhì)素單體含量占比Table 2 Lignin monomer content ratio in degradation residue

2.3.2 木質(zhì)素單體含量變化

在木質(zhì)素化學(xué)結(jié)構(gòu)官能團(tuán)中，酚羥基的多少可直接反映木質(zhì)素的物理溶解性與化學(xué)鍵合能力，甲氧基是木質(zhì)素苯酚基前體單元在輔酶因子作用下以醚鍵（C—O—C）結(jié)合而形成具化學(xué)穩(wěn)定特性的基團(tuán)[33]。相較于只含有3 位甲氧基的G 型木質(zhì)素，S 型木質(zhì)素（3、5位均含有甲氧基）結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。

圖3 木質(zhì)素單體變化表明，降解第5 d 菌株QL?1、QL?4 對(duì)G 和S 單體的凈降解率分別為1.29%、0.86%和0.92%、0.47%，均表現(xiàn)為G單體降解率高于S單體，而在5 d 后兩株菌又表現(xiàn)為S 較G 單體降解得多。原因可能在于初始降解階段酶解作用位點(diǎn)釋放有限，菌株更易與G 型木質(zhì)素的甲氧基酶解位點(diǎn)結(jié)合。當(dāng)酶解條件最適宜時(shí)，菌株則快速發(fā)生代謝酶解活性，使得含量較高的S型單體被更多利用。

從菌株差異看，QL?1和QL?4均在第5～10 d時(shí)對(duì)G+S 單體降解速率最快，第10 d 達(dá)到凈降解率最大值，分別為4.95%和15.57%。細(xì)菌QL?1 僅在酶解第5 d 時(shí)對(duì)G+S 單體的凈降解率高于真菌QL?4，而在5 d后QL?4則持續(xù)呈現(xiàn)更高效的降解能力，直到第15 d時(shí)，QL?4 對(duì)G+S 的凈降解率仍為QL?1 的3.03 倍?？赡茉蛟谟冢?xì)菌更具環(huán)境適應(yīng)性，從而顯現(xiàn)底物優(yōu)先利用特性，而真菌則需要一定的代謝轉(zhuǎn)化過程，通常在降解后期更具優(yōu)勢(shì)。

圖4 為QL?4 在第5、10、15 d 時(shí)木質(zhì)素單體降解變化示意圖。由GC?MS 譜圖變化直觀看到，木質(zhì)素G 型和S 型單體隨降解時(shí)間延長(zhǎng)均有顯著變化，而H型單體因其微量存在，并未捕捉到分子離子峰。綜上分析，單體含量變化與失重率結(jié)果呈一致性，此方法可用于綜合評(píng)價(jià)菌株的降解能力。

3 討論

3.1 酶活力與降解效果

降解木質(zhì)纖維素的酶系主要包括纖維素酶（纖維素內(nèi)切酶、外切酶和β?葡萄糖苷酶等）、半纖維素酶（β?1，4?內(nèi)切木聚糖酶、β?木糖苷酶和α?L?阿拉伯糖苷酶等）和木質(zhì)素氧化酶（木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶等）[34]。自然界中，木質(zhì)纖維素的完全降解是真菌、細(xì)菌以及其他微生物等經(jīng)復(fù)雜的酶系協(xié)同作用的結(jié)果。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，一種真菌的酶解反應(yīng)有39種代謝物和123種調(diào)控基因參與其中，并通過胞內(nèi)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及級(jí)聯(lián)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)酶解功能[35]。通常高纖維素酶活力的菌株具較強(qiáng)降解能力。劉孝文[36]篩選的煙曲霉L1，其CMC 和FPA 酶活力分別為62.15 U·mL?1和50.33 U·mL?1，降解棕櫚絲的第5 d達(dá)到最高降解率為18.04%；接種煙曲霉Z?3 的玉米秸稈失重率在第30 d 達(dá)到了26.76%，該菌株的CMC 和FPA 酶活力也較高，在第96 h 分別達(dá)到27.35 U·mL?1和14.67 U·mL?1[37]。本文篩選所得煙曲霉QL?4酶活力低于細(xì)菌QL?1，但其在降解效果上則高于QL?1，龍悅[38]的研究也體現(xiàn)了類似結(jié)果，其篩選的煙曲霉LY1纖維素酶活力為1.40 U·mL?1，與粉碎稻草發(fā)酵后降解失重率仍達(dá)到18%。菌株的酶活力與其發(fā)酵底物的失重率并不全然一致，其為酶系多樣性和酶間協(xié)同作用導(dǎo)致的結(jié)果。因此，酶活力僅可作為降解菌篩選指標(biāo)之一，并不能完全用于表征其酶解特性，還應(yīng)從多角度綜合評(píng)價(jià)菌株的降解功能。

