依托咪酯調(diào)控Sirt1/FOXO1通路對心肌缺血再灌注大鼠模型的保護作用*

陳彰強， 余 丹， 彭曉紅， 李 鵬

武漢市第四醫(yī)院，華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬普愛醫(yī)院麻醉科，武漢 430032

心血管疾病一直是發(fā)病率和死亡率最高的威脅人類健康的主要疾病之一。近年來，由于動脈搭橋術(shù)、溶栓療法和經(jīng)皮冠狀動脈介入治療等的建立和應(yīng)用，缺血性心肌組織可及時恢復(fù)血液供應(yīng)，但是隨后的心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)嚴(yán)重影響患者的康復(fù)率和預(yù)后[1-2]。大量證據(jù)表明，這種傷害在一定程度上是由活性氧(reactive oxygen，ROS)或自由基的過量產(chǎn)生引起的。能量代謝和氧化應(yīng)激在其中發(fā)揮至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用[3]。因此，尋找安全有效的藥物及治療策略減輕MIRI仍是研究的重點。

麻醉藥對心肌的保護作用在各種動物模型中得到了廣泛研究，其機制包括減少ROS，增強內(nèi)源性抗氧化劑和調(diào)節(jié)離子遷移等。依托咪酯(Etomidate，Eto)已在臨床上用于誘導(dǎo)麻醉[4]，并已證明可以防止各種器官的缺血再灌注(ischemia reperfusion，I/R)損傷，如骨骼肌[5]、大腦[6]和下肢[7]。重要的是，臨床研究發(fā)現(xiàn)Eto復(fù)合硬膜外麻醉在老年冠心病患者圍術(shù)期能夠降低術(shù)后肌鈣蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)升高程度，非體外循環(huán)下冠狀動脈搭橋術(shù)患者在麻醉誘導(dǎo)時使用Eto更有利于維持氣管插管期間的血流動力學(xué)穩(wěn)定和氧代謝平衡，對心肌有一定的保護作用[8-9]。動物研究也發(fā)現(xiàn)，其可抑制心肌細(xì)胞凋亡，減少心臟功能障礙和氧化應(yīng)激，減輕大鼠的I/R損傷[10]。但其具體的機制尚不清楚，Eto是通過何種途徑調(diào)控氧化應(yīng)激，進而減輕MIRI，還尚未可知。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silence information regulator 1，Sirt1)是進化最保守的哺乳動物沉默調(diào)節(jié)蛋白，參與多種重要生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)，例如氧化應(yīng)激、能量代謝、細(xì)胞凋亡和自噬[11]。研究發(fā)現(xiàn)激活Sirt1可能是減輕以氧化應(yīng)激為特征的I/R損傷的重要機制[3]。為了進一步說明先前的發(fā)現(xiàn)，本研究以Sirt1為切入點，深入探究Eto治療MIRI的具體作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級健康雄性SD大鼠60只，體重(260～280)g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證為SCXK(京)2019-0009。將動物在受控的環(huán)境條件[環(huán)境溫度(24±2)°C，濕度(55±5)%，光照12 h/黑暗12 h]下飼養(yǎng)，自由飲水和攝食。研究已由機構(gòu)動物護理和使用委員會批準(zhǔn)，并遵循《實驗動物的護理和使用指南》。

