重樓屬植物分子生物學研究進展

楊青淑，王 婧，江 媛, 楊 燕，嚴靖婷，段寶忠*

1.大理大學藥學院，云南 大理 671000

2.云南省科學技術院，云南 昆明 650228

重樓屬ParisL.為廣義百合科植物，是重要的藥用類群，有2000 多年的藥用歷史。全世界重樓屬植物有29 種，主要分布于歐亞大陸溫帶和熱帶地區(qū)。歷版《中國藥典》收載七葉一枝花P.polyphyllaSmith var.chinensis(Franch.) Hara.及滇重樓P.polyphyllaSmith var.yannanensis(Franch.) Hand.-Mazz.作為重樓藥用。重樓具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚之功效[1]，是云南白藥、宮血寧膠囊、季德勝蛇藥片等著名成藥的主要原料。由于重樓藥材市場需求巨大，但其藥用部位生長周期長，自然繁殖效率低，加之無序采挖和過量應用，致使該屬多個物種瀕臨滅絕，已被列為禁止出口物種，其資源的稀缺，已成為制約相關醫(yī)藥工業(yè)可持續(xù)發(fā)展的瓶頸。近年來，隨著分子生物學技術的不斷發(fā)展，出現(xiàn)了許多新的研究熱點，重樓屬植物的分子生物學研究是目前的熱點之一。國內外學者采用分子生物學技術對重樓屬植物開展了相關研究，在遺傳多樣性、系統(tǒng)分類、功能基因等方面取得了諸多成果，為重樓屬植物的鑒別、種群遺傳多樣性、親緣關系、植物生長發(fā)育和代謝調控機制等相關研究，提供了新的思路和參考。目前已有學者對其遺傳多樣性進行了研究[2]，但有關其功能基因、分子鑒定、系統(tǒng)進化等研究領域尚缺乏系統(tǒng)的總結，限制了對重樓屬植物的進一步開發(fā)和應用。鑒于此，從分子標記、分子鑒定、轉錄組學、蛋白質組學、功能基因等方面，對重樓屬相關分子生物學研究成果進行了綜述，并就當前存在的問題進行探討，以期為該屬植物資源的保護和可持續(xù)利用提供科學參考。

1 分子標記

1.1 遺傳多樣性和親緣關系分析

遺傳多樣性研究對揭示重樓屬物種的進化、種質資源利用和生物學保護策略的制定具有重要意義。近年來，國內外學者利用簡單重復序列（simple sequence repeat，SSR）、分子標記技術（inter-simple sequence repeat，ISSR）、EST-SSR（expressed sequence tag-simple sequence repeats）、擴增的限制性內切酶片段長度多態(tài)性（ amplified fragment length polymorphism，ALFP）、特異引物PCR 標記隨機擴增多態(tài)性 DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）等分子標記方法，對重樓屬植物的遺傳多樣性開展了深入研究[3-10]?；诜肿訕擞浀倪z傳多樣性統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，重樓屬植物多態(tài)位點百分率（percentage of polymorphic loci，PPL）達79.1%～100%，表明遺傳多樣性豐富，尤其是對華重樓、黑籽重樓和滇重樓的研究較為深入。利用SCoT（start codon pargeted polymorphism）對重樓屬多個物種的研究表明，不同物種間遺傳多樣性水平為七葉一枝花＞寬葉重樓＞具柄重樓＞狹葉重樓＞寬瓣重樓＞北重樓[11]。此外，多位學者基于多種分子標記對重樓的親緣關系進行了研究，如基于CDDP（conserved dna-derived polymorphism）分子標記的非加權組平均法（unweighted pair group method arithmetic averages，UPGMA）分析表明[12]，滇重樓與長藥隔重樓之間的遺傳距離較遠，分別聚到了不同的組，這與ISSR[13-14]和限制性位點擴增多態(tài)性（restriction site amplification polymorphism，RSAP）[15]的研究結果一致；而黑籽重樓、無瓣黑籽重樓單獨聚為一組，七葉一枝花、狹葉重樓聚為一組的結果，與SCoT 標記的分析結果不一致，即黑籽重樓與七葉一枝花聚為一組，狹葉重樓單獨聚為一組[16]。兩者結論不同，可能與所用的群體種源以及來源不同有關，其親緣關系有待進一步研究證，實相關信息見表1。

