不同施肥水稻土可溶性有機(jī)氮變化速率及對(duì)細(xì)菌的響應(yīng)

楊靜，林祎，楊文浩，2，周碧青，2，毛艷玲，2，邢世和，2*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，福州 350002；2.土壤生態(tài)系統(tǒng)健康與調(diào)控福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350002）

土壤可溶性有機(jī)氮（Soluble organic nitrogen，SON）是土壤氮素礦化為無(wú)機(jī)氮的中間產(chǎn)物，其轉(zhuǎn)化速率（VSON）在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)氮循環(huán)中具有重要作用[1]。近年來的研究表明，土壤蛋白轉(zhuǎn)化為氨基酸是氮素礦化的限速步驟，其轉(zhuǎn)化速率與土壤氮素的有效性密切相關(guān)[2]。Schimel 等[3]研究也指出，高分子量SON 轉(zhuǎn)化為低分子量SON 的速率是控制新的可利用氮向生態(tài)系統(tǒng)持續(xù)流動(dòng)和氮素循環(huán)的關(guān)鍵。然而，目前的研究主要集中于土壤SON 含量方面，而對(duì)土壤VSON的研究欠缺，因此水稻生育期土壤VSON還有待進(jìn)一步研究。

微生物在土壤氮循環(huán)中起著關(guān)鍵的作用，其可通過礦化作用將大分子有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為SON，包括植物可吸收的多肽和氨基酸，并通過氨化和硝化作用將SON轉(zhuǎn)化為可溶性無(wú)機(jī)氮（SIN，即?N 和?N）[4]。此外，微生物可直接吸收低分子量SON 如氨基酸，并通過轉(zhuǎn)氨作用進(jìn)行同化，多余氮素以?N 形式排出體外[5]。植物根系捕獲SON 和SIN 的相對(duì)數(shù)量也依賴于根際微生物群落對(duì)氮素的競(jìng)爭(zhēng)能力[6]。因此，微生物在SON 轉(zhuǎn)化過程中至關(guān)重要。但已有的研究大部分局限于土壤物理性質(zhì)（溫度和黏粒含量）、化學(xué)性質(zhì)（pH 和有機(jī)質(zhì)含量）及生物性質(zhì)（酶活性和微生物量氮）對(duì)SON 含量的影響[7?9]。微生物數(shù)量、多樣性和群落結(jié)構(gòu)對(duì)土壤VSON的影響還有待研究。

