可溶性環(huán)氧化物水解酶抑制劑TPPU促進(jìn)低灌注腦白質(zhì)損傷后髓鞘再生的相關(guān)機(jī)制*

陳余雪， 劉幸華， 劉 璐

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院 1風(fēng)濕免疫科 2創(chuàng)傷外科 3藥學(xué)部，武漢 430030

目前，認(rèn)知功能障礙相關(guān)疾病已成為繼心臟疾病及腫瘤后，影響人類健康的第三大殺手，給人類生活及社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)[1]。慢性低灌注引起的缺血性腦白質(zhì)損傷(white matter lesions，WMLs)可造成一定的認(rèn)知功能損害及其它一些神經(jīng)功能缺損，約占人類缺血性腦卒中的1/4[2]。由其導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙相關(guān)性疾病已經(jīng)成為我國嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一，給患者、家庭以及社會(huì)造成沉重的負(fù)擔(dān)。

尋找對中樞神經(jīng)系統(tǒng)微環(huán)境中多種細(xì)胞成分具有保護(hù)作用的方法，從整體上促進(jìn)微環(huán)境結(jié)構(gòu)和信號重塑是潛在的發(fā)展方向。表氧化二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acids，EETs)具有舒張血管、神經(jīng)保護(hù)、抗炎、抗凋亡、抗氧化應(yīng)激、抗血小板聚集、促進(jìn)細(xì)胞增殖和血管新生等多種生物學(xué)功能[3]。而對于EETs在慢性低灌注引起的缺血性腦白質(zhì)損傷中的作用及機(jī)制，尚未見相關(guān)報(bào)道。EETs在生物體內(nèi)極不穩(wěn)定，易被可溶性環(huán)氧化物水解酶(soluble epoxide hydrolase，sEH)降解為低活性的二氫二十碳三烯酸(dihydroxyeicosatrienoic acids，DHETs)。TPPU作為新一代sEH抑制劑，具有更好的穩(wěn)定性及生物學(xué)特性，并可通過血腦屏障，抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)中sEH的表達(dá)，從而使體內(nèi)EETs表達(dá)量增加，發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能[4]。本研究通過建立C57BL/6J小鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈狹窄模型(bilateral common carotid artery stenosis，BCAS)，模擬臨床上以高血壓、腦血管病變引起的低灌注腦白質(zhì)損傷，研究TPPU促進(jìn)小鼠白質(zhì)低灌注損傷后髓鞘再生的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑 DMSO(武漢谷歌科技有限公司)，TPPU(美國加利福利亞大學(xué)免費(fèi)提供)，小鼠抗GFAP多克隆抗體(美國Sigma公司)，F(xiàn)ITC標(biāo)記的驢抗小鼠IgG(美國Jackson ImmunoResearch公司)，兔抗Iba1單克隆抗體(日本W(wǎng)ako公司)，F(xiàn)ITC標(biāo)記的驢抗兔IgG(美國Jackson ImmunoResearch公司)，BCA蛋白定量試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，RIPA強(qiáng)裂解液(上海碧云天生物技術(shù)研究所)，小鼠抗β-actin單克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，蛋白酶抑制劑cocktail(瑞士Roche公司)，兔抗ERK1/2多克隆抗體、兔抗磷酸化-ERK1/2多克隆抗體、兔抗p38 MAPK多克隆抗體、兔抗磷酸化-p38 MAPK多克隆抗體、小鼠抗JNK多克隆抗體、兔抗磷酸化-JNK多克隆抗體(美國Cell Signaling公司)，IRDye 800-羊抗兔IgG、IRDye 800-羊抗大鼠、Alexa Fluor700-羊抗小鼠IgG、Alexa Fluor700-驢抗羊IgG(美國LI-COR Biosciences公司)，LFB染液(武漢谷歌科技有限公司)。

1.1.2 主要設(shè)備 手術(shù)顯微鏡(1-FR型，德國Zeiss公司)，恒溫冰凍切片機(jī)(CM1900型，德國LEICA公司)、Microcoil(日本薩密你彈簧有限公司)，激光共聚焦熒光顯微鏡(LSM1200型，日本Olympus公司)，普通熒光顯微鏡(BX51型，日本Olympus公司)，Odyssey IR成像儀(美國LI-COR Biosciences公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型建立及分組 8～12周齡雄性C57BL/6J小鼠(體重為22～28 g)稱重后經(jīng)鼻罩吸入2%異氟烷誘導(dǎo)麻醉，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，并用0.18 mm內(nèi)徑微彈簧夾套雙側(cè)頸總動(dòng)脈。實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組(只分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈)、vehicle組(BCAS手術(shù)+1%DMSO)、TPPU干預(yù)組(BCAS手術(shù)+TPPU 0.3 mg/kg體重)。造模后第1天至處死前1 d，每日相同時(shí)間點(diǎn)根據(jù)小鼠體重進(jìn)行腹腔內(nèi)藥物注射。分別于術(shù)后3 d、2周、4周、8周等時(shí)間點(diǎn)每組各取4～6只小鼠用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)共計(jì)87只小鼠。