表1 重樓屬植物遺傳多樣性參數Table 1 Genetic diversity parameters of plants from genus Paris

1.2 種質資源和種群研究

優(yōu)良的種質是重樓屬植物資源保護和開發(fā)利用的重要保證。在物種間水平的研究上，唐榮華等[17]利用RAPD 對川滇地區(qū)的野生重樓11 個種群進行研究，結果12 個引物產生86 個RAPD 標記，其中82 個具有多態(tài)性，11 個物種的多態(tài)性高于85.2%；李壯等[16]及程虎印等[11]分別對的重樓屬植物遺傳多樣性進行研究，發(fā)現(xiàn)四川和陜西的重樓屬植物多態(tài)性高于80.56%和88.82%，上述研究表明重樓屬物種水平上的多樣性較高，且與起源地區(qū)相關。在物種內種群水平上，研究表明七葉一枝花[18]和黑籽重樓[19]種群內和種群間的遺傳多樣性變異大體相當；滇重樓和多葉重樓居群內的遺傳多樣性不足，但居群間具有較高的遺傳多樣性[13-14]，推測生境片段化所帶來的遺傳漂變，以及地理隔離造成生態(tài)地理環(huán)境的差異，可能是各居群間出現(xiàn)較高遺傳分化的主要原因之一[14]。然而，與之相反，亦有多項研究發(fā)現(xiàn)黑籽重樓、多葉重樓的變種滇重樓和七葉一枝花等重樓屬植物的種群間，其居群內遺傳分化偏高，大于居群間分化[5,10,20]，如滇重樓只有30.85%的分子變異存在于居群間，而有69.15%的變異存在于居群內[10]；在七葉一枝花中有37.26%的分子變異存在于居群間，62.74%的變異存在于居群內[10]；在黑籽重樓中有22.86%的遺傳變異存在于居群間，77.14%的遺傳變異存在于居群內[20]。這一現(xiàn)象可能由于重樓屬植物特殊的繁育方式有關，其能自交結實的特性增加了居群間的分化[20-21]，同時人為因素是導致重樓資源匱乏和居群破壞、分布零星的直接原因之一[5]。上述分析表明，重樓屬植物種群，特別是滇重樓和華重樓種群仍處于“瀕?！鄙持?，重樓屬核心種質資源的建立和保存仍有待加強。

2 分子鑒定

2.1 基于多重聚合酶鏈反應（PCR）法的分子鑒定

PCR 擴增指紋圖譜技術直接用通用引物對基因組進行PCR 擴增，通過擴增條帶指紋的差異進行鑒定。它具有不需要已知DNA 序列信息，信息位點多等特征[22]。Duan 等[23]利用高分辨溶解曲線法（high resolution melting，HRM），成功開發(fā)了重樓法定基原植物及其混偽品的有效鑒定方法，鑒定準確率為100%。研究者通過分析滇重樓、華重樓與其同屬近緣種的ITS序列差異，設計特異性引物，開發(fā)了基于PCR技術，準確鑒定《中國藥典》法定基原物種及其混偽品[24-25]。上述方法無需進行測序，實現(xiàn)了重樓及其混偽品的有效、快速鑒定。

2.2 DNA 條形碼鑒定

近年來，多位學者對重樓屬植物的DNA 條形碼研究進行了探討，主要涉及matK、psbA-trnH、ITS2、rpoB、rpoC1、rbcL等序列。劉濤等[26]采用psbA-trnH序列對12 個重樓品種進行分析，發(fā)現(xiàn)該序列可區(qū)分滇重樓及其同屬物種。Ji 等[27]利用ITS、psbA-trnH和trnL-trnF等序列單獨或聯(lián)合對重樓屬進行系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)重樓為一個屬而不是3 個屬的分類（DaiswaRafinesque、KinugasaTatewaki & Suto 和ParisLinnaeus）。姜黎等[28]應用matk、trnL-trnF、rpoC1和ITS序列，鑒別重樓不同近緣品種以及常見偽品，結果表明ITS 序列作為DNA 條形碼候選序列，ITS＋trnL-trnF 組合序列作為其補充序列，可以有效鑒別重樓藥材不同近緣種以及藥材混偽品。研究還發(fā)現(xiàn)，ITS 與其他序列相比，其在重樓屬物種中的鑒定效率更高[29-31]。此外，有學者認為ITS2序列能夠準確鑒定重樓屬藥用植物，可以作為潛在的藥用植物通用條形碼序列[32-33]，基于ITS2 序列構建NJ 樹能有效區(qū)分重樓屬藥用植物[34]。方海蘭等[35]采用ITS 序列對重樓種子種苗的鑒定進行了研究，發(fā)現(xiàn)其可有效鑒別正品重樓及其混偽品的種子種苗。葉方等[36]采用ITS2 序列對重樓屬植物進行種內分子鑒定，發(fā)現(xiàn)該屬植物在NJ（neighborjoining）樹中能被明顯區(qū)分開，并建議將狹葉重樓作為七葉一枝花的變型處理。過立農等[37]采用NJ 樹、ITS 和ITS2 2 個序列相結合的方法，發(fā)現(xiàn)其可有效將60 批重樓樣品鑒別為寬瓣重樓、毛重樓、七葉一枝花、花葉重樓、獨龍重樓、五指蓮重樓、西藏延齡草、平伐重樓、華重樓和南重樓。該研究為重樓屬藥材的鑒別開辟了一條新途徑。

