一測多評法同時測定尖葉假龍膽中龍膽苦苷、芒果苷、當(dāng)藥醇苷、木犀草素、去甲基雛菊葉龍膽酮及雛菊葉龍膽酮

張 闖，陳世雨，周偉偉，劉興超,2,3，楊洪霞，徐耿瑞，李愛英,2,3*

1.河北中醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 050200

2.河北省心腦血管病中醫(yī)藥防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050091

3.河北省高校中藥組方制劑應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心，河北 石家莊 050091

龍膽科假龍膽屬植物尖葉假龍膽Gentianella acuta(Michx.) Hulten 為一年生草本植物，廣泛分布于我國東北、華北、西北各省，據(jù)《內(nèi)蒙古植物藥志》記載：“尖葉假龍膽全草入藥，味苦、性涼，有清熱、解毒之功效，可用于治療黃疸型肝炎、發(fā)燒、頭痛等”[1-5]，而鄂倫春族牧民將其煎煮后口服，用來治療心律失常、冠心病、心絞痛等心血管疾病，療效顯著[6-8]。尖葉假龍膽中成分復(fù)雜[9-10]，包括酮類、黃酮類、環(huán)烯醚萜類、木脂素類、甾體類等[2]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，尖葉假龍膽藥材及其提取液具有抑制心肌纖維化、改善心功能[11-13]、抗腫瘤[14-15]、護(hù)肝[16]、抗炎[17]、抗氧化[18]、改善胰島素抵抗[19-20]等作用。因此，通過對尖葉假龍膽藥材及其提取液中化合物成分進(jìn)行定性與定量研究，建立尖葉假龍膽質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)具有重要意義。

高效液相色譜法是現(xiàn)代中藥研究中的重要方法，能夠?qū)χ兴幹兴煞诌M(jìn)行定性與定量檢測[21]。尖葉假龍膽中多數(shù)對照品價格相對較高，為了節(jié)約檢測成本，探索多指標(biāo)質(zhì)量控制模式。本課題組采用一測多評（quantitative analysis of multi-components by single marker，QAMS）的方法，同時測定尖葉假龍膽中6 種成分[22]的含量，以雛菊葉龍膽酮為內(nèi)參物，計(jì)算其與龍膽苦苷、芒果苷、當(dāng)藥醇苷、木犀草素和去甲基雛菊葉龍膽酮的相對校正因子，通過校正因子計(jì)算出其他成分的含量，以期為尖葉假龍膽的多成分質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695 高效液相色譜儀（美國沃特世科技有限公司），Ultimate 3000 雙三元液相色譜儀（美國賽默飛世爾科技有限公司），SPD-M20A 高效液相色譜儀（日本島津公司），UV-9000 紫外分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司），ME204E/02 型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司），Milli-Q 超純水機(jī)（美國密理博公司）。

1.2 試劑

對照品龍膽苦苷（批號6480907-2）、芒果苷（批號12759-74-8）、當(dāng)藥醇苷（批號136656-07-0）、木犀草素（批號4773-96-0）、去甲基雛菊葉龍膽酮（批號113558-15-9）、雛菊葉龍膽酮（批號41059-79-4），均購于南京元寶峰醫(yī)藥科技有限公司，各對照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%，可供含量測定用。乙腈（色譜純，F(xiàn)isher 公司），超純水為實(shí)驗(yàn)室自制。

1.3 藥材

藥材樣品于2014年至2019年每年采集1 次，共6 批（S1～S6），經(jīng)河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院鄭玉光教授鑒定為龍膽科假龍膽屬植物尖葉假龍膽Gentianella acuta(Michx.) Hulten。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 對照品溶液的制備 取各對照品適量分別加甲醇配制成含龍膽苦苷0.37 mg/mL，芒果苷0.36 mg/mL，當(dāng)藥醇苷0.44 mg/mL，木犀草素0.33 mg/mL，去甲基雛菊葉龍膽酮0.29 mg/mL，雛菊葉龍膽酮0.31 mg/mL 的對照品溶液，同時分別取等體積對照品配制6 種對照品的混合溶液，即混合對照品搖勻，4 ℃冷藏備用。

