藏紅花酸對異丙腎上腺素誘導(dǎo)心肌梗死大鼠心臟功能的保護作用

張蔚麗，宋秀榮，王曉敏，李曉瓊，王義華，宋明星，李 猛

冠心病在我國心血管病中占據(jù)較高的比例，而急性心肌梗死則是冠心病中最為嚴重的疾病，因其致死、致殘率高，突發(fā)性強，成為公共衛(wèi)生中需要積極預(yù)防的一類疾病。以往的研究中常常需要建立動物的心肌梗死模型，以便于研究心肌梗死的病理生理過程。目前經(jīng)常使用腹腔注射人工合成的β腎上腺素能受體激動劑異丙腎上腺素(isoproterenol，ISO)來建立動物心肌梗死模型[1]。有文獻報道，異丙腎上腺素介導(dǎo)的大鼠心肌梗死模型與人類心肌梗死的形態(tài)學和病理生理特征表象相一致[2]。藏紅花(Iridaceae)又名番紅花或西紅花，是一種屬于鳶尾科多年生無莖草本植物，廣泛分布于中亞、西亞以及地中海等地區(qū)，后經(jīng)絲綢之路傳入我國西藏，故名藏紅花。研究表明，藏紅花及其活性成分具有多種功能[3]，包括神經(jīng)保護功能[4]、抗驚厥[5]、抗抑郁[6-7]、抗支氣管擴張[8]和抗腫瘤作用[9-12]。據(jù)報道藏紅花酸可以減少雄性白化病大鼠的脂質(zhì)過氧化[13]，減少骨骼肌和大腦海馬體中缺血-再灌注介導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷[14]。有報道證實藏紅花酸具有自由基清除活性[15]。但藏紅花酸對急性心肌梗死的作用及其相關(guān)機制報道較少。本研究旨在探討心肌梗死時藏紅花酸預(yù)處理能否有效減輕心肌細胞損害，對抗炎性反應(yīng)，保護心臟功能，維護血流動力學穩(wěn)定。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本實驗采用由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供的無特定病原體(SPF)級健康雄性Wister大鼠50只，體質(zhì)量200～220 g，動物質(zhì)量合格證編號：SCXK20140009。所有實驗動物嚴格按照標準條件飼養(yǎng)1周后用于相關(guān)實驗。

1.2 試劑 本研究中所使用的化學試劑和生化試劑均為分析級和最高純度。異丙腎上腺素(批號：15627，Sigma Aldrich.，St.Louis，USA)、藏紅花酸(批號：S0371，Sigma Aldrich.，St.Louis，USA)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzymes，CK-MB)檢測試劑(批號：20161222)、乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)檢測試劑(批號20161222)、白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)檢測試劑(批號：20161334)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)檢測試劑(批號：20161336)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)檢測試劑(批號：20161338)均由武漢貝茵萊生物科技有限公司提供。

1.3 動物模型制備 將50只大鼠隨機分為5組(采用Excel軟件隨機生成相應(yīng)的數(shù)字)：對照組、心肌梗死組、藏紅花酸50 mg/(kg·d)組、藏紅花酸100 mg/(kg·d)組、藏紅花酸200 mg/(kg·d)組，每組10只。藏紅花酸50 mg/(kg·d)組、藏紅花酸100 mg/(kg·d)組、藏紅花酸200 mg/(kg·d)組大鼠予以相應(yīng)劑量藏紅花酸灌胃，對照組與心肌梗死組予以等量的生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)15 d。在第14天和第15天給予心肌梗死組和藏紅花酸各劑量組連續(xù)2 d皮下多點注射異丙腎上腺素[90 mg/(kg·d)]建立心肌梗死模型，對照組予以等量的生理鹽水多點皮下注射。在第2次腹腔注射異丙腎上腺素24 h后，將大鼠予以戊巴比妥麻醉(60 mg/kg，皮下注射)，然后固定于固定板上，監(jiān)測大鼠心電圖(走紙速度50 mm/s，振幅1 mV/mm)，記錄大鼠平靜后5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min的心電圖，分析大鼠心電圖ST段的變化情況，以出現(xiàn)病理性Q波和/或ST段位移大于0.2 mV作為心肌梗死建模成功的標志[16]。

