利用藻菌共生體系強化養(yǎng)豬廢水厭氧消化液培養(yǎng)微藻

錢銳，劉輝，徐慧婷，馬長文，陳浩，梁珺宇，葉建鋒*

（1.上海第二工業(yè)大學(xué)工學(xué)部，上海 201209；2.上海市環(huán)境科學(xué)研究院，上海 200233）

我國是豬肉消費大國，豬肉需求的快速增長促進了集中式養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。據(jù)統(tǒng)計，很多地區(qū)的規(guī)模化養(yǎng)豬程度已經(jīng)超過90%[1]，這就意味著會集中產(chǎn)生大量的養(yǎng)豬廢水。養(yǎng)豬廢水中蘊含大量的有機物和氮磷等元素，若不經(jīng)妥善處理，將會造成環(huán)境污染和水生生態(tài)惡化。雖然各規(guī)?；B(yǎng)殖場大多建立了厭氧產(chǎn)沼氣工程，但產(chǎn)生的發(fā)酵液的處理問題依然嚴峻。另一方面，我國的蛋白飼料原料嚴重缺乏，種植業(yè)可提供的飼料蛋白質(zhì)缺口較大，種植所需氮磷肥料主要依賴工業(yè)生產(chǎn)和磷礦開采，而后者存在枯竭風(fēng)險[2]。因此，對于可持續(xù)的食品和飼料生產(chǎn)而言，廢水中的養(yǎng)分回收和再循環(huán)尤為重要，例如從養(yǎng)豬廢水中回收和循環(huán)利用氮磷等[3]。

微藻是一類具有高光合效率的初級生產(chǎn)者，它們可以在高濃度廢水中生長良好，對廢水中氮、磷等營養(yǎng)物質(zhì)的去除有很大的潛能。利用廢水培養(yǎng)微藻回收氮磷是目前的研究熱點之一，在節(jié)約微藻培養(yǎng)的成本上有明顯的優(yōu)勢[4]。近年來，將回收的微藻用于食物、飼料和生物燃料開發(fā)的研究也受到了廣泛的關(guān)注[5?6]。目前用于微藻培養(yǎng)的廢水主要包括生活廢水、工業(yè)廢水以及農(nóng)業(yè)廢水等。LI 等[7]的研究發(fā)現(xiàn)，利用高壓滅菌后的生活廢水作為底物進行微藻培養(yǎng)時，微藻最高生長量為0.24 g·L?1·d?1，但是生活廢水氮磷含量低，且對廢水進行高溫高壓滅菌預(yù)處理成本較高。CHENG 等[8]研究發(fā)現(xiàn)養(yǎng)豬廢水是微藻培養(yǎng)的理想來源，但底物中大分子的有機物難以被微生物利用，另一方面，高濃度的污染物會對微藻的生長速率和生物量產(chǎn)生不利影響。

為了提高微藻的生長量，NAM 等[9]的研究表明適當(dāng)稀釋的養(yǎng)豬廢水對微藻的生長有一定的促進作用，稀釋8 倍的豬糞廢水可獲得0.25 g·L?1·d?1的小球藻。然而稀釋倍數(shù)較高會造成處理水量的增加。WANG等[10]將廢水先經(jīng)過高溫滅菌后再進行微藻培養(yǎng)，但高壓滅菌加大了微藻培養(yǎng)的成本以及操作難度，不適合大規(guī)模推廣應(yīng)用。在自然界中，細菌和微藻的關(guān)系經(jīng)常被認為是互惠共生。POSADAS 等[11]發(fā)現(xiàn)藻菌生物膜反應(yīng)器對有機物的去除率比普通細菌生物膜反應(yīng)器高1 倍，但是藻菌生物膜反應(yīng)器限制了微藻的生長以及收獲。微藻在利用水體營養(yǎng)物質(zhì)形成新的微藻細胞的同時，釋放出氧氣供菌群利用。而微生物菌群分解有機物產(chǎn)生的小分子物質(zhì)更易于被微藻利用，從而刺激微藻的生長。但是過量微生物菌群的存在會與微藻爭奪營養(yǎng)物質(zhì)，有些細菌可以通過釋放可溶性纖維素酶或細胞外物質(zhì)導(dǎo)致微藻死亡[12]。因此，如何通過藻菌共生系統(tǒng)和藻菌的協(xié)同作用，在降低廢水有機污染物的同時，最大化促進微藻的產(chǎn)量和氮磷的轉(zhuǎn)化是未來研究的重點。