施肥是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要措施，也是農(nóng)田土壤SON的重要來源。長(zhǎng)期施用氮肥能夠提高土壤SON 的含量，且SON含量隨施氮量增加而升高[10]，但尿素、硫酸銨和緩釋尿素處理間無(wú)顯著差異[11]。有機(jī)物料施用可顯著提高土壤SON 的含量，但不同種類有機(jī)物料對(duì)SON動(dòng)態(tài)變化的影響不同，低C/N 的有機(jī)物料施入土壤后，顯著提高了SON 累積量，而高C/N 的有機(jī)物料施用后，土壤SON 累積量較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)無(wú)明顯增加[12]?？梢?，氮肥類型對(duì)SON 累積量具有顯著影響。但目前的研究主要集中于不同氮肥對(duì)農(nóng)田系統(tǒng)中SON 含量的影響方面，而不同氮肥施用后對(duì)水稻土VSON的研究鮮見報(bào)道，有關(guān)紫云英施用對(duì)水稻土VSON的影響及該過程中微生物的作用仍待進(jìn)一步研究。因此，本研究以南方典型的灰黃泥田水稻土為研究對(duì)象，分析水稻生育期不同施肥方式（單施化肥、化肥配施紫云英和單施紫云英）下土壤VSON的差異及VSON對(duì)細(xì)菌群落的響應(yīng)，為完善水田生態(tài)系統(tǒng)SON 轉(zhuǎn)化過程提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于福建省閩侯縣白沙鎮(zhèn)（119°04′10″E，26°13′31″N），該地屬于亞熱帶氣候，年均氣溫19.5 ℃，年均降水量1 350 mm，年日照時(shí)數(shù)1 812.5 h。試驗(yàn)地土壤類型為灰黃泥田，成土母質(zhì)為中性巖紅壤，質(zhì)地類型為壤質(zhì)黏土。耕層土壤的初始基本理化性質(zhì)為：pH 5.53，有機(jī)質(zhì)含量17.65 g·kg?1，堿解氮含量29.95 mg·kg?1，速效磷含量20.85 mg·kg?1，速效鉀含量96.65 mg·kg?1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)當(dāng)?shù)氐氖┓誓Ｊ郊白显朴⒌某Ｒ?guī)施用量，試驗(yàn)設(shè)置單施化肥（對(duì)照，CK）、紫云英配施化肥（紫云英翻壓量30 000 kg·hm?2，CMV1）、單施紫云英（紫云英翻壓量45 000 kg·hm?2，CMV2）3 種處理，每種處理設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，小區(qū)面積為12 m2（3 m×4 m），采用隨機(jī)區(qū)組排列。試驗(yàn)采用等氮磷鉀的施肥方案，施用的化肥為尿素481.7 kg·hm?2、過磷酸鈣900 kg·hm?2和氯化鉀300 kg·hm?2，尿素和氯化鉀的50%作基肥（紫云英翻壓后第9 d），50%作分蘗肥施用（紫云英翻壓后第25 d），過磷酸鈣均作基肥施用。供試紫云英品種為閩紫7 號(hào)，于2017 年10 月21 日種植，2018 年4 月6日紫云英盛花期收獲后進(jìn)行異地翻壓。紫云英干物質(zhì)中有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷和全鉀的含量分別為752.75、30.94、5.91 g·kg?1和32.47 g·kg?1，含水量為90%。施用紫云英處理中氮磷鉀不足的部分在施用基肥時(shí)用化肥補(bǔ)齊。試驗(yàn)區(qū)種植再生稻，品種為Ⅱ優(yōu)673，于紫云英翻壓后第10 d 移栽，株距20 cm，行距15 cm，水稻農(nóng)事管理措施與當(dāng)?shù)乇３忠恢隆?/p>

1.3 樣品采集與處理

在紫云英翻壓后10 d（水稻移栽期）、17 d（水稻幼苗期）、24、38 d（水稻分蘗期）、59、80 d（水稻揚(yáng)花期）、101、122 d（水稻成熟期）分別采用梅花形采樣法采集各處理耕層土壤（0～20 cm）樣品。去除土樣中的侵入體、植物殘?bào)w和根系并混合均勻后，采用棋盤式采樣法將樣品分為兩份，一份鮮樣直接用于土壤SON測(cè)定，另一份鮮樣用于水稻生育期土壤細(xì)菌數(shù)量和群落分析。

1.4 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.4.1 土壤SON測(cè)定

土壤SON采用差減法測(cè)定。稱取5 g新鮮土樣于50 mL 三角瓶中，根據(jù)土水比1∶5 加入蒸餾水后置于恒溫振蕩器中70 ℃浸提18 h，浸提液采用0.45μm 濾膜過濾。濾液中的可溶性總氮（TSN）和SIN（?N、?N、?N之和）分別采用帶有氮檢測(cè)器的總有機(jī)碳分析儀（TOC?L，Shimadzu，日本）和連續(xù)流動(dòng)注射分析儀（Flowsys，Systea，意大利）進(jìn)行測(cè)定。土壤SON通過TSN和SIN差減法獲得，即SON=TSN?SIN[13]。

1.4.2 土壤DNA提取與實(shí)時(shí)熒光定量PCR

稱取0.25 g 新鮮土壤，參照PowerSoil DNA 試劑盒（MoBio Laboratories，美國(guó)）的具體方法和步驟提取土壤DNA。提取得到的DNA 樣品用1%瓊脂糖凝膠電泳和分光光度法（260 nm/280 nm 光密度比）進(jìn)行檢測(cè)。采用引物515F 和806R 對(duì)土壤細(xì)菌16S rRNA 基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量擴(kuò)增，測(cè)定細(xì)菌16S rRNA 基因拷貝數(shù)。反應(yīng)體系構(gòu)成：1 μL 模板DNA，5 μL 2×SYBR Premix Ex TaqTM，正反向引物（10 μmol·L?1）各0.5 μL、3 μL ddH2O。熒光定量采用兩步法進(jìn)行，具體條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃30 s、55 ℃30 s、72 ℃30 s，30 個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸10 min。提取質(zhì)粒作為制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)品，建立定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，具體方法參考文獻(xiàn)[14]。