1.2 主要試劑及儀器

Eto脂肪乳注射液(福爾利，江蘇恩華藥業(yè)集團有限公司，國藥準(zhǔn)字H20020511，10 mL：20 mg)；EX527(Sirt1特異性抑制劑，美國ApexBio，A4181)；蘇木精-伊紅(HE)染色試劑、RIPA裂解液、BCA試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1法)、Annexin Ⅴ-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(碧云天生物科技公司，批號分別為C0105、P0013B、P0012S、C2006、C1062L)；活性氧(ROS)檢測試劑盒DCFH-DA(CA1410-500)購自北京索萊寶科技有限公司；肌酸激酶同工酶MB(creatine kinase isoenzyme MB，CKMB)(H197)、肌鈣蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)(E019-1-1)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)(微板法，A020-2-2)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)(WST-1法)(A001-3-2)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)(TBA法)(A003-1-2)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)測定試劑盒(比色法)(A005-1-2)均購自南京建成生物工程研究所；兔抗Sirt1(ab189494)、Ac-FOXO1(ab52857)、β-actin(ab8227)、羊抗兔IgG H&L(HRP)(ab205718)購自英國Abcam公司；兔抗Bcl-2(bs-0032R)、Bax(bs-0127M)、Caspase-3(bs-0081R)均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

RWD407型小動物呼吸機(深圳瑞沃德生命科技有限公司)；動物ECG心電圖系統(tǒng)(美國Nasiff Associates公司)；超高分辨率小動物彩色多普勒超聲實時影像系統(tǒng)(Vevo 2100，加拿大VisualSonics公司)；BD FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀、多功能酶標(biāo)儀(iMark680)、蛋白轉(zhuǎn)膜裝置(美國Bio-Rad公司)；倒置熒光顯微鏡(IX73，購自日本Olympus公司)。

1.3 分組、模型制備及給藥

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分為假手術(shù)組(Sham組)、MIRI組、Eto低、高劑量組(L-Eto、H-Eto組，0.5、1 mg/kg)[10]、通路抑制劑組(Eto+EX527組，1 mg/kg Eto+2 mg/kg EX527)[12]，每組12只。除Sham組外，其余大鼠采用手術(shù)結(jié)扎冠狀動脈左前降支的方法復(fù)制大鼠MIRI模型[3，12]：大鼠于術(shù)前禁食不禁水12 h，用戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉后，仰臥位固定，連接肢體心電圖電極和小動物呼吸機，心前區(qū)脫毛備皮，碘伏消毒，沿左側(cè)第3、4肋間切開皮膚，快速開胸，暴露心臟，使用止血鉗將左心耳提起，以0號縫合線在左心耳下方2 mm(冠狀動脈左前降支)活結(jié)結(jié)扎，45 min后打開結(jié)扎線恢復(fù)血流行再灌注2 h。以缺血時心肌局部蒼白或發(fā)紺，心電圖ST段持續(xù)抬高，再灌注時心肌紅潤且ST段下降50%以上為MIRI模型建立成功。Sham組不進行結(jié)扎，其余操作同上；術(shù)中死亡大鼠進行隨機補充。將造模成功大鼠隨機分為MIRI組、L-Eto組、H-Eto組、Eto+EX527組，每組12只。Eto組大鼠于再灌注后2 h即刻尾靜脈注射相應(yīng)劑量的Eto(生理鹽水稀釋)；通路抑制劑組在注射1 mg/kg Eto的同時，腹腔注射2 mg/kg的EX527(DMSO溶解稀釋)；1次/d，持續(xù)28 d；Sham組和MIRI組注射等量生理鹽水。末次給藥2 h后進行取材和指標(biāo)檢測。

1.4 取材及指標(biāo)檢測

1.4.1 心功能檢測 于手術(shù)前和末次給藥2 h后對每組大鼠進行經(jīng)胸超聲心電圖檢查。左心室舒張末期容積(LVEDV)、左心室收縮末期容積(LVESV)、左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)和左心室短軸縮短率(LVFS)用于評估大鼠的心功能。

1.4.2 血清心肌酶檢測 心功能檢測完成后，腹主動脈取血，靜置后以3000 r/min離心15 min，分離血清，按照試劑盒說明書的操作檢測血清中cTnI、CK-MB、LDH水平。

1.4.3 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測 取血后，每組隨機選取6只大鼠，取出完整心臟，于冰上用無菌手術(shù)刀片切分為兩部分，一部分用4%多聚甲醛固定；另一部分按照1∶9的比例加入預(yù)冷的生理鹽水研磨后，離心，取上清液，制備成10%的組織勻漿，生化法檢測勻漿中MDA、SOD、GSH-Px水平。