3 系統(tǒng)進化與譜系地理學

3.1 基于全葉綠體基因組的系統(tǒng)進化

隨著分子生物學和基因測序技術的發(fā)展，葉綠體基因組越來越受到廣大科研人員的青睞?；谌~綠體基因組的豐富數據，分類學家對不同分類階元的系統(tǒng)發(fā)育關系進行了重建，為重樓屬植物的系統(tǒng)發(fā)育問題提供了新的證據。Do 等[38]首次測序并拼接北重樓的全葉綠體基因組。Huang 等[39]對11 個重樓屬物種的葉綠體全基因組進行了測序拼接，并結合北重樓進行分析，發(fā)現(xiàn)所研究樣本的cemA基因均為假基因，且除四葉重樓和北重樓外，其余重樓的葉綠體基因組的結構十分保守。Gao 等[40]對花葉重樓和祿勸花葉重樓進行重新測序和拼接，并對它們的基因組結構特征進行了描述。楊麗芳[41]對33 種重樓屬植物的全葉綠體基因組和核糖體DNA 序列進行測序，發(fā)現(xiàn)重樓屬植物的葉綠體基因組高度保守，均為一個閉合環(huán)狀DNA 分子，且rDNA 序列和全葉綠體基因組構建的系統(tǒng)樹結果有明顯沖突。李曉娟等[42]對華重樓及百合目植物全葉綠體基因組進行了比較，獲得華重樓全葉綠體基因環(huán)結構，發(fā)現(xiàn)編碼序列中的終止密碼子可以區(qū)分華重樓和北重樓，同時華重樓的cemA基因是假基因，推測cemA結構及假基因化現(xiàn)象對重樓屬植物的進化與系統(tǒng)發(fā)育具有重要意義。

3.2 基于DNA 條形碼的系統(tǒng)進化

ITS 是被子植物中應用較廣的一種分子標記方法，除用于物種鑒定外，已成功應用于重樓屬植物的系統(tǒng)進化研究。翁周[43]對多葉重樓ITS 序列進行比對和聚類分析，發(fā)現(xiàn)多葉重樓的ITS 序列比較保守，11個多葉重樓樣本明顯分為3 支，發(fā)現(xiàn)小重樓與其他變種的關系較遠，滇重樓和原變種的關系較近，而與其他變種的關系相對較遠。唐榮華等[44]比較15 種重樓植物和Trillium tschonoskiiMaxim.的ITS 序列，認為重樓屬可劃為ParisLinnaeus、KinugasaTatewaki & Suto 和DaiswaRafinesque 3 個獨立的屬。而唐銘霞[45]對重樓屬植物21 個種及變種ITS 區(qū)序列以及trnL-F基因間區(qū)分析，支持把重樓屬歸為1 個屬ParisLinnaeus。上述研究為重樓屬植物的分子鑒定提供了重要的理論基礎。

3.3 譜系地理學研究

李恒[46-47]對重樓屬的細胞學和地理分布格局進行研究，認為重樓屬植物存在2 種基本核型：熱帶核型和溫帶核型，其起源于上新世（或更早）的亞洲大陸滇、黔、桂地域。其中，云貴高原至四川邛崍山區(qū)為該屬的多樣化中心。Ji 等[27]根據該類群原始種類（北重樓亞屬ParisAubgen.）的分布情況及高等植物的核型演化規(guī)律，推測重樓屬起源于中新世前期東亞的日本、朝鮮半島和我國東北、華北附近的地域，由低緯度地區(qū)逐漸擴散進入中國的亞熱帶地區(qū)。該研究起源地居群分化為北重樓亞屬.的祖先，擴散到中國亞熱帶地區(qū)的居群分化為蚤休亞屬EuthyraAubgen.的祖先，因云貴高原和橫斷山地區(qū)復雜多變的地理環(huán)境和氣候條件，形成該屬的多樣化中心。Huang 等[39]基于重樓屬11 個種構建的系統(tǒng)發(fā)育樹表明，蚤休屬DaiswaRaf.中分布于華東、華中、華南和中南半島地區(qū)與分布于中國西南和喜馬拉雅地區(qū)的重樓屬植物形成了2 個獨立的譜系，認為該分布格局的獨特性可能與這2 個譜系間經歷了長期的隔離分化有關。此外，楊麗芳[41]認為由于環(huán)太平洋的造山運動（漸新世/中新世界線附近）、亞洲夏季風加強（晚中新世以來）、青藏高原隆升（晚中新世到早上新世）、冰期/間冰期循環(huán)（更新世）等氣候和地質變化，創(chuàng)造了高度隔離和多樣性的生境，促進了重樓屬植物的譜系多樣性形成。

