脂聯(lián)素通過Nrf2/HO-1通路對急性心肌梗死大鼠心功能和心肌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制

郭施勉，楚英杰

冠狀動(dòng)脈急性閉塞導(dǎo)致的心肌缺血在臨床中被稱為急性心肌梗死(AMI)[1-3]，通常病人臨床癥狀為心源性休克、心律失常，嚴(yán)重者可出現(xiàn)猝死。AMI重要病理環(huán)節(jié)是心肌缺血缺氧、氧化應(yīng)激反應(yīng)過度激活，這一過程中包括很多生物學(xué)環(huán)節(jié)，而過度激活核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)/血紅素氧化酶1(HO-1)通路就是心肌缺血缺氧、氧化應(yīng)激反應(yīng)過度的表現(xiàn)之一[4-6]。Nrf2/HO-1通路參與了細(xì)胞內(nèi)抗氧化應(yīng)激的信號(hào)通路，在一定條件下，使Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白(Keap)1和Nrf2結(jié)合受到抑制。在過度激活氧化應(yīng)激的條件下，氧自由基可以調(diào)控Nrf2蛋白表達(dá)增多和Keap1解離，從而調(diào)控HO-1基因序列上的啟動(dòng)基因和抗氧化反應(yīng)元件表達(dá)并發(fā)揮抗氧化的影響。脂聯(lián)素(APN)是一種內(nèi)源性激素，是由脂肪細(xì)胞分泌的一種具有促進(jìn)脂肪和葡萄糖分解代謝功能的蛋白質(zhì)[6-8]，其對降低胰島素抵抗、提高機(jī)體胰島素敏感度有著積極的作用。有研究證明，在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)的作用下，葡萄糖分解代謝功能出現(xiàn)障礙，導(dǎo)致心肌細(xì)胞脂肪酸氧化失常，心肌細(xì)胞凋亡率急劇增加，這時(shí)會(huì)出現(xiàn)心臟收縮障礙[9-11]。盡管近年來有很多研究均證實(shí)了APN與心肌細(xì)胞凋亡有相關(guān)性，但是APN是否通過干擾Nrf2/HO-1通路對AMI病人心肌細(xì)胞凋亡起作用及其作用機(jī)制鮮見報(bào)道。本研究旨在探討APN通過Nrf2/HO-1通路對AMI大鼠心功能和心肌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 無特定病原體(SPF)級雄性SD大鼠購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；鋅原卟啉 9(ZPP-Ⅸ)購自Meilunbio；原位末端標(biāo)記測定法(TUNEL)染色試劑盒及磷酸肌酸激酶同工酶(CK-MB)、磷酸肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒購自美國 Biomiga公司；第一鏈 cDNA合成試劑盒和RNA提取試劑盒購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；Nrf2、HO-1、B淋巴細(xì)胞瘤 2 蛋白(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān) X 蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved-caspase-3)的一抗購自Santa Cruz公司；凝膠成像儀和PCR儀購自Bio-Rad 公司；熒光顯微鏡購自Nikon公司；分光光度計(jì)購自上海精密儀器儀表有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組 將健康成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為Sham 組、AMI組、APN組和APN+ZPP-Ⅸ組，Sham 組不做任何處理，AMI組、APN組和APN+ZPP-Ⅸ組均建立AMI模型(方法：左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎)。

1.2.2 建模 腹腔注射10%水合氯醛10 mL/kg麻醉后將大鼠仰臥放置于手術(shù)操作臺(tái)，在大鼠的左側(cè)第3肋、第4肋間作切口，切開后顯露心臟，然后分離左冠狀動(dòng)脈前降支，縫合左冠狀動(dòng)脈前降支的起始部位，然后關(guān)閉腹腔，建模成功。

1.2.3 給藥方法 建模后，APN組給予腹腔注射1mg/(kg·d)APN，APN+ZPP-Ⅸ組給予腹腔注射1 mg/(kg·d)APN和10 μmol/(kg·d) ZPP-Ⅸ，Sham 組和AMI組腹腔注射同等劑量的生理鹽水，連續(xù)注射7 d。

1.2.4 心臟氯化三苯基四氮唑(TTC)染色 最后1次給藥24 h后，在Sham 組、AMI組、APN組和APN+ZPP-Ⅸ組各選擇2只大鼠，摘取其心臟后放入-20 ℃的環(huán)境下冰凍，1 h后取出，沿著心臟長軸以心尖向心室基底部開始橫向切心肌組織5片，將5片心肌組織使用1% TTC進(jìn)行染色，20 min后使用4%多聚甲醛固定10 min。拍照，灰白色為缺血心肌組織，紅色為正常心肌組織，使用Image J 軟件分析心肌缺血面積。