1.2.2 激光多普勒監(jiān)測小鼠BCAS的血流動(dòng)力學(xué)改變 小鼠頭部備皮，消毒，手術(shù)剪縱行剪開頭皮，分離皮下結(jié)締組織，充分暴露頂骨及前囟，以前囟后1 mm、旁開2.5 mm處為監(jiān)測點(diǎn)，將激光多普勒的探頭連接光纖，將光纖尖端對準(zhǔn)標(biāo)記點(diǎn)，垂直插入1～2 mm，根據(jù)血流值調(diào)整位置，保證基線血流平穩(wěn)且大于800 PU后，迅速完成小鼠BCAS操作，術(shù)中術(shù)后連續(xù)監(jiān)測1 h，觀察白質(zhì)區(qū)域腦血流變化。

1.2.3 激光散斑襯比成像監(jiān)測小鼠BCAS的血流動(dòng)力學(xué)改變 雄性C57BL/6J小鼠稱重后鼻罩吸入2%異氟烷誘導(dǎo)麻醉，將小鼠頭顱顱骨磨薄至硬腦膜，使用激光散斑襯比成像系統(tǒng)觀察BCAS術(shù)前及術(shù)后腦血流10 min，血流平穩(wěn)后記錄血流及影像數(shù)據(jù)5 min，觀察雙側(cè)頸總動(dòng)脈狹窄后血流變化情況。

1.2.4 免疫熒光染色 在術(shù)后3 d、2周、4周及8周用10%水合氯醛腹腔注射深度麻醉小鼠，利用提前預(yù)冷的4%多聚甲醛慢慢灌注后迅速斷頭取腦，取腦后行沉糖處理。將小鼠腦組織用OCT膠包裹，在冰凍切片機(jī)內(nèi)進(jìn)行冠狀面連續(xù)切片，厚度為12 μm。本部分所用一抗為：Iba1(日本W(wǎng)ako公司，1∶200)；GFAP(美國Sigma公司，1∶200)。對應(yīng)二抗為：Cy3-羊抗兔IgG(美國Jackson ImmunoResearch公司，1∶200)；FITC-羊抗小鼠IgG(美國Jackson ImmunoResearch公司，1∶200)。對每張腦片的胼胝體區(qū)域進(jìn)行隨機(jī)拍照，根據(jù)需要調(diào)整放大倍數(shù)，每張腦片至少采集5張照片，每只小鼠至少選擇4張腦片，每組至少4只小鼠。每次均在相同參數(shù)條件下觀察及采集圖像。

1.2.5 LFB染色 從-80℃冰箱將切片取出，梯度降至室溫后用乙醇梯度脫水。再將切片放入預(yù)熱的LFB染液，放入60℃的烤箱孵育8～10 h；切片取出后待其自然冷卻至室溫，流水沖洗5 min后置于75%乙醇中；在0.05%Li2CO3中分色10 s后再置于75%乙醇中，用顯微鏡觀察著色和分色情況，可見灰質(zhì)部分顏色變淡，若分色程度不夠可再次重復(fù)上述步驟；分別用75%、95%及100%的乙醇梯度脫水，通風(fēng)櫥內(nèi)晾干，置于二甲苯中透明5 min；通風(fēng)櫥內(nèi)晾干后用中性樹膠封片。