1.4.3 高通量測(cè)序及數(shù)據(jù)分析通過Illumina Miseq PE300 高通量測(cè)序平臺(tái)，采用338F 和806R 引物對(duì)細(xì)菌16S rRNA 基因的V3～V4區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增和測(cè)序[15]。PCR 反應(yīng)體系：2 μL 模板DNA，正反向引物（5 μmol·L?1）各0.5 μL，12.5 μL 2×Taq PCR MasterMix，3 μL BSA（2 ng·μL?1），5.5 μL ddH2O。反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性45 s、55 ℃退火50 s、72 ℃延伸45 s，32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。測(cè)序原始序列上傳至NCBI 的SRA 數(shù)據(jù)庫(kù)。測(cè)序結(jié)束后，對(duì)原始下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控處理。使用QIIME（v1.8.0）軟件對(duì)原始序列進(jìn)行過濾、拼接、去除嵌合體，去除引物錯(cuò)配或測(cè)序長(zhǎng)度小于150 bp 的序列[14]。根據(jù)Barcodes 歸類將各處理組序列信息劃分為用于物種分類的OTU（Operational taxonomic units），OTU 相似性設(shè)為97%。對(duì)比Silva 數(shù)據(jù)庫(kù)，得到每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的物種分類信息，并用于后續(xù)分析。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用Excel 2007 和SPSS 19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析、Origin 2019 和R 3.5.1 軟件作圖，采用單因素方差分析法（One?way analysis of variance，ANOVA）對(duì)不同處理間差異顯著性進(jìn)行分析，水稻生育期耕層土壤SON含量及其變化速率采用Origin 2019軟件進(jìn)行擬合計(jì)算，耕層土壤VSON對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的響應(yīng)采用CANOCO 4.5統(tǒng)計(jì)軟件中的冗余分析方法（RDA）分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 耕層土壤SON含量及其變化速率

2.1.1 不同施肥處理耕層土壤SON含量

水稻生育期內(nèi)不同施肥處理耕層土壤SON 含量變化均呈“快速下降?緩慢波動(dòng)?趨于平穩(wěn)”的變化趨勢(shì)（圖1）。紫云英翻壓10 d（移栽期），不同施肥處理土壤SON 含量達(dá)到峰值，CK、CMV1 和CMV2 處理的SON 含量分別較其他時(shí)期高50.63%～192.94%、43.29%～105.73%和30.59%～111.44%（P<0.05）；紫云英翻壓38 d（分蘗期），CK、CMV1 和CMV2 處理土壤SON 含量最低，僅分別為移栽期的34.14%、49.04%和47.29%。水稻生育期內(nèi)CMV1 和CMV2 處理土壤SON含量均值分別較CK處理高16.90%和20.02%，水稻生長(zhǎng)中前期（0～80 d），CMV1 和CMV2 處理土壤SON 含量均顯著高于CK 處理，而水稻生長(zhǎng)后期（101～122 d），不同施肥處理間土壤SON 含量無(wú)顯著差異。可見，施用紫云英能夠顯著增加水稻生育中前期耕層土壤的SON含量，且在移栽期達(dá)到峰值。

