飼料中三種聚醚類藥物殘留檢測(cè)的改進(jìn)方法

杜 楊，杜 磊，孟 佳

（1.安陽市畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)檢驗(yàn)中心，河南 安陽 455000；2.安陽工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，河南 安陽 455000）

聚醚類抗生素（Polyether antibiotics，PEs）是20世紀(jì)70年代左右開始投放市場(chǎng)的、具有離子載體性質(zhì)的一類抗生素。比較常見的聚醚類藥物包括鹽霉素（Salinomycin，SAL）、莫能菌素（Monensin，MON）、拉沙菌素（Lasalocid，LAS）、那拉菌素（Narasin，NAR）、山度霉素（Semduramicin，SEM）、馬杜霉素（Maduramicin，MAD）等。這類抗生素普遍具有促進(jìn)離子穿過細(xì)胞膜的能力，對(duì)雞常見的球蟲病具有較好的防治效果。此外，其在雞的飼料報(bào)酬及增重方面的效果優(yōu)于傳統(tǒng)抗球蟲藥氨丙啉和氯羥吡啶，因此被廣泛用于養(yǎng)雞業(yè)[1]。但由于其具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，添加過量會(huì)造成藥物殘留，因此用藥的安全范圍非常窄[2]。肉制品的藥物殘留能夠通過食物鏈嚴(yán)重影響人類健康[1]。因此，聚醚類藥物殘留量的檢測(cè)技術(shù)研究，對(duì)保障畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全有著十分重要的意義。原農(nóng)業(yè)部《關(guān)于發(fā)布<藥物飼料添加劑品種目錄及使用規(guī)范>的公告》中規(guī)定了甲基鹽霉素、鹽霉素及莫能菌素可以作為藥物飼料添加劑使用，同時(shí)也規(guī)定了其使用方法和添加量。

聚醚類抗生素的殘留分析方法主要包括微生物檢測(cè)法、分光光度法、色譜法（薄層層析法、高效液相色譜、液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法）及免疫學(xué)方法[3]。本文參照《原農(nóng)業(yè)部1862號(hào)公告-4-2012 飼料中5種聚醚類藥物的測(cè)定 液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法》[4]，給出了一種更為合理省時(shí)的改進(jìn)方法，在保證檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠的前提下，把前處理操作過程化繁為簡(jiǎn)，既縮短了前處理的時(shí)間，又減小了前處理過程中可能產(chǎn)生的系統(tǒng)誤差，給飼料中鹽霉素、甲基鹽霉素及莫能菌素3種聚醚類藥物殘留的檢測(cè)檢驗(yàn)工作效率帶來了極大提升。

1 材料與方法

1.1 耗材與試劑

試驗(yàn)中所用水為GB/T 6682中規(guī)定的一級(jí)水，所用試劑均為分析純，乙腈、甲酸、甲醇均為色譜純；正己烷；乙醚；二氯甲烷；乙醚一正己烷（50∶50）：乙醚、正己烷按體積比1∶1混勻；二氯甲烷一甲醇（90∶10）：二氯甲烷、甲醇按體積比9 ∶1 混勻；甲基鹽霉素（Narasin，NAR）≥97%，鹽霉素（Salinomycin，SAL）≥98%，莫能菌素(Monensin，MON)≥90%；硅膠固相萃取柱，500 mg/3 ml。

1.2 儀器及設(shè)備

液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜儀：配有電噴霧電離源；組織勻漿機(jī)；渦動(dòng)儀；氮吹儀；離心機(jī)；天平：感量0.01 g；分析天平：感量0.000 01 g；振蕩器；固相萃取裝置；0.2 μm有機(jī)濾膜；移液器：100 μl、1 000 μl。