1.2.6 Western blot檢測 在術(shù)后4周用10%水合氯醛腹腔注射深度麻醉小鼠，將預(yù)熱的30 mL生理鹽水從左心室快速灌注后迅速斷頭取腦，隨后分離腦白質(zhì)，稱重后放入玻璃勻漿器中，根據(jù)組織重量加入適量的RIPA裂解液(含1%PMSF和cocktail蛋白酶抑制劑)，進(jìn)行碾磨后置于冰上裂解。利用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測定，根據(jù)實(shí)際測得的各蛋白濃度，加入適量的RIPA裂解液，最后將所有蛋白濃度均調(diào)整為20 μg/μL。上樣時(shí)按每孔40 μg總蛋白量吸取待測蛋白進(jìn)行電泳及蛋白轉(zhuǎn)移。隨后利用Odyssey IR成像儀掃描，以目的蛋白A值/β-actin蛋白A值反映目的蛋白的相對表達(dá)量。本部分所用一抗及其稀釋比例：β-actin、ERK1/2(1∶1000)，磷酸化ERK1/2(1∶1000)，p38 MAPK(1∶1000)，磷酸化p38 MAPK(1∶1000)，JNK(1∶500)，磷酸化JNK(1∶500)。對應(yīng)二抗為：Alexa Fluor700-驢抗羊IgG(1∶5000)，Alexa Fluor700-羊抗小鼠IgG(1∶5000)，IRDye 800-羊抗大鼠IgG(1∶5000)，IRDye 800-羊抗兔IgG(1∶5000)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

激光散斑襯比成像圖像數(shù)據(jù)利用MAT LAB軟件進(jìn)行處理及分析。統(tǒng)計(jì)處理應(yīng)用PrismPad 6軟件包，所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)及獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BCAS模型的成功構(gòu)建

采用BCAS手術(shù)制備小鼠低灌注性白質(zhì)損傷模型，利用激光多普勒及激光散斑襯比成像技術(shù)監(jiān)測小鼠BCAS手術(shù)過程中腦白質(zhì)區(qū)域血流變化情況。結(jié)果顯示，激光多普勒監(jiān)測BCAS術(shù)中小鼠白質(zhì)區(qū)域血流值下降至術(shù)前水平的50%左右，連續(xù)監(jiān)測未見血流發(fā)生明顯變化(圖1A、1B)。激光散斑襯比成像技術(shù)連續(xù)監(jiān)測BCAS造模前后小鼠腦血流，小鼠血流明顯下降至術(shù)前50%左右，與激光多普勒結(jié)果相一致(圖1C、1D)，判定BCAS小鼠模型構(gòu)建成功。觀察術(shù)后小鼠一般生命體征平穩(wěn)，無視力缺損，無神經(jīng)系統(tǒng)功能缺損體征，均可正?；顒?dòng)，可納入后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

A：激光多普勒監(jiān)測BCAS術(shù)中血流變化示意圖；B：激光多普勒監(jiān)測BCAS術(shù)中血流變化統(tǒng)計(jì)圖；C：BCAS術(shù)中激光散斑襯比成像技術(shù)監(jiān)測腦血流示意圖；D：BCAS術(shù)中激光散斑襯比成像技術(shù)監(jiān)測血流變化統(tǒng)計(jì)圖；n=6；與術(shù)前比較，**P<0.01圖1 成功構(gòu)建小鼠BCAS模型Fig.1 Successful establishment of a mouse model of BCAS

2.2 TPPU改善低灌注損傷后脫髓鞘情況

利用LFB染色觀察TPPU治療4周后白質(zhì)損傷及脫髓鞘情況。LFB染色顯示，與vehicle組相比，TPPU治療組小鼠在胼胝體中央?yún)^(qū)(middle part of corpus callosum，CCm)、新紋狀體(caudoputamen，CPu)和前聯(lián)合(anterior commissure，AC)區(qū)染色較深，髓鞘排列規(guī)則，空泡形成和髓鞘脫失情況都減少(圖2)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

與sham組小鼠相比，vehicle組小鼠在胼胝體中央?yún)^(qū)(CCm)、新紋狀體區(qū)(CPu)和前聯(lián)合區(qū)(AC)LFB染色異常，顏色變淺，存在明顯的髓鞘稀疏、空泡形成和排列紊亂；TPPU治療組髓鞘結(jié)構(gòu)相對完整，空泡減少，髓鞘厚度增厚；標(biāo)尺=50 μm圖2 BCAS術(shù)后不同白質(zhì)區(qū)域LFB髓鞘染色情況Fig.2 LFB staining in different white matter areas after BCAS injury

表1 BCAS術(shù)后不同白質(zhì)區(qū)域LFB髓鞘染色結(jié)果比較Table 1 LFB staining in different white matter areas