2.1.2 不同施肥處理耕層土壤VSON

根據(jù)水稻生育期內(nèi)耕層土壤SON 含量呈快速下降?緩慢波動(dòng)?趨于平穩(wěn)的變化趨勢(shì)，分別采用單指數(shù)衰減、雙指數(shù)衰減和三指數(shù)衰減模型對(duì)土壤SON含量變化進(jìn)行擬合，結(jié)果表明單指數(shù)衰減模型擬合試驗(yàn)數(shù)據(jù)的R2最接近于1（表1），表明采用單指數(shù)衰減模型對(duì)供試土壤SON 含量變化的擬合效果最佳，CK、CMV1 和CMV2 處理水稻土耕層土壤SON 含量（y）隨時(shí)間（t）變化的單指數(shù)衰減擬合模型分別為y1=62.58exp（?t/6.29）+10.19，y2=38.86exp（?t/8.12）+12.29和y3=27.94exp（?t/11.21）+12.68（圖2a）。通過對(duì)上述最佳擬合曲線進(jìn)行求導(dǎo)，獲得CK、CMV1 和CMV2 處理水稻生育期內(nèi)耕層土壤SON 含量變化速率（y′）隨時(shí)間（t）的模型分別為y1′=?9.95exp（?t/6.29），y2′=?4.79exp（?t/8.12）和y3′=?2.49exp（?t/11.21）（圖2b）。

表1 水稻生育期耕層土壤SON含量變化的不同模型擬合效果Table 1 Fitting effects of different models on variation of SON content in topsoil during the rice growth period

由不同處理土壤SON 含量及其變化速率曲線可以看出（圖2），不同施肥處理耕層土壤SON 含量在水稻生育前期（0～24 d）呈快速下降趨勢(shì)，其中以移栽期土壤VSON值最大，不同施肥處理VSON值介于1.02～2.02 mg·kg?1·d?1之間，是幼苗期的1.87～3.04倍。CK處理土壤SON含量下降速率最快，水稻生育期內(nèi)CK處理VSON分別是CMV1 和CMV2 處理的1.29 倍和1.50 倍。可見，水稻生育前期耕層土壤SON 含量降低速率較快，施用紫云英能夠減緩耕層土壤SON含量的變化速率，在一定時(shí)期內(nèi)維持耕層土壤中SON含量的相對(duì)穩(wěn)定。

2.2 耕層土壤細(xì)菌數(shù)量、多樣性及其與SON 變化速率的關(guān)系

2.2.1 耕層土壤細(xì)菌數(shù)量

水稻生育期不同施肥處理耕層土壤細(xì)菌數(shù)量具有一定差異（圖3）。CK 處理移栽期耕層土壤細(xì)菌數(shù)量較CMV1 和CMV2 處理分別顯著增加22.77%和37.01%（P<0.05）；幼苗期耕層土壤細(xì)菌數(shù)量顯著降低，CK 處理幼苗期耕層土壤細(xì)菌數(shù)量較移栽期顯著降低了32.27%。施用分蘗肥后，耕層土壤細(xì)菌數(shù)量呈先逐漸升高后降低的變化規(guī)律。隨著紫云英的不斷腐解，水稻生育期內(nèi)施用紫云英處理的耕層土壤細(xì)菌數(shù)量逐漸增加，且隨施用量的增加而增大，并于揚(yáng)花期達(dá)到峰值，CMV1和CMV2處理水稻揚(yáng)花期土壤細(xì)菌數(shù)量分別較CK 處理顯著提高25.44%和29.15%（P<0.05）。可見，施肥能夠顯著增加耕層土壤細(xì)菌數(shù)量，CK處理耕層土壤細(xì)菌數(shù)量波動(dòng)較大，而施用紫云英處理耕層土壤細(xì)菌數(shù)量隨水稻生育期推移逐漸增加。

2.2.2 耕層土壤細(xì)菌多樣性

水稻移栽期和分蘗期CK 處理耕層土壤細(xì)菌Chao1 指數(shù)顯著低于其他生育期，而施用紫云英處理的細(xì)菌Chao1 指數(shù)均有一定程度提高（圖4a）。分蘗期CMV1 和CMV2 處理細(xì)菌Chao1 指數(shù)顯著高于CK處理，較CK 處理分別提高61.83%和33.03%，但其他時(shí)期不同施肥處理間細(xì)菌Chao1 指數(shù)無(wú)顯著差異。不同施肥處理間耕層土壤細(xì)菌Shannon指數(shù)無(wú)顯著差異。成熟期不同施肥處理細(xì)菌Shannon指數(shù)最高，CK、CMV1 和CMV2 處理的細(xì)菌Shannon 指數(shù)分別較移栽期顯著提高22.22%、20.52%和26.02%?？梢?，不同施肥處理對(duì)耕層土壤細(xì)菌豐富度和多樣性具有一定影響，單施化肥可顯著抑制耕層土壤細(xì)菌群落的豐富度，而施用紫云英則會(huì)有一定的減緩作用，不同施肥處理成熟期耕層土壤細(xì)菌群落的多樣性顯著提高。