本研究針對養(yǎng)豬廢水資源化利用率低以及微藻純培養(yǎng)產(chǎn)率較低的問題，開展養(yǎng)豬廢水消化液經(jīng)藻菌共生系統(tǒng)轉(zhuǎn)化為以收獲微藻為主體的資源化利用研究。以養(yǎng)豬廢水消化液作為底物，首先對藻菌共生體系的藻菌比例進行優(yōu)化，構(gòu)建互惠共生的藻菌體系；然后對微藻接種濃度和光照周期等關(guān)鍵參數(shù)進行探究；最后在優(yōu)化的工藝條件下運行藻菌共生反應(yīng)器，深入分析其運行特性和機制，為其應(yīng)用于養(yǎng)豬廢水的資源化處理提供支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究以小球藻（Chlorella）[13]為研究藻種，在TAP[14]培養(yǎng)基中大量培養(yǎng)至對數(shù)生長期，采用蒸餾水多次清洗，離心重新懸浮后備用。以上海市某污水處理廠的活性污泥作為菌種來源，在4 ℃下靜置24 h 濃縮后作為接種污泥使用，濃縮后污泥的混合液懸浮固體濃度（Mixed liquid suspended solids，MLSS）和混合液揮發(fā)性懸浮固體（Mixed liquid volatile suspended solids，MLVSS）分別為7.56 g·L?1和3.70 g·L?1。本研究所用廢水底物為養(yǎng)豬場的厭氧消化出水，取自上海市金山區(qū)某養(yǎng)豬廠厭氧消化池，其溶解性化學(xué)需氧量（SCOD）、溶解性總氮（TDN）、溶解性總磷（TDP）、氨 氮（?N）和硝態(tài)氮（?N）濃度分別為（1 585.0±37.5）、（1 204.5±1.5）、（61.6±1.1）、（1 065.0±15.0）mg·L?1和（0.6±0.2）mg·L?1，濁度為（104.5±0.2）NTU。

1.2 實驗裝置

1.2.1 批次實驗裝置

批次實驗裝置主要用于藻菌共生系統(tǒng)關(guān)鍵工藝參數(shù)（包括藻菌比例、微藻接種濃度和光照周期）的優(yōu)化。主體為玻璃錐形瓶，其有效體積為250 mL。實驗時將底物和藻（或藻菌）在玻璃錐形瓶中混合，放置在恒溫光照搖床上，溫度控制在25～27 ℃，光源為LED燈，光強為92.27μmol·m?2·s?1。

1.2.2 反應(yīng)器設(shè)置

反應(yīng)器的運行實驗在兩個透明有機玻璃制成的圓柱體反應(yīng)器中進行，反應(yīng)器高70 cm，內(nèi)徑為7 cm，有效工作容積為9.2 L。外部左右兩側(cè)設(shè)置LED 燈架，用于提供微藻生長必需的光源。反應(yīng)器底部均設(shè)置攪拌器以保持體系的均一性。同時在反應(yīng)器內(nèi)的中部安裝了自動加熱裝置使反應(yīng)器運行溫度恒定在（26±1）℃，實驗裝置如圖1所示。

1.3 實驗方法

本研究以養(yǎng)豬廢水厭氧發(fā)酵液為底物進行微藻培養(yǎng)，分成兩部分進行。

首先在批次實驗中探究了添加不同比例的污泥對廢水中氮磷去除和微藻生長量的影響，共設(shè)置5 個藻菌比[微藻∶污泥（以MLSS 計），質(zhì)量比，下同]分別為1∶0、1∶0.2、1∶0.5、1∶1和1∶5，設(shè)置微藻初始接種濃度為0.2 g·L?1，并提供持續(xù)光照。然后在上述適宜的藻菌比條件下，對微藻初始接種濃度進一步優(yōu)化，微藻初始接種濃度分別設(shè)定為0.05、0.1 g·L?1和0.2 g·L?1，并提供持續(xù)光照。最后，選取優(yōu)化的藻菌比和微藻接種濃度，設(shè)定3 個不同光照周期，分別為8 h 光∶16 h暗（8L∶16D）、12 h光∶12 h暗（12L∶12D）、24 h光∶0 h暗（24L∶0D）。