1.4 左室血流動力學的測定 成功描記心電圖后24 h，將所有實驗組大鼠用戊巴比妥(60 mg/kg)腹膜內(nèi)麻醉。阿托品(4 mg/kg)與麻醉劑一起施用以維持心率，特別是在手術(shù)期間可減少氣管-支氣管分泌物。用中線正中切口打開頸部進行氣管切開術(shù)。使用正壓呼吸機(SuperV，深圳徠越生物技術(shù)有限公司生產(chǎn))將室內(nèi)空氣壓縮，以90次/min的速率和10 mL/kg的潮氣量對大鼠進行通氣，根據(jù)需要調(diào)整呼吸機設(shè)置和血氧分壓(PO2)，將動脈血氣參數(shù)保持在生理范圍內(nèi)。左頸靜脈插入聚乙烯管以連續(xù)輸注生理鹽水。用肝素化-生理鹽水灌注套管插入右頸動脈。使用壓力傳感器將套管與生物機能實驗系統(tǒng)(MD3000/8型，徐州利華電子科技發(fā)展有限公司生產(chǎn))連接，并且借助放大器放大信號以測量收縮壓、舒張壓、平均動脈壓和心率。經(jīng)左側(cè)第4肋、第5肋間行左側(cè)胸廓切開術(shù)，暴露心臟。切開心包后，通過在肋骨上輕輕按壓使心臟裸露在外。無菌金屬套管(1.5 mm孔徑)經(jīng)心尖部區(qū)域插入左心室，用以檢測左心室血流動力學，包括左心室壓力最大上升速率(+LVdp/dtmax)、左心室壓力最大下降速率(-LVdp/dtmax)及左室舒張末壓力(LVEDP)。通過多通道記錄儀(MD8000N，安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn))上的壓力記錄導(dǎo)管將套管連接至壓力傳感器。在10 min的穩(wěn)定時間之后，在不同的標準化靈敏度和速度下于基線測量后在記錄紙上記錄描記線。手術(shù)后，用生理鹽水浸泡敷料覆蓋胸腔，以防止心臟干燥。各數(shù)值均為連續(xù)10次心臟搏動的平均值。

1.5 生化參數(shù)的測定 所有實驗大鼠在完成左室血流動力學檢測后，均采取拉頸處死。分離每只大鼠的心臟，制備大鼠心肌組織勻漿，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)測定LDH、CK-MB、IL-β、IL-6、TNF-α含量，嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作，使用酶標儀(HBS-1096C，南京德鐵實驗設(shè)備有限公司生產(chǎn))在450 nm處測定吸光度(OD)值。使用試劑標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程，將大鼠心肌細胞勻漿的OD值代入回歸方程，計算出標本樣品濃度，之后乘以稀釋倍數(shù)，得出標本的實際濃度。

1.6 心肌組織病理 采用Ojha等[17]的方法對心臟組織進行組織病理學研究。用甲醛保存固定分離的心臟，之后加入液體石蠟中制備蠟塊。使用切片機將大鼠心肌組織切成4 μm的標本，并將標本固定于玻片上。采用蘇木素-伊紅(HE)染色法對組織進行染色，用三目顯微鏡對組織進行觀察。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠一般情況 造模前各組大鼠外觀基本一致。給予藏紅花酸及生理鹽水灌胃后，各組大鼠一般情況一致。皮下注射異丙腎上腺素2 d后，心肌梗死組及藏紅花酸各劑量組大鼠出現(xiàn)精神不振、毛發(fā)欠光澤、食量減少、懶動等表現(xiàn)，對照組大鼠無明顯變化。