2.2.3 土壤細(xì)菌數(shù)量及多樣性與VSON的關(guān)系

如表2 所示，相關(guān)性分析結(jié)果表明，耕層土壤細(xì)菌Shannon 指數(shù)和Chao1 與VSON呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為?0.461 和?0.430，而細(xì)菌數(shù)量與VSON無(wú)顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)僅為0.128?？梢?，耕層土壤細(xì)菌物種數(shù)目和多樣性提高，可顯著減緩?fù)寥繱ON 的變化速率，而細(xì)菌數(shù)量對(duì)VSON無(wú)顯著影響。

表2 水稻生育期不同施肥處理細(xì)菌數(shù)量及多樣性與VSON的相關(guān)分析Table 2 Correlation analysis between bacterial biomass and diversity and the VSON under different fertilization treatments in the rice growth period

2.3 耕層土壤細(xì)菌群落及其與VSON的關(guān)系

2.3.1 耕層土壤細(xì)菌群落組成

水稻生育期內(nèi)不同施肥處理耕層土壤細(xì)菌群落門水平以變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloro?flexi）、酸桿菌門（Acidobacteria）和放線菌門（Actino?bacteria）為主，合計(jì)相對(duì)豐度達(dá)79.30%～90.90%（圖5a）。成熟期耕層土壤綠彎菌門和酸桿菌門生長(zhǎng)較旺盛，而變形菌門和放線菌門的生長(zhǎng)則受到抑制。與CK處理相比，水稻生育期內(nèi)CMV2處理土壤變形菌門相對(duì)豐度均值顯著降低19.60%，放線菌門相對(duì)豐度均值顯著增加28.93%，綠彎菌門和酸桿菌門無(wú)顯著差異，而CMV1 處理4 種菌群均與CK 處理無(wú)顯著差異。在科水平（圖5b），水稻生長(zhǎng)發(fā)育中前期（0～80 d）耕層土壤細(xì)菌均以草酸桿菌科（Oxalobacteraceae）、微球菌科（Micrococcaceae）和Acidobacteriaceae_（Subgroup_1）科為主，合計(jì)相對(duì)豐度達(dá)29.30%～50.90%，而成熟期耕層土壤草酸桿菌科和微球菌科生長(zhǎng)受到抑制，未出現(xiàn)明顯的優(yōu)勢(shì)菌種。與CK 處理相比，水稻生育期內(nèi)CMV2 處理土壤草酸桿菌科相對(duì)豐度均值顯著降低45.09%，微球菌科相對(duì)豐度均值顯著增加39.67%，Ac?idobacteriaceae_（Subgroup_1）科無(wú)顯著差異，而CMV1處理3種菌群均與CK處理無(wú)顯著差異。