1.4.4 心肌組織HE染色 取4%多聚甲醛固定的心肌組織，乙醇梯度脫水，石蠟包埋，連續(xù)切4 μm薄片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫苯1 min，蒸餾水沖洗；進行HE染色，觀察心臟組織形態(tài)變化。

1.4.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測心肌細(xì)胞凋亡 每組剩余6只大鼠，取出心臟，切分為兩部分，一部分液氮速凍后，-80℃冰箱保存待測；另一部分心肌組織在充分剪碎后，加入適量的胰酶消化液，37℃混合裂解30 min，70 μm濾網(wǎng)過濾后，1000 r/min，離心10 min，棄去上清，重懸細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液。將100 μL的細(xì)胞懸液加入5 mL流式管中，然后加入Annexin Ⅴ-FITC和PI各5 μL，避光孵育15 min后加入1×結(jié)合緩沖液400 μL，用流式細(xì)胞儀檢測心肌細(xì)胞凋亡情況。

1.4.6 熒光探針測定心肌中ROS水平 取1.4.5項下制備的心肌單細(xì)胞懸液，與ROS探針2，7-二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)在37°C下孵育1 h，然后在1000×g下離心10 min以收集DCFH-DA染色的心肌細(xì)胞。將DCFH-DA染色的心肌細(xì)胞重懸，根據(jù)ROS試劑盒的說明，在最佳激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為488 nm和527 nm的條件下檢測二氯熒光素(DCF)熒光。ROS水平通過檢測DCF的熒光強度來確定。

1.4.7 JC-1法檢測線粒體膜電位(MMP)變化 通過JC-1熒光標(biāo)記檢測心肌細(xì)胞線粒體膜電位的變化。取1.4.5項下制備的心肌單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為106/mL。然后，將細(xì)胞懸浮液與JC-1溶液混合，于培養(yǎng)箱中避光孵育20 min。通過流式細(xì)胞儀測量細(xì)胞的相對熒光強度。最終以實驗組/對照組相對熒光值對MMP進行定量分析。

1.4.8 Western blot檢測心肌組織Sirt1/FOXO1蛋白表達 取-80℃冰箱保存的心肌組織，加入RIPA裂解液研磨后，置于冰上，靜置后離心，提取上清液為總蛋白溶液。用BCA法測量蛋白濃度后取等量蛋白質(zhì)樣品(30 μg/孔)，SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，加入相應(yīng)一抗(Sirt1、Ac-FOXO1、Bcl-2、Bax、Caspase-3按照1∶1000比例進行稀釋)于4℃下孵育過夜，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(1∶5000)室溫孵育1 h，ECL顯色，以β-actin為內(nèi)參，通過與內(nèi)參的灰度比，得出目的條帶的相對表達水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的心臟功能

術(shù)前各組大鼠的LVESV、LVEDV、LVEF、LVFS差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。給藥結(jié)束后，與Sham組相比，MIRI組大鼠的LVESV、LVEDV顯著增大，LVEF、LVFS顯著下降(均P<0.05)；與MIRI組相比，L-Eto組、H-Eto組大鼠的LVESV、LVEDV明顯下降，LVEF、LVFS明顯升高(均P<0.05)；與H-Eto組相比，Eto+EX527組大鼠LVESV、LVEDV明顯增大，LVEF、LVFS明顯下降(均P<0.05)；見表1。

表1 術(shù)前及給藥后各組大鼠的心功能比較Table 1 Comparison of cardiac function of rats in each group before operation and after

2.2 各組大鼠的血清心肌酶水平

與Sham組相比，MIRI組大鼠血清CKMB、cTnI、LDH水平顯著升高(均P<0.05)；與MIRI組相比，L-Eto組、H-Eto組大鼠血清CKMB、cTnI、LDH水平明顯降低(均P<0.05)，與H-Eto組相比，Eto+EX527組大鼠血清中CKMB、cTnI、LDH水平明顯升高(均P<0.05)；見圖1。