1.3 儀器條件

1.3.1 色譜 色譜柱：C18（1.7 μm，2.1*100 mm），或其他效果等同的C18柱；進(jìn)樣量：10.0 μl；流速：0.3 ml/min；柱溫：25±5℃；流動(dòng)相：0.1%甲酸/甲醇溶液。洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.3.2 質(zhì)譜 離子源：ESI；掃描方式：ES+；電離電壓：3.9 kV；源溫度：150℃；霧化溫度：500℃；錐孔氣流速：150 L/h；霧化氣流速：7.00 bar；溶劑氣流速：1 000 L/h；碰撞氣流速：0.17 ml/min。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 儲(chǔ)備液及工作液配制 步驟1：分別稱取3種標(biāo)準(zhǔn)品約10 mg于10 ml容量瓶中，甲醇定容，得到1 000 μg/ml3種標(biāo)準(zhǔn)溶液（-20℃，12個(gè)月）。步驟2：分別取步驟1標(biāo)準(zhǔn)溶液各1 ml于100 ml容量瓶中，甲醇定容，得到10 μg/ml混合標(biāo)準(zhǔn)液（-20℃，6個(gè)月）。步驟3：分別取步驟2混合標(biāo)準(zhǔn)液各1 ml于200 ml容量瓶中，用乙腈（0.1%甲酸）定容，得到50 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)中間液。步驟4：分別取步驟3標(biāo)準(zhǔn)中間液各1 ml于10 ml量瓶中，用乙腈（0.1%甲酸）定容，得到5 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4.2 陽性對(duì)照制備 取1 000 ng/ml中間液（把步驟2配置溶液稀釋10倍得到1 000 ng/ml中間液）100 μl加入空白樣品中，即得添加濃度為50 ng/g的陽性對(duì)照。

1.4.3 提取 稱取試樣2 g（±0.01 g）于50 ml離心管中，加20 ml乙腈，渦旋震蕩提取約30 min，離心5 min，轉(zhuǎn)速6 000 r/min，準(zhǔn)確移取上清液2 ml于10 ml尖底離心管中，60℃氮吹，加入3 ml正己烷溶解殘?jiān)ㄞD(zhuǎn)速由低到高，小心調(diào)節(jié)不要造成溶液飛濺，2 000 r/min左右），備用。

1.4.4 凈化 取硅膠固相萃取柱，加3 ml正己烷預(yù)洗，備用液過柱，加乙醚—正己烷10 ml于備用液的離心管中，洗滌，擠干，加二氯甲烷—甲醇5 ml于備用液的離心管中，在固相萃取裝置中放入洗脫架、離心管，洗脫并收集洗脫液，擠干，60℃氮?dú)獯蹈?，用乙腈（?.1%甲酸）2.0 ml復(fù)溶（轉(zhuǎn)速由低到高，小心調(diào)節(jié)不要造成溶液飛濺，2 000 r/min左右）過0.2 μm濾膜后，供液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)。

1.4.5 定量方法 采用基質(zhì)單點(diǎn)校正法，試樣中聚醚類藥物的含量為X，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)微克每千克（μg/kg）表示，殘留量計(jì)算公式如下所示。

式中，A為供試試料溶液中聚醚類藥物峰面積，AS為標(biāo)準(zhǔn)品溶液中聚醚類藥物峰面積，CS為標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（ng/ml），V為定容體積（ml），m為稱樣量（g），n為稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

本試驗(yàn)在國(guó)標(biāo)方法的基礎(chǔ)上專門針對(duì)飼料中的鹽霉素、甲基鹽霉素及莫能菌素給出了具體的前處理方法。在提取過程中，國(guó)標(biāo)方法用到乙腈20 ml兩次提取轉(zhuǎn)移，合并兩次提取液后用旋蒸儀蒸干，5 ml正己烷復(fù)溶后再離心。相對(duì)于國(guó)標(biāo)方法本試驗(yàn)方法提取液僅用乙腈20 ml提取一次，并取上清液2 ml經(jīng)氮吹儀吹干，復(fù)溶液3 ml，過程操作簡(jiǎn)易、清晰、快速、提取充分，能夠降低損失、減少有毒試劑的使用。國(guó)標(biāo)方法的凈化過程使用8 ml乙醚—正己烷洗滌，6 ml二氯甲烷—甲醇洗脫。而本方法中凈化過程使用10 ml洗滌液、5 ml洗脫液，洗滌更加充分，過程損失更小，回收率達(dá)到95%～105%，重復(fù)性條件下兩個(gè)平行測(cè)定的結(jié)果相對(duì)偏差為5%（國(guó)標(biāo)中規(guī)定≤15%），不同實(shí)驗(yàn)室間檢測(cè)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.4%，3種聚醚類藥物的定量限均為10.0 μg/kg。

由此可見，本試驗(yàn)改進(jìn)方法相對(duì)國(guó)標(biāo)方法更加準(zhǔn)確、高效，極大地提高了工作效率；節(jié)省了耗材，減少了對(duì)人體有害試劑的使用；在減少前處理設(shè)備使用頻率的同時(shí)，也減小了試驗(yàn)中產(chǎn)生的系統(tǒng)誤差，對(duì)飼料中聚醚類藥物殘留檢測(cè)工作具有重要作用。