在批次實驗的基礎(chǔ)上，選取優(yōu)化后的工藝參數(shù)，構(gòu)建和運行微藻純培養(yǎng)反應(yīng)器R1和藻菌共生反應(yīng)器R2。進一步對比反應(yīng)器中微藻生物量產(chǎn)出以及氮磷資源化的差異。反應(yīng)器中微藻初始濃度均為0.2 g·L?1，光照周期為12L∶12D。微藻純培養(yǎng)反應(yīng)器中藻菌比為1∶0，藻菌共生反應(yīng)器中藻菌比為1∶0.2。

批次實驗均設(shè)置3 次重復(fù)實驗，反應(yīng)器取3 個平行樣進行相關(guān)指標的測定，結(jié)果表達為均值±標準差。

1.4 采樣分析方法

實驗期間每日采集反應(yīng)器中的混合溶液，進行微藻生物量和總生物量的測定。樣品上清液通過0.45μm的濾膜過濾后進行水質(zhì)指標分析。分析指標包括SCOD、?N、TDN、TDP、?N、MLSS、MLVSS，均采用標準方法測定[15]。溶解氧（DO）濃度采用便攜式溶解氧儀測定，pH 值使用便攜式pH 儀測定，濁度使用濁度儀測定。微藻濃度由葉綠素濃度計算而得，葉綠素濃度的提取和測定參考相關(guān)文獻[16]。

1.5 數(shù)據(jù)處理方法

實驗數(shù)據(jù)采用Excel 2019 和SPSS 24 軟件進行統(tǒng)計分析。采用單因素ANOVA 檢驗以LSD 法及Waller?Duncan 法分析不同藻菌比下SCOD、TDN、TDP 和?N 之間的差異顯著性。使用Origin 2018作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 藻菌共生系統(tǒng)關(guān)鍵工藝參數(shù)對微藻生物量的影響

微藻在不同工藝參數(shù)下的生長情況如圖2 所示。結(jié)果表明，微藻純培養(yǎng)系統(tǒng)中微藻的生長量都低于藻菌共生系統(tǒng)。不同藻菌比下微藻最高產(chǎn)量分別為0.58、0.83、0.82、0.75 g·L?1和0.61 g·L?1。微生物可以分解復(fù)雜的有機底物，產(chǎn)生易于被微藻利用的小分子有機酸[17]。但是過多的污泥會與微藻爭奪環(huán)境中的營養(yǎng)物質(zhì)[18]，并且隨著活性污泥的添加，系統(tǒng)中的濁度從最初的104 NTU 增加到了653 NTU，導(dǎo)致系統(tǒng)透光性差，微藻光合作用速率下降，限制了微藻的生長。因此，投入過量的污泥會使得微藻因失去競爭優(yōu)勢而走向衰亡。由此可見，加入適量的污泥構(gòu)成的藻菌共生系統(tǒng)，即當(dāng)藻菌比例為1∶0.2時，能夠形成良好的藻菌互惠共生關(guān)系。

微藻的初始接種濃度影響微藻在廢水中的適應(yīng)性和生長速率。固定藻菌比例為1：0.2 的條件下，當(dāng)微藻初始接種濃度為0.05、0.1 g·L?1和0.2 g·L?1時，微藻的最大增長量分別為0.41、0.52 g·L?1和0.68 g·L?1。在不同光照周期系統(tǒng)中，微藻均能正常生長。如圖2C 所示，相比于其他兩個系統(tǒng)，在12L∶12D 系統(tǒng)中，微藻達到了最高的生長速率和生長量，分別為0.2 g·L?1·d?1和0.81 g·L?1，24L∶0D系統(tǒng)次之，8L∶16D系統(tǒng)最小。這一結(jié)果與其他研究中光照周期對微藻生長的影響趨勢一致[19?20]。從微藻生物質(zhì)的變化趨勢來看，微藻的光合作用存在一定的飽和時間[21]，在此范圍內(nèi)，光照時間越長，微藻積累量越大。因此，在微藻培養(yǎng)過程中，需要選用適宜的光照周期。