2.2 各組大鼠左心室功能比較 心肌梗死組±LVdp/dtmax較對照組明顯降低(P<0.01)，LVEDP較對照組明顯升高(P<0.01)；與心肌梗死組相比，藏紅花酸各劑量組+LVdp/dtmax、-LVdp/dtmax明顯提高，LVEDP明顯降低(P<0.05或P<0.01)，且呈現(xiàn)劑量依賴性。詳見表1。

表1 各組大鼠左心室功能比較(±s)

2.3 各組大鼠心臟血流動力學指標比較 與對照組比較，心肌梗死組平均動脈壓、舒張壓、收縮壓和心率均明顯降低(P<0.01)；與心肌梗死組比較，藏紅花酸各劑量組平均動脈壓、舒張壓、收縮壓和心率均提高(P<0.05或P<0.01)，且呈劑量依賴性。詳見表2。

表2 各組大鼠心臟血流動力學指標比較(±s)

2.4 各組大鼠心肌損傷標志物水平比較 與對照組比較，心肌梗死組心肌組織勻漿中心肌損傷的生物標志物CK-MB、LDH濃度降低；與心肌梗死組比較，藏紅花酸各劑量組心肌組織勻漿中CK-MB、LDH濃度明顯升高(P<0.05或P<0.01)，并且呈現(xiàn)劑量依賴性。詳見表3。

表3 各組大鼠心肌損傷標志物水平比較(±s) 單位：U/L

2.5 各組大鼠心肌細胞炎癥介質(zhì)水平比較 與對照組比較，心肌梗死大鼠心肌組織中IL-1β、IL-6和TNF-α的濃度明顯增高(P<0.01)；與心肌梗死組比較，藏紅花酸各劑量組心肌組織勻漿中IL-1β、IL-6和TNF-α水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)。詳見表4。

表4 各組大鼠心肌細胞炎癥介質(zhì)水平比較(±s) 單位：ng/L

2.6 各組大鼠心肌組織細胞結(jié)構(gòu) 本研究觀察了大鼠心肌梗死后以及藏紅花酸處理后心肌組織的鏡下形態(tài)學表現(xiàn)，對照組心肌細胞排列整齊，細胞無明顯水腫、損傷、炎性細胞浸潤等表現(xiàn)；心肌梗死組心肌細胞可以看到組織壞死、白細胞浸潤、間隙性水腫和血管改變等表現(xiàn)，而在經(jīng)過藏紅花酸處理過的心肌細胞中，這種病理性改變明顯減輕，而且也表現(xiàn)出一定的劑量依賴的特點。詳見圖1。

3 討 論

冠心病急性心肌梗死以其突發(fā)性強、致死致殘率高而成為威脅人們身體健康的頭號殺手。研究表明，過量注射異丙腎上腺素可以在心肌組織中引起嚴重的應(yīng)激反應(yīng)、鈣超載、炎癥反應(yīng)加劇、脂質(zhì)過氧化物堆積等[18-19]，導(dǎo)致梗死樣心肌壞死。異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌梗死與人類心肌梗死的病理過程極為相似，可以作為研究藥物和心肌梗死后心臟功能變化的良好的標準化模型[2，20]。本研究給予大鼠腹腔大劑量注射異丙腎上腺素24 h后檢查心電圖可以觀察到病理性Q波和ST-T心肌損害圖形，提示造模成功。

本研究結(jié)果表明，當實驗大鼠大劑量腹腔注射異丙腎上腺素后，大鼠發(fā)生急性心肌梗死，其直接后果是導(dǎo)致大鼠的心臟功能急劇下降，與對照組相比，心肌梗死組+LVdp/dtmax、-LVdp/dtmax明顯降低，LVEDP明顯升高，收縮壓、舒張壓、平均動脈壓均明顯降低，提示大鼠心肌嚴重受損，導(dǎo)致大量心肌細胞功能喪失，心肌收縮力明顯下降，回心血量增加而血液泵出心室的能力下降。而經(jīng)過藏紅花酸預(yù)處理的實驗大鼠，其心臟功能的各項指標均改善，而且呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性，表明藏紅花酸能夠明顯降低心肌梗死大鼠心功能的惡化程度、穩(wěn)定心肌梗死大鼠的血流動力學、改善心肌梗死的預(yù)后[21-22]。