2.3.2 耕層土壤細(xì)菌群落與VSON的關(guān)系

水稻生育期VSON與細(xì)菌門水平相對(duì)豐度的冗余分析結(jié)果表明（圖6a），第一和第二排序軸分別解釋了土壤VSON變異的86.0%和6.2%，說明前兩排序軸尤其是第一排序軸可較好地反映土壤VSON與細(xì)菌門水平的關(guān)系。在13個(gè)門水平的細(xì)菌群落中，放線菌門相對(duì)豐度與第一排序軸呈最大正相關(guān)（r=0.834），變形菌門相對(duì)豐度與第一排序軸呈最大負(fù)相關(guān)（r=?0.568）。水稻生育期VSON與細(xì)菌科水平相對(duì)豐度的冗余分析結(jié)果表明（圖6b），第一排序軸和第二排序軸分別解釋了土壤VSON變異的90.5%和7.1%，累積解釋了97.6%的土壤VSON變異。在14 個(gè)科水平的細(xì)菌群落中，微球菌科相對(duì)豐度與第一排序軸呈最大正相關(guān)（r=0.790），0319?6A21 科相對(duì)豐度與第一排序軸呈最大負(fù)相關(guān)（r=?0.552），其次為草酸桿菌科（r=?0.490）。可見，水稻生育期內(nèi)放線菌門和微球菌科的相對(duì)豐度與VSON呈顯著正相關(guān)，而變形菌門和草酸桿菌科的相對(duì)豐度與VSON呈顯著負(fù)相關(guān)。

2.4 耕層土壤顯著性差異物種及其與VSON的關(guān)系

2.4.1 耕層土壤顯著性差異物種分析

由于不同施肥處理間差異物種的影響均較?。↙DA 差異分析的對(duì)數(shù)得分值均<3.0），因此本研究?jī)H對(duì)不同生育期耕層土壤具有顯著性差異的關(guān)鍵細(xì)菌菌群進(jìn)行LEfSe分析。結(jié)果表明（圖7），5個(gè)時(shí)期共有12 個(gè)顯著性差異物種，其中，移栽期4 個(gè)，分蘗期3個(gè)，成熟期5 個(gè)。水稻移栽期耕層土壤放線菌門、放線菌綱（Actinobacteria）、微球菌目（Micrococcales）、微球菌科的相對(duì)豐度較高；分蘗期耕層土壤變形菌門、伯克氏菌目（Burkholderiales）、草酸桿菌科的相對(duì)豐度最高。而綠彎菌門、酸桿菌門的索利氏菌綱（Soli?bacteres）、索利氏菌目（Solibacterales）、Solibacterace?ae Subgroup_3 科和變形菌門的a?變形菌綱（Alphap?roteobacteria）是成熟期耕層土壤較豐富的菌群。水稻幼苗期和揚(yáng)花期耕層土壤細(xì)菌科水平上無(wú)顯著差異菌群?？梢?，耕層土壤細(xì)菌顯著差異物種的組成因水稻生育期不同而異。

2.4.2 耕層土壤顯著性差異物種與VSON的關(guān)系

不同生育期耕層土壤VSON和顯著性差異物種相對(duì)豐度的相關(guān)分析結(jié)果表明（圖8），移栽期耕層土壤VSON與微球菌目、微球菌科的相對(duì)豐度呈極顯著正相關(guān)，與伯克氏菌目、草酸桿菌科的相對(duì)豐度呈極顯著負(fù)相關(guān)。分蘗期耕層土壤VSON與索利氏菌綱、索利氏菌目、Solibacteraceae Subgroup_3 科的相對(duì)豐度均呈極顯著正相關(guān)，與伯克氏菌目、草酸桿菌科的相對(duì)豐度呈極顯著負(fù)相關(guān)。成熟期耕層土壤VSON與放線菌門的相對(duì)豐度呈極顯著正相關(guān)?？梢姡谒疽圃云谕寥繴SON對(duì)微球菌科和草酸桿菌科的響應(yīng)較為敏感，分蘗期土壤VSON對(duì)草酸桿菌科、綠彎菌門和Solibacte?raceae Subgroup_3 科的響應(yīng)較為敏感，而成熟期土壤VSON則對(duì)放線菌門的響應(yīng)更為敏感。