綜上所述，在利用養(yǎng)豬廢水厭氧發(fā)酵液培養(yǎng)微藻時，加入適量的活性污泥構(gòu)建藻菌共生體系，有助于微藻的生長繁殖。并且采用藻菌比1∶0.2、微藻接種濃度0.2 g·L?1、光照周期12L∶12D 時，能夠獲得最優(yōu)的微藻生長量。

2.2 藻菌共生體系關(guān)鍵工藝參數(shù)對污染物去除率的影響

微藻純培養(yǎng)系統(tǒng)中SCOD 的去除率為85%，而藻菌比1∶5 系統(tǒng)中SCOD 的去除率達90%（圖3A）。從氮的去除上來看，在藻菌比1∶0條件下，TDN和?N的去除率最低，分別為25.7%和13.2%，藻菌比1∶0.2條件下TDN 和?N 的去除率最大，分別為32.7%和21.3%。分析認為，藻菌共生系統(tǒng)中的微生物將有機氮轉(zhuǎn)化為氨，有利于藻類同化[22]，并且在藻菌比1∶0.2 條件下生物量最高（0.83 g·L?1），提高了氮的同化量。但是，在藻菌比1∶5 時，大量細菌的呼吸作用導(dǎo)致系統(tǒng)中溶解氧濃度不足1 mg·L?1，生成的?N 不能有效地轉(zhuǎn)化成?N及?N，使得系統(tǒng)中仍有較高濃度的?N。體系中TDP 的去除與微藻的同化和微生物的活動有關(guān)[23]。有研究表明，1 g 藻類細胞的生長需要0.009 g磷[24]，但是在本實驗中收獲最少生物量的微藻純培養(yǎng)系統(tǒng)中，TDP 的去除率最高達76%，表明除了藻類的同化作用，還存在其他的去除途徑。通過對體系pH 的監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，微藻純培養(yǎng)系統(tǒng)中pH 值高于藻菌共生系統(tǒng)，達到9.4，適宜磷酸鹽的析出[25]，這可能是其去除率較高的原因。

圖3B、圖3C 顯示了不同微藻接種濃度和光照周期條件下污染物的去除率。污染物的去除率與微藻生物量的變化趨勢一致。其中，TDP的去除率受光照周期的影響較大。隨著光照時間的增加，TDP的去除率從12%增加至61%后下降到41%，這與微藻光合作用產(chǎn)氧造成體系內(nèi)厭氧/好氧環(huán)境的交替有關(guān)。聚磷菌只有在厭氧/好氧交替的環(huán)境下才能完成釋磷?吸磷機制[26]。持續(xù)的光照使得體系一直處于好氧狀態(tài)，聚磷菌無法在厭氧狀態(tài)下有效釋磷并儲存胞內(nèi)能源物質(zhì)[27?28]，導(dǎo)致其不能從環(huán)境中吸收溶解態(tài)的正磷酸鹽，TDP 的去除率反而變低。綜上所述，在微藻接種濃度0.2 g·L?1、藻菌比1∶0.2、光照周期12L∶12D時，能夠獲得較大的微藻生物量，同時能夠有效去除養(yǎng)豬廢水消化液中的有機物和營養(yǎng)元素。