4 功能基因組學研究

4.1 轉錄組學研究

轉錄組學可揭示基因表達與一些生命現(xiàn)象之間的內在聯(lián)系，為深入了解重樓屬植物發(fā)育和進化具有重要意義。多位學者采用高通量測序技術，對滇重樓進行分析，發(fā)現(xiàn)了多個參與甾體皂苷生物合成、激素信號、種子休眠等有關的基因[48-50]。南京農業(yè)大學張成才等[51]采用轉錄組測序方法研究華重樓種子的休眠解除機制，發(fā)現(xiàn)赤霉素處理是解除華重樓休眠的必要條件。隨著對miRNA 在調控植物生長發(fā)育中的作用的認識不斷深入，楊金龍[52]和Ling 等[49]對滇重樓的種子和種皮中的miRNA 文庫進行了測序，首次提供了已知的miRNA 圖譜及其靶點，這對進一步研究滇重樓種子休眠的分子機制和重樓屬植物相關基因的功能研究提供了重要科學依據。

4.2 蛋白組學研究

蛋白質組學的概念最早由Marc Wilkins 在1994年提出，標志著生命科學進入后基因時代[53]。目前有關重樓屬植物的蛋白組學研究，主要集中在基因表達調控成分代謝領域。Liu 等[54-55]采用非標記定量蛋白質組學方法，對3 種重樓屬植物根部的蛋白質組進行分析，發(fā)現(xiàn)419 個差異表達蛋白質主要分布在代謝、細胞和單個有機體3 類過程，且不同重樓屬植物皂苷含量高低與蛋白質的差異表達密切相關。上述研究為重樓生長培育的人工干預、相關藥效成分的提高，以及物種的基因改良奠定了重要的理論基礎。

4.3 基因克隆與功能研究

4.3.1 次生代謝產物相關基因 重樓屬植物的主要有效成分為甾體皂苷，其通過甲羥戊酸途徑合成，該途徑涉及3-羥基-3-甲基戊二酰單酰輔酶A（3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA，HMG-CoA）、甲羥戊酸（mevalonic acid，MVA）和異戊烯基焦磷酸（isopentenyl pyrophosphate，IPP）等，相關基因見表2。研究發(fā)現(xiàn)HMGR-CoA 還原酶、鯊烯環(huán)氧酶（squalene epoxidase，SE）、鯊烯合酶（squalene synthase，SQS）、法尼基焦磷酸合酶（farnesylpyrophosphate synthase，F(xiàn)PS）是甲羥戊酸途徑的主要關鍵酶。徐永艷等[56]對重樓屬植物不同組織的HMGR基因的表達差異進行研究，結果表明其在根中的表達量最高，與劉軍等[57]的結果一致。為進一步研究重樓皂苷合成機制，多位學者以滇重樓為材料，分別克隆獲得SE、FPS 和SQS 基因，還發(fā)現(xiàn)重組SQS 蛋白可在大腸桿菌中表達[58-61]。這些研究為探討滇重樓皂苷的合成生物學研究提供了科學依，對用基因工程手段來調節(jié)重樓屬植物皂苷代謝途徑中關鍵酶的表達，具有重要的意義及應用價據值。此外，眾多學者以滇重樓、多葉重樓為材料，成功分離克隆獲得了多個調控重樓皂苷生物合成的基因，包括甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶（mevalonate pyrophosphate decarboxylase，MPD）、環(huán)阿屯醇合酶（cycloartenol synthase，CAS）、固醇-C24-甲基轉移酶（sterol-C24-methyl transferase，SMT）等[58-64]，為研究重樓屬植物皂苷合成的作用機制和表達調控奠定基礎。