1：Sham組；2：MIRI組；3：L-Eto組；4：H-Eto組；5：Eto+EX527組；與Sham組比較，aP<0.05；與MIRI組比較，bP<0.05；與H-Eto組比較，cP<0.05圖1 各組大鼠的血清心肌酶水平Fig.1 Serum myocardial enzyme levels of rats in each group

2.3 各組大鼠心肌組織MDA、SOD、GSH-Px水平

與Sham組相比，MIRI組大鼠心肌MDA水平顯著升高，SOD、GSH-Px水平顯著降低(均P<0.05)；與MIRI組相比，L-Eto組、H-Eto組大鼠心肌MDA水平明顯降低，SOD、GSH-Px水平明顯升高(均P<0.05)，與H-Eto組相比，Eto+EX527組大鼠心肌MDA水平明顯升高，SOD、GSH-Px水平明顯降低(均P<0.05)；見圖2。

1：Sham組；2：MIRI組；3：L-Eto組；4：H-Eto組；5：Eto+EX527組；與Sham組比較，aP<0.05；與MIRI組比較，bP<0.05；與H-Eto組比較，cP<0.05圖2 各組大鼠心肌組織MDA、SOD、GSH-Px水平Fig.2 Myocardial MDA，SOD，GSH-Px levels of rats in each group

2.4 各組大鼠心肌組織病理學(xué)變化

Sham組大鼠的心肌細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，心肌纖維排列整齊，邊界清晰，束狀分布；MIRI組大鼠心肌組織染色疏松，心肌纖維紊亂，局部肌纖維橫紋消失，可見心肌細(xì)胞腫脹、破裂和壞死，大量炎性細(xì)胞浸潤；L-Eto組、H-Eto組大鼠可見輕度細(xì)胞水腫，少量心肌纖維斷裂，少量炎性細(xì)胞浸潤；Eto+EX527組大鼠心肌組織損傷較Eto高劑量組有加重趨勢；見圖3。

A：Sham組；B：MIRI組；C：L-Eto組；D：H-Eto組；E：Eto+EX527組圖3 大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)改變(蘇木精-伊紅染色，×200)Fig.3 Morphological changes of rat myocardial tissue(HE staining，×200)

2.5 各組大鼠的心肌細(xì)胞凋亡率及ROS水平

與Sham組[(6.80±1.21)%、(1.00±0.00)]相比，MIRI組大鼠缺血心肌細(xì)胞的凋亡率(32.65±2.08)%、ROS水平(3.58±0.37)顯著升高(均P<0.05)；與MIRI組相比，L-Eto組、H-Eto組大鼠心肌細(xì)胞的凋亡率[(25.02±1.49)%、(17.51±1.34)%]、ROS水平[(2.49±0.22)、(1.78±0.19)]明顯降低(均P<0.05)，與H-Eto組相比，Eto+EX527組大鼠心肌細(xì)胞的凋亡率(26.93±1.87)%、ROS水平(2.66±0.25)明顯升高(均P<0.05)；見圖4。

A：Sham組；B：MIRI組；C：L-Eto組；D：H-Eto組；E：Eto+EX527組圖4 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡(流式細(xì)胞術(shù))和ROS水平(DCFH-DA染色，×200)Fig.4 Cardiomyocyte apoptosis(flow cytometry)and ROS level(DCFH-DA staining,×200)of rats in each group

2.6 各組大鼠心肌細(xì)胞MMP的變化

與Sham組(1.00±0.00)相比，MIRI組大鼠心肌細(xì)胞MMP(0.45±0.05)顯著降低(P<0.05)；與MIRI組相比，L-Eto組、H-Eto組大鼠心肌細(xì)胞MMP[(0.63±0.07)、(0.82±0.08)]明顯升高(均P<0.05)，與H-Eto組相比，Eto+EX527組大鼠心肌細(xì)胞MMP(0.61±0.06)明顯降低(P<0.05)。