2.3 反應(yīng)器運行機制及藻菌共生體系特性

2.3.1 反應(yīng)器中微藻生物量變化分析

微生物菌群的投加提高了微藻的生長上限，藻菌共生體系具有更高的微藻產(chǎn)出。微藻純培養(yǎng)反應(yīng)器R1 和藻菌共生反應(yīng)器R2 中微藻生長情況如圖4A 所示。R1、R2反應(yīng)器中微藻濃度在運行第5 d分別達到了0.52 g·L?1和0.66 g·L?1。從第6 d開始R2中微藻開始二次生長，達到1.37 g·L?1。微藻的生長受多種因素的影響，反應(yīng)器中的溶解氧濃度、pH 值、碳源等均是微藻增殖的重要限制因素[29?31]。R1和R2中污泥和微藻的混合濃度（以MLSS 表示，圖4B）在前5 d 保持一致。微藻在進行光合作用的過程中，吸收CO2、釋放OH?和O2，從而提高反應(yīng)器中pH 和DO 的水平[32]。R1 在運行全過程中pH 值和溶解氧濃度隨著反應(yīng)時間的推移而不斷增加，如圖4C、圖4D 所示。由于藻類對營養(yǎng)物的親和力較高，能在培養(yǎng)基中存在高濃度有機物的情況下抑制細菌的生長[21]，因此在反應(yīng)前期，R2中微藻占據(jù)競爭優(yōu)勢。在反應(yīng)中期，微藻生長趨于穩(wěn)定，產(chǎn)生氧氣供好氧細菌繁殖積累，進而降低了反應(yīng)器中溶解氧的濃度以及pH 值，微藻利用CO2等碳源完成自身增殖[33]，呈現(xiàn)二次增長，形成良好的互惠共生關(guān)系，最終獲得了更高的微藻產(chǎn)量，證明了該類型反應(yīng)器的資源化優(yōu)勢。

2.3.2 反應(yīng)器中污染物去除效果分析

微藻純培養(yǎng)反應(yīng)器R1 和藻菌共生反應(yīng)器R2 處理養(yǎng)豬廢水厭氧消化液的運行過程中反應(yīng)器內(nèi)污染物指標的變化情況如圖5 所示。由于13 d 后微藻有明顯的衰亡現(xiàn)象，因此實驗全過程監(jiān)測時間為13 d。R1 和R2 對SCOD 的去除效果相差較大，R1 中SCOD有明顯的積累現(xiàn)象，最終去除率僅為24.4%。而R2中SCOD 最終去除率達到81.0%。并且R2 對TDN、?N 和TDP 的去除體現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢。R2 中TDN、?N 的去除率在前6 d 與R1 反應(yīng)器相似，之后隨著微藻的二次生長，R2中氮的含量迅速減少，TDN和?N去除率最終達47.5%和78.7%。R2 中TDP的去除率可達72.1%。投加微生物菌群構(gòu)建的藻菌共生反應(yīng)器，能在提高微藻生物量的同時強化對氮磷等營養(yǎng)物質(zhì)的回收與利用，更好地實現(xiàn)養(yǎng)豬廢水厭氧消化液的資源化回收利用。

對反應(yīng)器中微藻平均生長速率進行分析發(fā)現(xiàn)，微藻純培養(yǎng)反應(yīng)器中在第4 d 時最大（0.09 g·L?1·d?1），而藻菌共生反應(yīng)器中在第2 d 時最大（0.16 g·L?1·d?1）。因此，為了高效地收獲微藻，運用藻菌共生反應(yīng)器可以提高微藻的生長速率和生長上限，收獲周期可設(shè)定為2 d?？紤]到污染物的高效去除，可以設(shè)置HRT 為12 d，此時SCOD、TDN、TDP 和?N 的去除率分別為85.0%、50.2%、72.1%和78.7%。

3 結(jié)論

（1）相對于微藻純培養(yǎng)，投加適宜比例的菌群，構(gòu)建互惠共生的藻菌共生體系，有利于提高微藻產(chǎn)量。

（2）在優(yōu)化的工藝條件下運行微藻純培養(yǎng)反應(yīng)器與藻菌共生反應(yīng)器，發(fā)現(xiàn)藻菌共生體系有利于提供微藻生長所需的無機碳源和有機小分子碳源，維持反應(yīng)器酸堿環(huán)境，進而提高微藻生長速率和產(chǎn)量上限，微藻最高生長量比微藻純培養(yǎng)系統(tǒng)中提高了1 倍，達

1.4 g·L?1。

（3）藻菌共生反應(yīng)器對溶解性化學(xué)需氧量、氮和磷的去除效果優(yōu)于微藻純培養(yǎng)反應(yīng)器。