為了解藏紅花酸改善心肌梗死大鼠心臟功能的具體機制，本研究進一步檢測了大鼠心肌細胞勻漿的心肌酶、炎性介質(zhì)的含量，并且觀察了大鼠心肌細胞的組織病理學標本。CK-MB、LDH常常被定義為一種敏感、特異的心肌損傷生物標志物[23]，當心肌細胞損傷破裂后，細胞漿內(nèi)的酶釋放入血導(dǎo)致血漿中酶學升高。本研究檢測了大鼠心肌細胞勻漿中的CK-MB、LDH濃度，結(jié)果表明，心肌梗死組的心肌細胞勻漿中CK-MB、LDH濃度明顯低于對照組，提示心肌梗死發(fā)生后，心肌細胞受損，細胞膜通透性改變，甚至功能喪失，致使胞質(zhì)中的CK-MB、LDH釋放入血，導(dǎo)致細胞勻漿中的酶含量減少。而經(jīng)藏紅花酸處理的各組大鼠心肌細胞勻漿中CK-MB、LDH濃度升高，且存在一定的劑量依賴性，提示藏紅花酸具有穩(wěn)定心肌細胞膜的作用[24]，在急性缺血、缺氧損害時，經(jīng)過藏紅花酸預(yù)處理的心肌細胞能夠更好地保存功能，減輕細胞損傷。

在異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌梗死中，炎癥反應(yīng)的損傷也起到了重要的作用。本研究檢測了炎癥介質(zhì)IL-1β、IL-6和TNF-α，可見心肌梗死組IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性因子水平明顯高于對照組(P<0.01)，而藏紅花酸預(yù)處理后的大鼠心肌梗死細胞的炎癥介質(zhì)水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)，且存在一定的劑量依賴。當發(fā)生急性心肌梗死時，細胞因子如TNF-α等通過肥大細胞脫顆粒釋放，肥大細胞釋放的其他因子如組胺、5-羥色胺等直接或通過刺激其他細胞因子如 IL-6的釋放參與對缺血的炎癥反應(yīng)[25-26]，細胞因子如 TNF-α、白細胞介素-1(IL-1)、IL-6、白細胞介素-8(IL-8)、中性粒細胞活化肽-1 (NAP-1)、血小板活化因子(PAF)和巨噬細胞炎癥蛋白-2(MIP-2)等細胞因子又刺激嗜中性粒細胞，心肌中細胞因子的產(chǎn)生在轉(zhuǎn)錄水平上由核因子-κB(NF-κB)調(diào)節(jié)，NF-κB由細胞因子本身或活性氧(ROS)激活[27]。藏紅花酸可抑制肝臟中TNF-α、IL-1和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的mRNA表達[25]，還可以抑制脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的細胞釋放一氧化氮(NO)，減少LPS刺激的腫瘤壞死因子、IL-1和細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，有效地降低LPS誘導(dǎo)的NF-κB活化。另外，藏紅花酸還可以減少由干擾素和淀粉樣蛋白刺激的小膠質(zhì)細胞釋放NO[28-30]。這些作用均可以減輕心肌梗死細胞的炎癥反應(yīng)，保護缺血的心肌。

通過心肌細胞病理檢測可見，經(jīng)過藏紅花酸預(yù)處理的大鼠，心肌細胞的損傷程度明顯降低，細胞的完整性更好，相應(yīng)的心肌細胞中的心肌損傷標志物釋放入血減少，急性炎癥反應(yīng)被抑制，有助于保護心臟功能，穩(wěn)定血流動力學。

綜上所述，藏紅花酸能通過抑制炎性介質(zhì)釋放，減輕心肌細胞的損傷程度，從而維護心臟功能及穩(wěn)定血流動力學，說明藏紅花酸可能具有潛在的心血管保護作用。