2.7 各組大鼠心肌Sirt1/FOXO1通路相關(guān)蛋白的表達

與Sham組相比，MIRI組大鼠心肌組織Sirt1、Bcl-2的表達顯著降低，Ac-FOXO1、Bax、Caspase-3的表達顯著升高(均P<0.05)；與MIRI組相比，L-Eto組、H-Eto組大鼠心肌組織Sirt1、Bcl-2的表達明顯升高，Ac-FOXO1、Bax、Caspase-3的表達明顯降低(均P<0.05)，與H-Eto組相比，Eto+EX527組大鼠Sirt1、Bcl-2的表達明顯降低，Ac-FOXO1、Bax、Caspase-3的表達明顯升高(均P<0.05)；見圖5。

圖5 各組大鼠心肌Sirt1/FOXO1通路相關(guān)蛋白的表達Fig.5 The expression of proteins related to the Sirt1/FOXO1 pathway in myocardium of rats in each group

3 討論

MIRI是臨床實踐中常見的病理過程。當(dāng)心肌缺血時，由于氧氣供應(yīng)不足，能量代謝發(fā)生障礙，使機體代謝產(chǎn)物不能被及時清除，在體內(nèi)大量堆積產(chǎn)生毒性作用，使心肌發(fā)生病變，導(dǎo)致心泵功能減退；同時心肌缺血后會激活氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生大量的ROS，生成和釋放大量炎性因子(如TNF-α、IL-6)，促進MIRI的發(fā)生、發(fā)展[13]。因此，抑制氧化應(yīng)激在改善MIRI中起著至關(guān)重要的作用。

Eto是一種非巴比妥酸鹽靜脈麻醉劑，當(dāng)患有心血管疾病的患者接受手術(shù)麻醉時，Eto具有更好的保護作用[14]。使用常規(guī)臨床劑量時，心血管疾病患者和正?；颊咧g的心率、平均動脈壓、平均肺動脈壓、中心靜脈壓、心搏量、肺血管阻力和外周血管阻力等幾乎沒有區(qū)別。據(jù)報道，Eto可以通過增強內(nèi)源性抗氧化劑的活性，降低氧化應(yīng)激和維持組織中離子平衡遷移來抑制I/R損傷。如在脛骨開放性骨折手術(shù)中，術(shù)中使用Eto維持鎮(zhèn)靜可有效升高患者血清SOD水平，降低I/R損傷后ROS和炎性因子的釋放，并可以降低術(shù)后麻醉并發(fā)癥的發(fā)生率[15]。動物研究也發(fā)現(xiàn)，Eto在大鼠MIRI中的保護作用與減輕氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)有關(guān)[10]。在本研究中發(fā)現(xiàn)給予Eto治療后，MIRI大鼠超聲心電圖指標(biāo)得以恢復(fù)，這是減少MIRI的標(biāo)志。此外，已經(jīng)證明血清心肌損傷生物標(biāo)志物(如cTnI、LDH和CK-MB)水平升高是手術(shù)后不良反應(yīng)的獨立危險因素；ROS、SOD、MDA和GSH-Px的水平反映了氧化應(yīng)激的水平[16]。Eto治療改善了心臟病理損傷，降低了心臟標(biāo)記酶以及氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的水平，說明Eto可抑制氧化應(yīng)激，改善MIRI；與以往的研究結(jié)果一致，這些結(jié)果支持Eto可用于治療MIRI。