2.1.2 供試品溶液的制備 稱取尖葉假龍膽粉末（過3 號篩）約0.5 g，精密加入甲醇50 mL，回流提取30 min，放冷，用提取溶劑補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻。濾過，濾液過0.22 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.2 色譜條件

Waters XBridge C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%冰醋酸（B），梯度洗脫（0～4 min，5%～16% A；4～7 min，16%～30% A；7～9 min，30%～45% A；9～17 min，45%～90% A；17～38 min，90%～100% A；38～45 min，100% A）；柱溫35 ℃；體積流量0.5 mL/min；檢測波長254 nm，進(jìn)樣體積10 μL，混合對照品和供試品溶液HPLC 色譜圖，見圖1。

圖1 尖葉假龍膽混合對照品 (A) 和尖葉假龍膽樣品 (B)的HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC of mixed reference substances (A) and samples (B) of G.acuta

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 線性范圍考察 將“2.1.1”項(xiàng)下制備的對照品溶液分別稀釋至對照品溶液濃度的1、1/2、1/4、1/8、1/16 倍，按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制各對照品的回歸方程，結(jié)果見表1。

表1 尖葉假龍膽中6 種成分的線性關(guān)系考察結(jié)果Table 1 Linear relationship of six detected components of G.acuta

2.3.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下制備的混合對照品溶液，按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算得到龍膽苦苷、芒果苷、當(dāng)藥醇苷、木犀草素、去甲基雛菊葉龍膽酮、雛菊葉龍膽酮的峰面積RSD 分別為1.13%、0.87%、1.74%、2.53%、1.44%、1.69%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下制備的尖葉假龍膽供試品溶液，分別于溶液配好后0、2、4、6、8、12、24、48 h，按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣測定。結(jié)果龍膽苦苷、芒果苷、當(dāng)藥醇苷、木犀草素、去甲基雛菊葉龍膽酮、雛菊葉龍膽酮的峰面積RSD 分別為1.26%、1.72%、1.38%、1.58%、0.69%、0.97%，表明供試品溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批尖葉假龍膽的粉末6份，按 “2.1.2”項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算尖葉假龍膽中龍膽苦苷、芒果苷、當(dāng)藥醇苷、木犀草素、去甲基雛菊葉龍膽酮、雛菊葉龍膽酮的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)，計(jì)算其RSD 分別為0.81%、1.06%、1.42%、1.28%、1.49%、0.93%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 取尖葉假龍膽藥材粉末約0.25 g，精密稱定，平行6 份，分別加入與尖葉假龍膽藥材粉末各成分相等含量的對照品溶液，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示龍膽苦苷、芒果苷、當(dāng)藥醇苷、木犀草素、去甲基雛菊葉龍膽酮、雛菊葉龍膽酮的加樣回收率分別為99.91%、100.43%、99.95%、100.56%、99.86%、100.05%，RSD 分別為1.04%、1.51%、1.85%、2.28%、0.53%、1.48%，表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.4 相對校正因子（fs/i）的建立

本實(shí)驗(yàn)采用多點(diǎn)矯正法。根據(jù)fs/i＝fs/fi＝As×Ci/(Ai×Cs)計(jì)算QAMS 的fs/i，式中fs/i為內(nèi)標(biāo)物對待測組分i的校正因子，As為內(nèi)標(biāo)物峰面積，Cs為內(nèi)標(biāo)物濃度，Ai為待測組分i峰面積，Ci為待測組分i濃度。以雛菊葉龍膽酮為內(nèi)參物，根據(jù)公式分別計(jì)算雛菊葉龍膽酮對龍膽苦苷（A）、芒果苷（B）、當(dāng)藥醇苷（C）、木犀草素（D）和去甲基雛菊葉龍膽酮（E）的fs/i，結(jié)果見表2。