2.3 TPPU抑制低灌注損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞活化

利用免疫熒光技術(shù)檢測小鼠BCAS術(shù)后3 d、2周、4周及8周胼胝體中央部星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化。如圖3所示，自BCAS術(shù)后第3天起，模型動(dòng)物胼胝體區(qū)域星形膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)活化增殖，胞體肥大、突起增多，細(xì)胞數(shù)目增多，低灌注后第4周時(shí)達(dá)到高峰，第8周表達(dá)量有所下調(diào)，但仍較sham組明顯增多，其差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。給予TPPU干預(yù)治療后可發(fā)現(xiàn)各時(shí)間點(diǎn)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化明顯減少，在第2、4、8周差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

A：免疫熒光檢測低灌注白質(zhì)損傷后各組不同時(shí)間點(diǎn)GFAP表達(dá)變化代表圖，標(biāo)尺=50 μm；B：免疫熒光檢測低灌注白質(zhì)損傷后不同時(shí)間點(diǎn)各組GFAP表達(dá)變化統(tǒng)計(jì)圖；與sham組比較，**P<0.01；與vehicle組比較，#P<0.05；n=5圖3 TPPU抑制低灌注損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞活化Fig.3 TPPU inhibits astrocytes activation after hypoperfusion injury

2.4 TPPU可抑制白質(zhì)低灌注損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞活化

小膠質(zhì)細(xì)胞的活化在缺血性腦卒中的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。

Iba1作為小膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，胼胝體區(qū)域小膠質(zhì)細(xì)胞自低灌注損傷后第3天即發(fā)生明顯的活化增多，胞體肥厚，于第2周達(dá)到高峰，之后有所減少，但仍明顯高于sham組。給予TPPU干預(yù)治療后可發(fā)現(xiàn)各時(shí)間點(diǎn)小膠質(zhì)細(xì)胞活化明顯減少，在第2、4、8周差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05，圖4)。

A：免疫熒光檢測低灌注白質(zhì)損傷后各組不同時(shí)間點(diǎn)Iba1表達(dá)變化代表圖，標(biāo)尺=50 μm；B：免疫熒光檢測低灌注白質(zhì)損傷后不同時(shí)間點(diǎn)各組Iba1表達(dá)變化統(tǒng)計(jì)圖；與sham組比較，*P<0.05 **P<0.01；與vehicle組比較，#P<0.05 ##P<0.01；n=5圖4 TPPU抑制低灌注損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞活化Fig.4 TPPU inhibits the activation of microglia after hypoperfusion injury

2.5 TPPU通過MAPK信號通路發(fā)揮對低灌注損傷白質(zhì)的保護(hù)作用

由圖5可見，低灌注損傷后4周，vehicle組磷酸化的ERK1/2及磷酸化的p38 MAPK水平較sham組明顯增高(均P<0.05)，而總ERK1/2、總p38 MAPK、總JNK及磷酸化的JNK水平均無明顯差異(均P>0.05)；給予TPPU治療后，可明顯降低磷酸化的ERK1/2及磷酸化的p38 MAPK的表達(dá)水平(均P<0.05)。說明TPPU可能通過MAPK信號通路參與保護(hù)低灌注所造成的白質(zhì)損傷。

A：Western blot檢測低灌注白質(zhì)損傷后4周各組小鼠MAPK信號通路表達(dá)變化代表圖；B：Western blot檢測低灌注白質(zhì)損傷后4周各組小鼠MAPK信號通路表達(dá)變化統(tǒng)計(jì)圖；與sham組比較，*P<0.05；與vehicle組比較，#P<0.05；n=5圖5 TPPU通過MAPK信號通路發(fā)揮對低灌注損傷白質(zhì)的保護(hù)作用Fig.5 TPPU protects white matter damage caused by hypoperfusion through MAPK signaling pathway

3 討論

缺血性腦白質(zhì)病變發(fā)病率逐年升高，與認(rèn)知功能障礙密切相關(guān)，但其具體機(jī)制不明，臨床上亦缺乏良好的早期診斷和治療手段。目前關(guān)于腦損傷及認(rèn)知功能障礙的研究主要集中于單一細(xì)胞的功能及相關(guān)病理改變，以改善循環(huán)、營養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞為主要治療方法，仍未發(fā)現(xiàn)治療腦白質(zhì)損傷及認(rèn)知功能障礙的有效手段。WMLs致認(rèn)知損害的具體機(jī)制仍不明確，并且不同于大血管病變。WMLs相關(guān)認(rèn)知功能障礙起病隱匿、病程較長、難以徹底治愈、缺乏特異性的早期診斷及治療手段，因此，亟須深入研究WMLs及相關(guān)認(rèn)知功能障礙的發(fā)病機(jī)制，為WMLs相關(guān)認(rèn)知功能障礙的早期診斷和針對性干預(yù)提供參考。