1.2.5 血清心肌酶檢測 建模24 h后，取大鼠的眼內(nèi)眥血液，然后將其靜置30 min后進(jìn)行離心處理，取上清液，使用分光光度試劑盒檢測LDH、CK-MB、CK含量。

1.2.6 心肌細(xì)胞凋亡檢測 最后1次給藥24 h后，解剖大鼠心臟，將梗死的心肌組織分離，使用4%多聚甲醛固定后實(shí)施石蠟包埋，將心肌組織制成切片后使用TUNEL試劑盒進(jìn)行染色。在顯微鏡下藍(lán)色熒光為細(xì)胞核，綠色熒光為凋亡細(xì)胞，計(jì)算心肌細(xì)胞凋亡率。

1.2.7 mRNA表達(dá)水平檢測 獲取梗死的心肌組織，使用RNA提取試劑盒將梗死心肌組織的RNA進(jìn)行分離，然后將RNA合成cDNA。在擴(kuò)增條件下，使用熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行cDNA擴(kuò)增，連續(xù)循環(huán)40次，得出循環(huán)閾值。用β-actin作內(nèi)參，根據(jù)循環(huán)閾值計(jì)算mRNA的表達(dá)水平。

1.2.8 基因蛋白表達(dá)檢測 將RIPA裂解液放入梗死部位心肌組織中，提取梗死部位心肌組織總蛋白后實(shí)施定量。每組蛋白選擇50 μg，然后使用蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測。在聚丙烯酰胺凝膠中加入蛋白樣本進(jìn)行電泳和電轉(zhuǎn)膜后加入5%的脫脂牛奶，將其放入溫室中培養(yǎng)2 h，取出使用TBST進(jìn)行洗膜，連續(xù)清洗3遍。將Nrf2、HO-1、Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase-3的一抗加入。在4 ℃條件下培養(yǎng)12 h后，使用TBST進(jìn)行洗膜，連續(xù)清洗3遍，放入溫室中培養(yǎng)2 h，使用凝膠成像儀得到蛋白條帶，用β-actin作內(nèi)參，根據(jù)蛋白條帶計(jì)算基因蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 4組大鼠血清心肌酶含量比較 Sham 組血清LDH、CK-MB、CK含量明顯低于AMI組，AMI組血清LDH、CK-MB、CK含量明顯高于APN組，APN組LDH、CK-MB、CK含量明顯低于APN+ZPP-Ⅸ組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 4組大鼠血清心肌酶含量比較(±s) 單位：U/L

2.2 4組大鼠缺血心肌面積比較 與Sham 組比較，AMI組大鼠明顯有心肌缺血，且APN組大鼠心肌缺血面積明顯小于AMI組，APN+ZPP-Ⅸ組大鼠心肌缺血面積明顯大于APN組。詳見圖1。

圖1 心肌組織TTC染色圖

2.3 4組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率比較 AMI組心肌細(xì)胞凋亡率明顯高于Sham 組，APN組心肌細(xì)胞凋亡率明顯低于AMI組，APN+ZPP-Ⅸ組心肌細(xì)胞凋亡率明顯高于APN組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖2、圖3。

圖2 TUNEL染色檢測心肌細(xì)胞凋亡

與Sham組比較，＊ P<0.05；與AMI組比較，# P<0.05；與APN組比較，△ P<0.05。

2.4 4組大鼠心肌組織中凋亡基因mRNA及蛋白表達(dá)水平比較 AMI組心肌中Bcl-2表達(dá)明顯低于Sham組，且Cleaved-caspase-3和Bax表達(dá)明顯高于Sham組；APN組心肌中Bcl-2表達(dá)明顯高于AMI組，且Cleaved-caspase-3和Bax表達(dá)明顯低于AMI組；APN+ZPP-Ⅸ組心肌中Bcl-2表達(dá)明顯低于APN組，且Cleaved-caspase-3和Bax表達(dá)明顯高于APN組；差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖4、圖5。

與Sham組比較，＊ P<0.05；與AMI組比較，# P<0.05；與APN組比較，△ P<0.05。

2.5 4組大鼠心肌組織中Nrf2、HO-1表達(dá)水平比較 AMI組心肌中Nrf2、HO-1表達(dá)水平明顯高于Sham組，APN組心肌中Nrf2、HO-1表達(dá)水平明顯高于AMI組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；APN+ZPP-Ⅸ組心肌中Nrf2表達(dá)水平與APN組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，APN+ZPP-Ⅸ組心肌中HO-1表達(dá)水平明顯低于APN組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖6、圖7。