表2 各組分的fs/i 測定結(jié)果Table 2 fs/i values of each component

2.5 fs/i 耐用性評價

2.5.1 不同高效液相色譜儀和色譜柱對fs/i的影響 分別考察了 Waters e2695、Ultimate 3000 和SPD-M20A 3 種液相色譜儀和Waters XBridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent ZORBAX Extend-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）2 種色譜柱對fs/i的影響，結(jié)果顯示各成分在不同高效液相色譜儀和不同色譜柱上的fs/i的RSD 分別為1.52%、0.58%、2.02%、0.69%、1.75%，均小于3%，見表3，說明不同高效液相色譜儀和不同色譜柱對各成分的fs/i無明顯影響。

表3 不同儀器與色譜柱對各成分fs/i 的影響Table 3 Effect of different instruments and columns on fs/i of each component

2.5.2 不同進(jìn)樣體積對fs/i的影響 分別精密吸取不同體積（1、2、4、8、10、15、20 μL）的混合對照品溶液，依次注入高效液相色譜儀中進(jìn)行檢測，記錄1～6 號色譜峰峰面積，考察不同進(jìn)樣體積對fs/i的影響。結(jié)果表明，進(jìn)樣體積的改變對尖葉假龍膽各成分fs/i無明顯影響，各成分fs/i的RSD 均小于3%，結(jié)果見表4。

表4 不同進(jìn)樣體積對各組分fs/i 的影響Table 4 Effect of different injection volumes on fs/i of each component

2.5.3 不同色譜柱柱溫對fs/i的影響 精密吸取等量“2.1.1”項(xiàng)下制備的尖葉假龍膽混合對照品溶液5 份，采用Waters e2695 高效液相色譜儀，Waters XBridge C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），分別使用不同柱溫（25、30、35、40、45 ℃）對混合對照品溶液進(jìn)行檢測，記錄龍膽苦苷、芒果苷、當(dāng)藥醇苷、木犀草素、去甲基雛菊葉龍膽酮、雛菊葉龍膽酮的峰面積，考察不同柱溫對fs/i的影響。結(jié)果表明，柱溫的改變對尖葉假龍膽各個成分fs/i無明顯影響，各成分fs/i的RSD 均小于2%，結(jié)果見表5。

表5 不同柱溫對各組分fs/i 的影響Table 5 Effect of different column temperatures on fs/i of each component

2.5.4 不同流動相體積流量對fs/i的影響 精密吸取等量混合對照品溶液5 份，分別注入高效液相色譜儀中，使用不同流動相體積流量（0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL/min）進(jìn)行檢測，記錄龍膽苦苷、芒果苷、當(dāng)藥醇苷、木犀草素、去甲基雛菊葉龍膽酮、雛菊葉龍膽酮的峰面積，考察不同流動相體積流量對fs/i的影響。結(jié)果表明，流動相體積流量的改變對尖葉假龍膽各成分fs/i無明顯影響，各成分fs/i的RSD 均小于2%，結(jié)果見表6。

表6 不同流動相體積流量對各組分fs/i 的影響Table 6 Effect of different flow rates on fs/i of each component

2.5.5 檢測波長的微小改變對fs/i的影響 精密吸取等量“2.1.1”項(xiàng)下制備的尖葉假龍膽混合對照品溶液3 份，分別注入高效液相色譜儀中，分別在252、254、256 nm 波長下檢測，記錄龍膽苦苷、芒果苷、當(dāng)藥醇苷、木犀草素、去甲基雛菊葉龍膽酮、雛菊葉龍膽酮的峰面積，考察不同波長對fs/i的影響。結(jié)果表明，檢測波長的微小改變對尖葉假龍膽各成分fs/i無明顯影響，各成分fs/i的RSD均小于1%，結(jié)果見表7。

表7 不同檢測波長對各組分fs/i的影響Table 7 Effect of different detection wavelengths on fs/i of each component

