養(yǎng)心顆粒改善心力衰竭大鼠模型水鈉潴留的作用機(jī)制研究

馬 妍，張軍茹，任得志

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是臨床常見病、多發(fā)病，具有患病率、致殘率及死亡率高的特點(diǎn)，是嚴(yán)重危害人類健康的主要疾病之一[1-3]。水鈉潴留是心力衰竭的標(biāo)志，亦是加重心力衰竭的關(guān)鍵因素，因此，消除水鈉潴留是緩解心力衰竭的重要手段[4]。中醫(yī)學(xué)并無心力衰竭之名，更無“水鈉潴留”一說，根據(jù)其證候、病因、病機(jī)，多歸于中醫(yī)學(xué)“心水”“水腫”“痰飲”等范疇。名老中醫(yī)王朝宏教授于20世紀(jì)80年代末創(chuàng)制了養(yǎng)心合劑，基于此方制備的養(yǎng)心顆粒，臨床廣泛用于心力衰竭的治療。本課題組前期臨床研究已經(jīng)證實(shí)，養(yǎng)心顆粒在緩解水鈉潴留、保護(hù)心功能方面顯示出獨(dú)特優(yōu)勢，可能與調(diào)控血管加壓素(AVP)-水通道蛋白-2(AQP2)通路有關(guān)[5-9]，但具體機(jī)制仍不清楚。本研究旨在探究養(yǎng)心顆粒改善心力衰竭水鈉潴留的作用機(jī)制，為臨床中醫(yī)藥治療心力衰竭水鈉潴留提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級SD雄性大鼠70只，體質(zhì)量(180±20)g。西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 藥物及制備 養(yǎng)心顆粒，由陜西省中醫(yī)醫(yī)院中藥研究所提供；鹽酸阿霉素粉針(浙江海正藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號：091001)；托伐普坦(浙江大冢制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字：H20110115)。

1.3 主要試劑與儀器 普通光學(xué)顯微鏡(型號Motic BISERES，日本Olympus公司)；酶標(biāo)儀(型號Multiskan Mk3， 芬蘭雷勃集團(tuán)生產(chǎn))；數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(Motic Med 6.0，廈門麥克奧迪公司生產(chǎn))；全自動(dòng)生化分析儀(型號7170，日本日立公司生產(chǎn))；大鼠N末端B型利鈉肽原(NT-proBNP)試劑盒(上海微蒙物科技有限公司生產(chǎn))，AVP、AVPV2受體(AVPV2R)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)試劑盒(江蘇卡爾文生物技術(shù)有限公司生產(chǎn))；環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、 環(huán)磷酸腺苷交換蛋白(Epac)、AQP2 ELISA試劑盒(武漢純度生物科技有限公司生產(chǎn))；cAMP、Epac、AQP2抗體(Abcam公司生產(chǎn))；哺乳動(dòng)物組織總蛋白提取試劑、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法 70只SD雄性大鼠，空白對照組(10只)正常飼養(yǎng)，其余60只采用改良連續(xù)腹腔注射阿霉素造模[10-11]復(fù)制大鼠心力衰竭模型，在經(jīng)心臟彩超驗(yàn)證出現(xiàn)心力衰竭后，使用代謝籠驗(yàn)證所選模型大鼠具有水鈉潴留癥狀，如體質(zhì)量增加、腳趾腫脹和排尿減少等。在造模過程中5只大鼠死亡，對其解剖后均可發(fā)現(xiàn)存在臟器充血及多漿膜腔積液，待造模成功后將符合心力衰竭水鈉潴留的48只大鼠隨機(jī)分為模型對照組、養(yǎng)心顆粒治療組(高劑量組、中劑量組、低劑量組)與陽性對照組(托伐普坦組)，各組實(shí)驗(yàn)大鼠均給予自由飲食，空白對照組和模型對照組以2 mL/d蒸餾水灌胃1次，養(yǎng)心顆粒高劑量組、中劑量組、低劑量組以養(yǎng)心顆粒16 g/kg、8 g/kg、4 g/kg劑量灌胃1次，陽性對照組灌服0.5 mg/kg托伐普坦，每日1次，均在8周后觀察各項(xiàng)指標(biāo)。