EETs具有舒張血管、神經(jīng)保護(hù)、抗炎、抗凋亡、抗氧化應(yīng)激、抗血小板聚集、促進(jìn)細(xì)胞增殖和血管新生等多種生物學(xué)功能[3]。其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中也發(fā)揮重要作用，EETs可促進(jìn)缺血組織內(nèi)血管的舒張，允許更多的血液流入缺血區(qū)域。另外，可通過調(diào)節(jié)分水嶺區(qū)域血流及血流逆行通過閉塞的血管網(wǎng)絡(luò)來改善缺血區(qū)域的血流情況。而且再灌注后可通過貯存腦血流量來防止缺血后血管調(diào)節(jié)障礙所導(dǎo)致的二次損傷。有研究表明，sEH抑制劑可通過調(diào)控腦血流量來發(fā)揮其在局灶性缺血性腦卒中的保護(hù)作用[5]。同時(shí)，增加EETs的表達(dá)可在血管內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)揮明顯的抑炎作用，降低白細(xì)胞粘附蛋白V-CAM和I-CAM的表達(dá)，減少環(huán)氧合酶COX-2相關(guān)炎癥反應(yīng)[6]。但EETs在生物體內(nèi)極不穩(wěn)定，易被sEH降解為DHETs，因而限制了EETs的外源性使用。而因?yàn)閟EH為EETs代謝過程中的關(guān)鍵酶，給予sEH抑制劑TPPU將成功放大EETs功能，sEH抑制劑有望成為未來治療缺血性腦損傷的重要藥物之一。

本研究發(fā)現(xiàn)，可溶性環(huán)氧化物水解酶抑制劑TPPU干預(yù)后可有效減輕腦白質(zhì)損傷的情況，改善髓鞘結(jié)構(gòu)完整性，抑制低灌注性白質(zhì)損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞活化，促進(jìn)白質(zhì)連接完整性的恢復(fù)及髓鞘再生，最終促進(jìn)認(rèn)知功能的恢復(fù)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)MAPK信號通路參與調(diào)控TPPU治療小鼠低灌注性白質(zhì)損傷，為進(jìn)一步理解缺血性腦白質(zhì)病變的病理機(jī)制，開發(fā)新的治療藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

EETs信號系統(tǒng)在低灌注性白質(zhì)損傷中發(fā)揮抑炎及促進(jìn)髓鞘功能恢復(fù)作用，但其中涉及的信號通路和機(jī)制尚不清楚。有研究發(fā)現(xiàn)，EETs信號系統(tǒng)與cAMP/PKA、PI3K-Akt及MAPK信號通路密切相關(guān)[7]。同時(shí)，有研究表明，MAPK信號通路所涉及的ERK1/2、p38 MAPK和JNK參與調(diào)節(jié)少突膠質(zhì)細(xì)胞的分化及髓鞘再生[8-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，低灌注白質(zhì)損傷后，小鼠胼胝體區(qū)域磷酸化的ERK1/2及p38 MAPK均出現(xiàn)上調(diào)，而總的ERK1/2、p38 MAPK及JNK、磷酸化的JNK均未發(fā)生明顯變化。給予sEH抑制劑TPPU進(jìn)行干預(yù)后，可以逆轉(zhuǎn)磷酸化的ERK1/2及p38 MAPK的變化。從以上結(jié)果中，我們推測，sEH抑制劑TPPU可能通過ERK1/2及p38 MAPK信號通路發(fā)揮其在低灌注白質(zhì)損傷中的保護(hù)作用。ERK1/2及p38 MAPK信號通路在其中具體的作用還需要進(jìn)行更深入的研究，這將對白質(zhì)損傷的治療提供新的臨床思路及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究通過藥源性TPPU抑制可溶性環(huán)氧化物水解酶sEH的活性，增加組織中EETs的表達(dá)量，從而發(fā)揮其在低灌注白質(zhì)損傷后的神經(jīng)保護(hù)作用，其中所涉及的信號通路包括ERK1/2及p38 MAPK等。通過sEH抑制劑TPPU可有效改善白質(zhì)連接完整性，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，最終促進(jìn)低灌注白質(zhì)損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)。盡管其相關(guān)下游的作用靶點(diǎn)及機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究，但本研究結(jié)果已表明sEH抑制劑有望成為未來脫髓鞘相關(guān)疾病新的治療靶點(diǎn)。