表2 重樓屬植物功能基因克隆情況Table 2 Cloning of functional genes in genus Paris

除上述相關功能基因研究外，在重樓屬有效成分甾體皂苷生物合成途徑中，糖基轉移酶及細胞色素P450 酶、異戊烯焦磷酸異構酶和鯊烯合成酶基因也被發(fā)掘克隆。董栩成功克隆出滇重樓植物的糖基轉移酶基因及細胞色素P450 基因的全長序列，發(fā)現(xiàn)在不同組織中基因表達量有差異。江雪梅等[65-66]采用RT-PCR 方法擴增了功能基因IPPI、SS 的部分序列，并分析它們在根、莖、葉3 個組織中的表達差異，也發(fā)現(xiàn)在不同組織部位中基因的表達模式不同，這些研究為探討今后甾體皂苷合成的機制提供科學參考。

4.3.2 參與休眠解除和菌根互作相關的基因 赤霉素（gibberellin，GA）是一種促進生長的植物激素，可以調節(jié)種子發(fā)育，促進種子萌發(fā)，與植物種子休眠關系密切。滇重樓中赤霉素合成代謝途徑的關鍵酶GA 氧化酶基因（GAox）已被成功克隆出來，GAox基因在滇重樓的不同器官中的表達，以及其種子的不同萌發(fā)階段具有很明顯的差異[67-69]，且NCED、CYP707A、ABI2、GA20ox2、GA20ox3基因參與滇重樓種子休眠解除過程，是滇重樓種子休眠過程的重要基因。此外，陳瑤等[70]應用高通量轉錄組測序技術，分析了華重樓種子萌發(fā)前后激素信號轉導途徑和合成通路中的差異表達基因，發(fā)現(xiàn)GA 和IAA 組合能促進種子萌發(fā)，其調控機制可能與GA、IAA 合成代謝和信號轉導相關。為探究重樓屬植物的種子共生萌發(fā)分子機制，張華等[71]研究了接種不同外源性從枝菌根（arbuscular mycorrhizae，AM）真菌對滇重樓幼苗基因表達的影響，結合AM 真菌對種子萌發(fā)及幼苗化學成分的相關研究，推測薄壁兩性囊霉和崔氏原囊霉菌株，可望作為培育滇重樓菌根化苗的理想菌株。上述基因的相關研究為滇重樓可持續(xù)利用提供了重要參考，然而，這些基因的功能遠未闡明，有待進一步深入。

4.3.3 其他基因 在滇重樓的生長發(fā)育中，溶性無機焦磷酸酶（soluble inorganic pyrophosphatase，sPPase）基因可調控其休眠和萌發(fā)、光能利用等途徑。趙爽等[72]從滇重樓中克隆到PpsPPase基因，初步實現(xiàn)了PpsPPase在原核細胞中的表達，可為進一步研究PpsPPase在滇重樓生長發(fā)育過程中的功能提供信息和依據。

5 結語與展望

隨著分子生物學技術的不斷發(fā)展，新一代高通量測序技術的開發(fā)，有力地推動了重樓屬植物的分子生物學研究。然而，由于重樓屬樹種自身特性和地理分布，加上其分子生物學研究團隊力量薄弱，資金投入不足等原因，分子生物技術在重樓屬植物中的應用仍存在諸多難點。目前在重樓屬植物中，已開發(fā)多種分子標記，用于其遺傳多樣性及遺傳指紋圖譜研究；同時基于DNA 分子片段的物種鑒別、分類及系統(tǒng)進化研究也取得了一些進展，但該屬植物的分類學和系統(tǒng)學依然存在爭議。此外，利用轉錄組學、蛋白組學和基因克隆技術對重樓屬植物的功能基因研究也取得了一定進展，目前雖已克隆獲得多個相關功能基因，但主要集中在滇重樓的次生代謝產物重樓皂苷合成、菌根互作和休眠解除相關基因方面，對重樓屬其他物種的相關功能基因研究還知之甚少，且對環(huán)境脅迫的品質形成機制等仍存在一定局限性。當前眾多學者雖然克隆獲得了多個重樓屬植物生物合成相關基因，但是，圍繞這些基因開展的基因調控工作卻很少，其生物合成途徑中還有很多未解之謎，有待進一步深入發(fā)掘，為相關優(yōu)良種質培育和資源的合理利用奠定基礎；同時，由于重樓屬植物擁有目前科學界已知的最大基因組，是研究基因組大小變化的理想模型，破譯重樓屬植物基因組對研究基因組大小進化以及重樓皂苷生物合成通路具有重要意義。今后對重樓屬植物的研究中，應充分整合基因組學、轉錄組學、蛋白組學、代謝組學等多組學的技術手段，加快對重樓屬植物功能基因的探索，為重樓屬植物的進一步開發(fā)和利用提供理論依據。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突