1.5 觀察指標(biāo)及方法

1.5.1 一般情況 觀察實(shí)驗(yàn)過程中各組大鼠的精神狀態(tài)、活動(dòng)情況、靈敏度、毛發(fā)情況、食欲、大小便等一般情況及死亡情況。

1.5.2 尿量、尿鈉、尿滲透壓檢測 實(shí)驗(yàn)結(jié)束連續(xù)3 d收集各組大鼠24 h尿液，取均值，記錄24 h尿量；采用冰點(diǎn)降低法測量大鼠尿滲透壓，Na測試盒測量大鼠尿鈉的排泄。

1.5.3 ELISA法檢測血清NT-proBNP、AVP、AVPV2R、cAMP、Epac1和尿液AQP2水平 收集血液及尿液樣本，常溫離心機(jī)離心后取上清，于-70 ℃冰箱中凍存，收集齊所有標(biāo)本后根據(jù)試劑盒說明書步驟操作。

1.5.4 心肌組織cAMP、Epac1及腎臟組織AQP2免疫組織化學(xué)測定 處死大鼠后，快速取出心臟及腎臟，用生理鹽水將其沖洗干凈，然后置于4%多聚甲醛中固定24 h，常規(guī)酒精脫水、透明、石蠟包埋，連續(xù)切片，用于蘇木素-伊紅(HE)染色和免疫組織化學(xué)分析。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 造模結(jié)束后至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，空白對照組大鼠無死亡，模型對照組死亡2只，養(yǎng)心顆粒高劑量組死亡1只，中劑量組死亡1只，低劑量組死亡 1只，陽性對照組死亡2只。模型對照組大鼠毛色無光澤，倦怠乏力，精神萎靡，活動(dòng)減少，反應(yīng)遲鈍，呼吸困難，活動(dòng)后尤甚，肛溫下降，口唇發(fā)暗，部分有瘀點(diǎn)瘀斑，大便稀溏。而養(yǎng)心顆粒治療組與陽性對照組大鼠一般情況均較模型對照組改善、喘息不明顯。

2.2 各組大鼠體質(zhì)量比較 造模階段，空白對照組大鼠體質(zhì)量隨著時(shí)間的增加而穩(wěn)定增加，呈上升趨勢。造模組用藥初期(前4周)體質(zhì)量增長較快，且可見腳趾腫脹，隨著用藥時(shí)間的增加，體質(zhì)量增加緩慢。詳見表1。造模結(jié)束后，空白對照組大鼠體質(zhì)量增長明顯，模型對照組大鼠體質(zhì)量先增加后降低，養(yǎng)心顆粒高劑量組、中劑量組及陽性對照組體質(zhì)量逐漸增加。用藥治療后，養(yǎng)心顆粒能對抗阿霉素引起的心臟毒性反應(yīng)，減輕阿霉素導(dǎo)致的毒性癥狀。詳見表2。

單位：g

單位：g

2.3 各組大鼠尿量、尿鈉、尿滲透壓比較 與空白對照組比較，模型對照組大鼠尿量、尿鈉、尿滲透壓均降低(P<0.05)，說明模型對照組大鼠水鈉潴留明顯。與模型對照組比較，養(yǎng)心顆粒高劑量組、中劑量組、低劑量組與陽性對照組大鼠尿量、尿鈉、尿滲透壓水平明顯增加(P<0.05)。詳見表3。

2.4 各組大鼠血清NT-proBNP、AVP、AVPV2R、cAMP、Epac1和尿液AQP2水平比較 與空白對照組比較，模型對照組大鼠血清NT-proBNP、AVP、AVPV2R、cAMP及尿液AQP2升高(P<0.05)；與模型對照組比較，養(yǎng)心顆粒高劑量組、中劑量組、低劑量組與陽性對照組大鼠血NT-proBNP、AVP、AVPV2R、cAMP及尿液AQP2水平明顯降低(P<0.05)，但Epac1水平各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表4。