線粒體是能量供應(yīng)的重要細(xì)胞器，與能量代謝有著最直接的聯(lián)系，在整個I/R的過程中，線粒體功能障礙，是I/R損傷所致心臟功能障礙的重要因素之一[17]。由于對能量的高需求，心肌組織高度富含線粒體。近年來，線粒體在MIRI中的不可替代的作用已逐漸被發(fā)現(xiàn)，線粒體是ROS的主要來源，通常細(xì)胞抗氧化劑系統(tǒng)可有效去除ROS；但是在MIRI期間，心肌可用氧不足，ATP的產(chǎn)生不足，可導(dǎo)致線粒體產(chǎn)生的ROS壓倒了抗氧化劑的能力，導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷、Ca2+穩(wěn)態(tài)破壞、線粒體膜去極化，導(dǎo)致細(xì)胞色素C的釋放和細(xì)胞凋亡引起細(xì)胞死亡[18-19]。在本研究中，我們通過流式細(xì)胞術(shù)和熒光探針檢測了心肌細(xì)胞的凋亡和ROS的產(chǎn)生，結(jié)果顯示MIRI大鼠缺血心肌細(xì)胞的凋亡率和ROS水平顯著升高；JC-1探針(一種用于檢測線粒體電位變化的敏感熒光染料)評估MMP顯示線粒體出現(xiàn)損傷。而Eto可降低ROS水平和心肌細(xì)胞凋亡率，增加MMP；Western blot結(jié)果進一步顯示Eto可上調(diào)Bcl-2的表達，下調(diào)Bax、Caspase-3的表達；提示Eto可改善線粒體功能障礙，抑制細(xì)胞凋亡。

Sirt1是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴性脫乙?；?，屬于Sirtuins家族，參與多種重要生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)，如氧化應(yīng)激、能量代謝、細(xì)胞凋亡[11]。Sirt1不僅可以影響線粒體的活性，抑制ROS的生成，還可以影響抗氧化防御系統(tǒng)[20]。Sirt1/FOXO1途徑是重要的信號傳導(dǎo)途徑，被認(rèn)為參與調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡[21]。FOXO1是心血管系統(tǒng)中重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與底物代謝和細(xì)胞增殖。大量證據(jù)表明FOXO1是心臟代謝調(diào)節(jié)和維持心臟功能的重要因素，Sirt1通過脫乙?；饔谜{(diào)節(jié)下游蛋白FOXO1的表達，從而控制幾種對氧化應(yīng)激有響應(yīng)的蛋白的表達[22]。研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)Sirt1的表達，可增加FOXO1的表達，促進ROS的產(chǎn)生，從而增加氧化應(yīng)激和心肌細(xì)胞凋亡[23]；激活心肌組織和H9c2細(xì)胞中的Sirt1/FOXO1信號通路可抑制細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷，改善MIRI[24]。本研究結(jié)果顯示，MIRI后大鼠Sirt1的表達下降，Ac-FOXO1的表達升高，Eto治療后可上調(diào)Sirt1的表達，抑制Ac-FOXO1的表達，且給予Sirt1的抑制劑EX527可明顯逆轉(zhuǎn)Eto的抗氧化活性和心肌保護作用，提示Eto可能通過激活Sirt1，下調(diào)乙酰化FOXO1的表達，抑制氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，減輕MIRI。

綜上所述，Eto對MIRI的保護作用可能與激活Sirt1，下調(diào)乙?；疐OXO1的表達，進而改善線粒體功能障礙，抑制氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡有關(guān)。此外，本研究尚存在一定的局限性，Eto通常被用作麻醉誘導(dǎo)劑，麻醉誘導(dǎo)起效快，失效也快，每天1次Eto治療會導(dǎo)致血藥濃度有限，因此給藥劑量和給藥時間問題以及Eto是否還能通過其他途徑發(fā)揮抗氧化作用，均有待進一步研究。且在使用胰蛋白酶消化制備心肌組織單細(xì)胞混懸液時，可能對細(xì)胞造成一定的損傷，使流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡產(chǎn)生一定誤差，后續(xù)考慮采用TUNEL或免疫組化檢測凋亡蛋白表達。