2.6 待測成分的色譜峰定位

通過計(jì)算在不同色譜儀和不同色譜柱中，尖葉假龍膽各組分的色譜峰與雛菊葉龍膽酮色譜峰的相對保留時間（ts/i），對各待測組分進(jìn)行定位，結(jié)果見表8。結(jié)果顯示，不同儀器與色譜柱測得的ts/i的RSD分別為1.06%、0.76%、0.62%、1.08%、0.94%，均小于2%，表明可以以ts/i對尖葉假龍膽中各組分的色譜峰進(jìn)行定位。

表8 不同儀器與色譜柱測得各成分ts/iTable 8 Relative retention time of different instruments and columns

2.7 QAMS 與外標(biāo)法測定結(jié)果的比較

取6 批不同采集時間的尖葉假龍膽藥材粉末制成供試品溶液，精密吸取10 μL 注入液相色譜儀進(jìn)行測定。分別采用QAMS 和外標(biāo)法計(jì)算6 批尖葉假龍膽中龍膽苦苷、芒果苷、當(dāng)藥醇苷、木犀草素、去甲基雛菊葉龍膽酮、雛菊葉龍膽酮的含量，每批3 份，結(jié)果見表9。將QAMS 法與外標(biāo)法測得的各組分含量進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)2 種方法測得的6 種組分含量基本一致，RSD 小于3%，說明該QAMS 法可以替代外標(biāo)法用于尖葉假龍膽藥材的含量測定。

表9 QAMS 法與外標(biāo)法測定6 批尖葉假龍膽中6 種成分含量Table 9 Content of six components in six batches of G.acuta by QAMS and ESM

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法考察

本實(shí)驗(yàn)前期考察了尖葉假龍膽提取條件和高效液相色譜條件，應(yīng)用超聲與回流2 種提取方法，在不同提取溶劑（甲醇、乙醇、水、醋酸乙酯），不同提取時間下（20、30、40、60、90 min）進(jìn)行嘗試，最終確定以甲醇溶液回流提取30 min 為最佳提取方法。應(yīng)用此法方法提取尖葉假龍膽6 種成分效果最好。

3.2 不同年份采集的尖葉假龍膽中6 種成分的比較

HPLC 檢測方法采用紫外檢測器，在254 nm 檢測波長下，以乙腈-0.1%冰醋酸水溶液為流動相，梯度洗脫。本實(shí)驗(yàn)考察了最近6年收集的尖葉假龍膽中6 種組分含量差異。結(jié)果表明，最近6年的尖葉假龍膽藥材中6 種組分含量沒有明顯變化，說明尖葉假龍膽可長期放置。

為了建立較為全面地對尖葉假龍膽質(zhì)量評價方法，本實(shí)驗(yàn)選擇尖葉假龍膽中含量較高的3 類化合物：酮類化合物、黃酮類化合物和環(huán)烯醚萜化合物作為質(zhì)量評價指標(biāo)，其中酮類化合物選擇當(dāng)藥醇苷、芒果苷、龍膽山酮酚和雛菊葉龍膽酮為研究對象，黃酮類化合物選擇木犀草素為研究對象，環(huán)烯醚萜類化合物選擇龍膽苦苷為研究對象。本實(shí)驗(yàn)建立了QAMS 法結(jié)合HPLC-UV 技術(shù)，同時測定尖葉假龍膽藥材提取液中酮、黃酮和環(huán)烯醚萜3 類共6 種組分的含量方法，以尖葉假龍膽中含量較高且性質(zhì)穩(wěn)定的雛菊葉龍膽酮為內(nèi)標(biāo)物，根據(jù)內(nèi)標(biāo)物的含量結(jié)合各組分之間的fs/i計(jì)算尖葉假龍膽中其他5 種組分的含量。結(jié)果顯示，該QAMS 法與外標(biāo)法測得的各組分含量基本一致，所測結(jié)果具有較高的可信度和較好的可行性，為尖葉假龍膽質(zhì)量控制提供了較為全面的理論參考，也為尖葉假龍膽的多指標(biāo)質(zhì)量控制模式提供了新方法。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突