3 討論

3.1 不同施肥處理和水稻生育期對(duì)耕層土壤VSON的影響

土壤SON 是土壤氮庫(kù)中最活躍的組分之一，其轉(zhuǎn)化速率與土壤氮素有效性密切相關(guān)。劉春增等[10]的研究表明，單施紫云英和紫云英配施化肥均可顯著提高土壤SON 的含量。本研究結(jié)果也表明施用紫云英可顯著增加稻田土壤SON含量（圖1），降低VSON（圖2），且紫云英施用量越大影響越明顯。究其原因是因?yàn)镃MV1 處理中添加的尿素屬于低分子量SON，其施入土壤后能被快速降解為無(wú)機(jī)氮，周轉(zhuǎn)速度較快[16]，導(dǎo)致SON 含量快速降低；而CMV2處理中由于供試紫云英自身含有大量的蛋白質(zhì)（193.4 g·kg?1）和酸解氨基酸（82.35 mg·kg?1），施入土壤后不但可快速增加土壤中SON 含量，且有利于水稻生長(zhǎng)，促進(jìn)根系分泌物增加，從而刺激微生物生長(zhǎng)[17]；紫云英的施用向土壤輸入了大量的外源有機(jī)質(zhì)（CMV2 和CMV1 分別輸入3 429.04 kg·hm?2和2 286.02 kg·hm?2外源有機(jī)質(zhì)），這為土壤微生物活動(dòng)提供了大量的能量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，增強(qiáng)了土壤微生物活性，加速有了機(jī)質(zhì)分解產(chǎn)生低分子量SON[18]，從而減緩?fù)寥繱ON 含量的變化，降低了VSON。然而，程會(huì)丹等[19]的研究表明紫云英翻壓量超過22 500 kg·hm?2時(shí)，腐解產(chǎn)生的還原性氣體和有害離子會(huì)使微生物數(shù)量降低，從而降低土壤SON 含量，這與本研究結(jié)果有所差異，可能與土壤類型、有機(jī)無(wú)機(jī)肥配施比例及田間管理等不同有關(guān)。

水稻不同生育期耕層土壤VSON也各異。水稻生育前期耕層土壤SON 含量快速降低，VSON變化大，其中以移栽期的VSON最高，這主要是由于水稻生長(zhǎng)前期施入土壤中的紫云英分解處于營(yíng)養(yǎng)控制階段，有機(jī)物的分解和氮礦化過程迅速進(jìn)行[20]，導(dǎo)致不同施肥處理耕層土壤SON 均快速周轉(zhuǎn)。水稻分蘗期耕層土壤SON含量及變化速率降至最低，這可能是由于該時(shí)期紫云英所含的易分解可溶性有機(jī)物質(zhì)已基本分解[21]，致使土壤SON 的補(bǔ)充減少，且該時(shí)期水稻生長(zhǎng)旺盛，根系吸收無(wú)機(jī)氮和低分子量SON的能力增強(qiáng)[22]，導(dǎo)致土壤SON 含量和變化速率下降。分蘗期后VSON逐漸平穩(wěn)并趨于0，主要是由于水稻生長(zhǎng)后期紫云英的分解處于木質(zhì)素控制階段，分解速率緩慢并停留在一個(gè)較低的水平[20]，因此水田耕層土壤的VSON低。

3.2 耕層土壤VSON對(duì)細(xì)菌的響應(yīng)

VSON主要取決于土壤有機(jī)氮礦化為SON 及SON通過氨化作用產(chǎn)生?N 的過程，且均受微生物調(diào)控。本研究結(jié)果表明土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性與耕層土壤VSON呈極顯著負(fù)相關(guān)，這可能是由于微生物多樣性的提高利于有機(jī)氮分解[23]，從而提高了土壤SON的保留量，降低了土壤VSON。土壤微生物群落組成是調(diào)控土壤SON 含量的主要因素[24]。本研究冗余分析結(jié)果表明，放線菌門微球菌科相對(duì)豐度與VSON呈正相關(guān)，變形菌門草酸桿菌科相對(duì)豐度與VSON呈負(fù)相關(guān)，表明放線菌門微球菌科可能與SON 的累積顯著相關(guān)，而草酸桿菌科則可能與SON 的分解顯著相關(guān)。草酸桿菌科是與有機(jī)質(zhì)降解有關(guān)的細(xì)菌群落，其參與植物殘?bào)w的礦化[25]，能夠?qū)⑼寥烙袡C(jī)質(zhì)降解為低分子量有機(jī)氮如氨基酸、氨基糖等，從而提高SON 的保留量，降低VSON。而微球菌科參與易分解有機(jī)化合物（如蛋白質(zhì)、多肽和斷鏈碳水化合物等）的降解[25]，促進(jìn)SON的分解轉(zhuǎn)化。