與Sham組比較，＊ P<0.05；與AMI組比較，# P<0.05；與APN組比較，△ P<0.05。

與Sham組比較，＊ P<0.05；與AMI組比較，# P<0.05；與APN組比較，△ P<0.05。

3 討 論

AMI是臨床中最為嚴(yán)重的冠心病[12-14]。近年來AMI病人逐年遞增，具有較高的發(fā)病率和死亡率，嚴(yán)重影響人們的生命安全。AMI病理基礎(chǔ)是不穩(wěn)定斑塊破裂，其始動(dòng)原因?yàn)檠軆?nèi)皮細(xì)胞受損，而血管內(nèi)皮細(xì)胞受損主要標(biāo)志就是血管內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體[15-17]。APN是一種新型內(nèi)源性生物蛋白質(zhì)，其具有抗炎癥、抗動(dòng)脈粥樣硬化和抗損傷后內(nèi)膜增生的活性[18]。相關(guān)報(bào)道指出，APN與冠心病等心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展有一定的相關(guān)性[19]。近年來，APN在心血管疾病發(fā)病過程中的影響已成為研究熱點(diǎn)。舒海洲等[20]研究發(fā)現(xiàn)，APN與AMI的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，且APN還能影響AMI的預(yù)后。

本研究將APN運(yùn)用到AMI治療中，通過建立AMI大鼠模型，檢測血清心肌酶水平的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Sham 組血清LDH、CK-MB、CK含量明顯低于AMI組，AMI組血清LDH、CK-MB、CK含量明顯高于APN組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明APN對于減輕心肌損傷程度有積極的作用。

AMI發(fā)生后心肌細(xì)胞出現(xiàn)損傷是線粒體途徑細(xì)胞凋亡的重要環(huán)節(jié)，隨著抗凋亡分子Bcl-2不斷減少，促凋亡分子Bax逐漸增多，導(dǎo)致線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素C大量進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，通過相關(guān)反應(yīng)使Pro-caspase-3被裂解成Cleaved-caspase-3促使細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，AMI組心肌中Bcl-2表達(dá)明顯低于Sham組，且Cleaved-caspase-3和Bax表達(dá)明顯高于Sham組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，進(jìn)一步說明在AMI大鼠中線粒體途徑細(xì)胞凋亡被過度激活，造成Bcl-2表達(dá)水平過低，Cleaved-caspase-3和Bax表達(dá)水平明顯升高。吳霞等[21]研究發(fā)現(xiàn)，APN在心肌細(xì)胞中具有抗凋亡的作用。本研究將APN用于AMI模型大鼠中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，APN組大鼠心肌中Bcl-2表達(dá)明顯高于AMI組，且Cleaved-caspase-3和Bax表達(dá)明顯低于AMI組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明APN可以抑制AMI大鼠細(xì)胞凋亡。

有相關(guān)報(bào)道指出，在AMI細(xì)胞凋亡發(fā)生和發(fā)展過程中受到炎癥介質(zhì)、缺血缺氧、氧自由基等多種病理因子的調(diào)控，在缺血缺氧的條件下Nrf2/HO-1通路在心肌中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用[22-23]。本研究發(fā)現(xiàn)，AMI組大鼠心肌中Nrf2、HO-1表達(dá)水平明顯高于Sham組，APN組大鼠心肌中Nrf2、HO-1表達(dá)水平明顯高于AMI組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說明APN可以有效刺激Nrf2/HO-1通路起到抗氧化、抗凋亡的作用。為了進(jìn)一步證實(shí)APN是否通過Nrf2/HO-1通路對心肌起保護(hù)作用，本研究采用抑制ZPP-Ⅸ來抑制APN對Nrf2/HO-1通路的激活作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，APN組LDH、CK-MB、CK、心肌細(xì)胞凋亡率、心肌中Bax和Cleaved-caspase表達(dá)水平明顯低于APN+ZPP-Ⅸ組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；APN組心肌中的Bcl-2表達(dá)水平明顯高于APN+ZPP-Ⅸ組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，證明APN通過刺激Nrf2/HO-1通路來對AMI大鼠心肌起保護(hù)作用。

綜上所述，APN在AMI模型大鼠中具有抑制心肌細(xì)胞凋亡、減輕心肌受損的作用，APN保護(hù)心肌作用的分子機(jī)制為Nrf2/HO-1通路。