2.5 各組大鼠心肌組織cAMP、Epac1及腎臟組織AQP2表達(dá)水平比較 與空白對照組比較，模型對照組大鼠心肌組織cAMP、Epac1及腎臟組織AQP2表達(dá)明顯升高(P<0.05)，與模型對照組比較，養(yǎng)心顆粒高劑量組、中劑量組、低劑量組與陽性對照組大鼠心肌組織cAMP、Epac1及腎臟組織AQP2的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。詳見表5。

3 討 論

當(dāng)心力衰竭發(fā)生時(shí)，腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)、精氨酸血管加壓素(AVP)等系統(tǒng)被激活，導(dǎo)致液體潴留，進(jìn)一步加重心力衰竭，形成惡性循環(huán)。相關(guān)研究已證實(shí)，神經(jīng)體液因子AVP在水鈉潴留中發(fā)揮重要作用，血液中的AVP增加，導(dǎo)致AVPV2R激活，從而激發(fā)cAMP信號的級聯(lián)反應(yīng)，觸發(fā)AQP2轉(zhuǎn)移，使大量的AQP2集聚在管腔膜上，引起腎臟對水重吸收增加，進(jìn)而導(dǎo)致水鈉潴留[12-13]。但其具體機(jī)制而言，傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為AVP誘導(dǎo)產(chǎn)生AQP2的主要信號通路是cAMP蛋白激酶A(PKA)途徑，但隨著進(jìn)一步深入研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制劑抑制PKA后，細(xì)胞內(nèi)高濃度的cAMP仍然能發(fā)揮作用，cAMP的一種新的下游分子Epac可獨(dú)立于PKA介導(dǎo) cAMP信號通路[14-15]，但其是否參與AVP-AQP2調(diào)節(jié)水鈉潴留目前尚不清楚，阻斷該信號通路能否為治療慢性心力衰竭水鈉潴留帶來新的思路，值得探究。

養(yǎng)心顆粒源自養(yǎng)心合劑，由桂枝、附子、車前子、麥冬、牛膝、丹參、澤瀉、茯苓等藥物組成，為陜西省已故名老中醫(yī)王朝宏教授在長期臨床應(yīng)用的基礎(chǔ)上創(chuàng)制，我院在配方不變的基礎(chǔ)上，采用現(xiàn)代先進(jìn)的藥物制劑技術(shù)制備成的院內(nèi)顆粒制劑，主治心腎陽虛、血瘀水停的心衰病。在前期研究及預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本課題組采用阿霉素誘導(dǎo)心力衰竭水鈉潴留大鼠模型，探討?zhàn)B心顆粒對阿霉素致心力衰竭水鈉潴留的作用。結(jié)果顯示，養(yǎng)心顆粒能對抗阿霉素對心臟的毒性反應(yīng)，減輕阿霉素導(dǎo)致的毒性癥狀。與模型對照組比較，養(yǎng)心顆粒各劑量組能夠明顯增加大鼠尿量、尿鈉、尿滲透壓水平，減輕水鈉潴留。就其機(jī)制而言，本研究證實(shí)養(yǎng)心顆粒各劑量組能夠明顯降低大鼠血清NT-proBNP、AVP、AVPV2R、cAMP及尿液AQP2水平，在心肌組織cAMP、Epac1及腎臟組織AQP2表達(dá)的測定中發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)心顆粒高劑量組、中劑量組、低劑量組能夠降低大鼠cAMP、Epac1、AQP2在相關(guān)組織的表達(dá)，但本研究發(fā)現(xiàn)，與Epac1在心肌組織的表達(dá)不同，其血清水平在各組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，考慮有兩種可能：①血清中的Epac1水平還不能完全代表心肌組織中Epac1的濃度；②只有活化的Epac1才能促進(jìn)水鈉潴留的發(fā)生與發(fā)展。

綜上所述，養(yǎng)心顆粒能夠通過抑制AVP-cAMP-Epac1-AQP2通路核心分子的表達(dá)，減輕水鈉潴留，這可能是該藥治療心力衰竭作用機(jī)制之一，進(jìn)一步探討其發(fā)揮療效的物質(zhì)基礎(chǔ)及更深層次的作用機(jī)制，對提高臨床療效奠定理論支持、拓展其應(yīng)用范圍具有重要意義。