水稻不同生育期土壤中差異性微生物有所不同，導(dǎo)致VSON也有所差異。水稻移栽期耕層土壤中微球菌科富集，其豐度與VSON呈極顯著正相關(guān)（圖8），這一時(shí)期微球菌科的富集主要是由于該科中Pseudarthro?bacter屬（數(shù)據(jù)未顯示）的顯著富集促進(jìn)了SON 的周轉(zhuǎn)。Liu 等[26]的研究發(fā)現(xiàn)Pseudarthrobacter有利于提高土壤?N 的含量，本研究中水稻移栽期不同施肥處理?N 的含量較背景土壤顯著提高了4.25～6.59 mg·kg?1。Pseudarthrobacter原名節(jié)桿菌（Arthro?bacter），其可促進(jìn)有機(jī)氮分解為氨[27]，從而加速SON的轉(zhuǎn)化。冗余分析結(jié)果也表明微球菌科豐度與VSON呈正相關(guān)，且主要作用于水稻生育前期。水稻分蘗期耕層土壤中草酸桿菌科富集，其豐度與VSON呈極顯著負(fù)相關(guān)（圖8），該時(shí)期草酸桿菌科富集主要是由于該科的Massilia屬富集，這與Obermeier 等[28]的研究結(jié)果一致。Massilia被認(rèn)為是農(nóng)業(yè)土壤中幾丁質(zhì)的初級(jí)降解者之一[29]，其可將幾丁質(zhì)分解為低分子量SON（N?乙酰葡糖胺），從而提高土壤SON 的保留量，降低VSON。VSON和差異性細(xì)菌菌群相對(duì)豐度的相關(guān)分析結(jié)果表明，分蘗期VSON還與酸桿菌門中的Solibacterace?ae Subgroup_3科呈極顯著正相關(guān)，這可能是由于水稻分蘗期追施氮肥，導(dǎo)致不同施肥處理土壤pH 較幼苗期顯著減低0.20～0.31 個(gè)單位，酸性土壤環(huán)境有利于酸桿菌門細(xì)菌的代謝活動(dòng)[30]。研究表明酸桿菌門在氮循環(huán)中起重要作用，其可降低土壤中硝酸鹽和亞硝酸鹽含量[31]。水稻分蘗期不同施肥處理硝酸鹽含量較移栽期降低1.91～6.57 mg·kg?1，SON 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物降低，促進(jìn)了SON 的轉(zhuǎn)化。此外，研究表明酸桿菌門與土壤脲酶顯著相關(guān)，其可能是土壤脲酶的重要來源，可促進(jìn)尿素分解，從而加速SON 的轉(zhuǎn)化[32]。水稻分蘗期后，VSON逐漸平穩(wěn)并于水稻成熟期趨于0。水稻成熟期差異性菌群相對(duì)豐度與VSON的相關(guān)性結(jié)果表明，放線菌門與VSON呈極顯著相關(guān)，而與微球菌目無(wú)顯著相關(guān)性，表明水稻成熟期VSON對(duì)放線菌門的響應(yīng)較為敏感，但響應(yīng)敏感的具體科屬還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

（1）水田耕層土壤可溶性有機(jī)氮變化速率受外源有機(jī)物料輸入及水稻生育期的顯著影響，紫云英還田能夠顯著減緩水田耕層土壤可溶性有機(jī)氮的下降速率。

（2）水稻生育期內(nèi)耕層土壤可溶性有機(jī)氮變化速率呈“快速降低?緩慢波動(dòng)?趨于平穩(wěn)”的變化趨勢(shì)，其中以水稻移栽期的可溶性有機(jī)氮變化速率最高。

（3）水稻生育期內(nèi)耕層土壤可溶性有機(jī)氮變化速率與細(xì)菌群落多樣性和豐富度顯著相關(guān)，且對(duì)微生物種群的響應(yīng)因水稻生育期而異。