3.2 降解失重率與降解選擇性

菌株QL?4降解失重率約為QL?1的1.75倍，而其木質(zhì)素單體降解率則為QL?1 的3.03 倍，表明煙曲霉QL?4在降解過程中對(duì)木質(zhì)素的酶解利用更具選擇性。已知的對(duì)木質(zhì)素降解具有高選擇性的模式真菌——白腐菌（Phanerochaete chrysosporium），通過選擇性降解木質(zhì)素使得纖維素及半纖維素具更大的可及性，利于被降解。白腐菌樺褐孔菌（Inonotus obliquus）各酶活力的明顯差異，體現(xiàn)出對(duì)木質(zhì)素酶解的選擇性，當(dāng)CMC 酶活力為0.3 U·mL?1并隨發(fā)酵時(shí)間趨于減弱時(shí)，木質(zhì)素錳過氧化物酶活力持續(xù)升高，達(dá)到最大為317.9 U·mL?1[24]；白腐菌多孔菌（Physisporinus vitreus）對(duì)毛竹的降解處理中，木質(zhì)素含量的降解減少率最高達(dá)21.21%，是纖維素的3.10倍[39]。本文以木質(zhì)素單體含量變化表征各菌株的降解效率和選擇性，發(fā)現(xiàn)煙曲霉對(duì)木質(zhì)素單體降解更具選擇性，其G+S總單體凈降解率在第10 d 便達(dá)到最高值15.57%。研究報(bào)道中能夠選擇性降解木質(zhì)素的微生物多為白腐菌，而本文所述結(jié)果表明，此煙曲霉亦具木質(zhì)素酶解選擇性。

3.3 煙曲霉具降解優(yōu)勢(shì)

以往研究表明，煙曲霉在園林廢棄物降解領(lǐng)域中具有顯著應(yīng)用潛力。歐陽蒲月等[40]在廣州近郊篩選的煙曲霉OY?01，具有較強(qiáng)的纖維素降解能力，最適生長(zhǎng)溫度和pH 分別為35 ℃和6.0～7.0，培養(yǎng)時(shí)間為48 h，CMC 酶活力達(dá)到1.75 U·mL?1；李樂等[41]從腐爛秸稈中篩選的高產(chǎn)纖維素酶真菌QL06，在40 ℃培養(yǎng)84 h 時(shí)，所產(chǎn)CMC 酶活力最大為5.41 U·mL?1；有報(bào)道低溫?zé)熐筍7在25 ℃的最高CMC酶活力為0.128 U·mL?1[42]，產(chǎn)耐熱纖維素酶煙曲霉NR61 在65 ℃的CMC酶活力為2.41 U·mL?1[43]。本文篩選的煙曲霉QL?4產(chǎn)酶條件與目前報(bào)道的其他煙曲霉相近，而纖維素酶活力則高達(dá)8.15 U·mL?1，在類似酶解研究中更具優(yōu)勢(shì)。但是，以往關(guān)于煙曲霉酶解過程引起木質(zhì)素單體含量變化的研究未見報(bào)道，而本研究工作則從木質(zhì)素結(jié)構(gòu)組成與單體含量角度，為煙曲霉酶解提供了數(shù)據(jù)支撐。與此同時(shí)，酶解引起木質(zhì)素各單體發(fā)生差異性改變的機(jī)理仍存在諸多未知，其酶間協(xié)同作用和木質(zhì)素單體含量變化機(jī)制還需進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

（1）從祁連山腐殖質(zhì)土層中篩選得到2 株產(chǎn)纖維素酶較好的菌株QL?1和QL?4，經(jīng)鑒定分別為曼氏假單胞菌（Pseudomonas mandelii）和煙曲霉（Aspergillus fumigatus），經(jīng)產(chǎn)酶優(yōu)化后纖維素酶活力分別為14.10 U·mL?1和8.15 U·mL?1。

（2）菌株QL?1 和QL?4 的降解失重率在第10 d時(shí)達(dá)最高，QL?4 對(duì)應(yīng)的木質(zhì)素單體相對(duì)降解率和凈降解率分別是QL?1 的4.75 倍和3.15 倍，表明煙曲霉更具降解優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用潛力。

（3）通過氣相色譜?質(zhì)譜法表征木質(zhì)素單體含量變化，可為園林生物質(zhì)酶解效率評(píng)價(jià)提供更為可靠的量化指標(biāo)，以木質(zhì)素單體結(jié)構(gòu)位點(diǎn)差異為重點(diǎn)的酶解構(gòu)效關(guān)系研究仍然是實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維素最大降解效率的關(guān)鍵所在。