雪膽多酚抗氧化作用及對α-葡萄糖苷酶抑制作用研究

趙 艷，劉麗娟，王白娟，陳 庚，高青青，張廣輝，楊生超*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)云南省藥用植物生物學(xué)重點(diǎn)實驗室/西南中藥材種質(zhì)創(chuàng)新與利用國家地方聯(lián)合工程研究中心，云南 昆明 650201; 2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201; 3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)機(jī)關(guān)黨委，云南 昆明 650201)

【研究意義】雪膽(Hemsleyachinensis)為葫蘆科雪膽屬植物，主要分布于中國西南地區(qū)[1]。雪膽具有清熱解毒、消炎抗菌等功效，被收載于《云南中草藥》、《全國中草藥匯編》，為民間習(xí)用藥材，常用于治療胃腸炎及急性扁桃體炎等疾病[2]。植物多酚是在植物體內(nèi)廣泛存在的次級代謝產(chǎn)物，具有較好的抑菌性和抗氧化活性[3-6]。有報道稱在自然界中氨基酸也具有一定的抗氧化能力[7]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】陳冠群等[8]測定氨基酸抗氧化活性的結(jié)果表明，蛋氨酸、賴氨酸和酪氨酸等6種氨基酸的抗氧化活性較高。天然抗氧化劑間存在相互增效協(xié)同的作用，Hwang等[9]研究發(fā)現(xiàn)高溫不影響協(xié)同增效作用，生育酚和氨基酸具有聯(lián)合抗氧化作用。但是對雪膽多酚與氨基酸之間的協(xié)同作用以及雪膽多酚對α-葡萄糖苷酶的研究尚未見報道。【本研究切入點(diǎn)】通過Folin-Ciocalte法測定多酚含量，結(jié)合DPPH自由基、ABTS自由基、羥基自由基、超氧陰離子清除活性和鐵還原能力法，探討雪膽多酚與組氨酸、纈氨酸、甘氨酸之間的聯(lián)合抗氧化活性，并采用體外法分析雪膽多酚對α-葡萄糖苷酶的抑制作用?！緮M解決的關(guān)鍵問題】明確雪膽多酚與氨基酸的協(xié)同增效作用和對α-葡萄糖苷酶的抑制作用，為雪膽的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗材料：雪膽(Hemsleyachinensis)采自云南柯兆生物科技有限公司雪膽種植基地，由楊生超教授鑒定為葫蘆科雪膽屬雪膽(Hemsleyachinensis)，經(jīng)粉碎過100目篩，密封于干燥器中備用。

試驗儀器：無水乙醇、苯酚、葡萄糖購自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；氯仿、正丁醇、濃硫酸購自重慶川東化工有限公司；冰醋酸、氫氧化鈉、硫酸亞鐵、水楊酸鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵粉購自西隴化工股份有限公司，福林-酚試劑、甘氨酸、組氨酸、纈氨酸購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷、二苯基苦味?；诫?DPPH)購自上海金穗生物科技有限公司，對硝基苯酚購自西隴化工有限公司，α-葡萄糖苷酶購自Sigma公司，ABTS購自化工生物工程(上海)股份有限公司，以上試劑均為國產(chǎn)分析純。DPPH購自Sigma公司。722S型可見分光光度計(上海菁華科技儀器有限公司)、DRHH-型數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海雙捷實驗設(shè)備有限公司)、DC-600高速多功能粉碎機(jī)(江武義鼎藏日用金屬制品廠)、電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 雪膽多酚的提取 雪膽塊莖→粉碎機(jī)粉碎(100目)→提取→過濾→雪膽多酚提取液[10]。

1.2.2 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 準(zhǔn)備沒食子酸標(biāo)品，根據(jù)Folin-Ciocalte法在765 nm處測定提取液的吸光值，平行測定3次。以沒食子酸濃度為橫坐標(biāo)，以吸光值為縱坐標(biāo)，繪制沒食子酸的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.2.3 雪膽多酚提取率的計算 將1.2.2中沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液用10 mL雪膽多酚提取液替代，按1.2.2步驟測定吸光值，通過沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的線性方程，得到多酚濃度后通過式(1)，計算雪膽多酚提取率。

(1)

式中，C：多酚濃度(mg·mL-1)；Va：容量瓶量程(mL)；Vb：提取液總體積(mL)；M：樣品質(zhì)量(g)；V：取液量(mL)。

1.2.4 雪膽多酚與氨基酸的體外聯(lián)合抗氧化能力 取4 g雪膽粉末進(jìn)行多酚提取，并計算雪膽多酚的含量，將雪膽多酚提取液按0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006 mg·mL-1濃度梯度進(jìn)行稀釋。分別按照前述濃度梯度配制抗壞血酸(Vc)、甘氨酸、組氨酸和纈氨酸溶液。

(1)DPPH清除率的測定。雪膽多酚提取液、組氨酸、纈氨酸、甘氨酸、Vc(分別取2 mL于試管中)→DPPH無水乙醇溶液(2 mL)→室溫反應(yīng)(0.5 h)→測定吸光值A(chǔ)1(517 nm)→以水代替待測溶液測定吸光值A(chǔ)0，以乙醇溶液代替DPPH溶液測定吸光值A(chǔ)2，以同等梯度濃度抗壞血酸溶液作對照→計算DPPH清除率[11]。

聯(lián)合抗氧化測定中，氨基酸與雪膽多酚提取液各1 mL，用等濃度乙醇置換作對照組和空白組。

(2)

(2)ABTS清除率的測定。配制ABTS溶液。雪膽多酚提取液、組氨酸、纈氨酸、甘氨酸、Vc(分別取2 mL于試管中)→ABTS溶液(1.8 mL)→避光反應(yīng)(0.5 h)→測定吸光值A(chǔ)1(734 nm)→以水代替待測溶液測定吸光值A(chǔ)0，以乙醇溶液代替ABTS溶液測定吸光值A(chǔ)2，以同等梯度濃度抗壞血酸溶液作對照→計算ABTS清除率[12]。

聯(lián)合抗氧化測定中，氨基酸與雪膽多酚提取液各1 mL，將ABTS和雪膽多酚溶液、氨基酸、氨基酸與雪膽多酚混合液用等量蒸餾水置換作對照組和空白組。

(3)

(3)羥基自由基清除率的測定。雪膽多酚提取液、組氨酸、纈氨酸、甘氨酸、Vc(分別取2 mL于試管中)→硫酸亞鐵(2 mL)→過氧化氫(2 mL)→室溫反應(yīng)(2 min)→水楊酸鈉溶液(2 mL)→室溫反應(yīng)(20 min)→測定吸光值A(chǔ)1(510 nm)→以水代替待測溶液測定吸光值A(chǔ)0，以水代替過氧化氫溶液測定吸光值A(chǔ)2，以同等梯度濃度抗壞血酸溶液作對照→計算羥基自由基清除率[13]。

聯(lián)合抗氧化測定中，氨基酸與雪膽多酚提取液各1 mL，用等量蒸餾水代替水楊酸鈉溶液和雪膽多酚溶液、氨基酸、氨基酸與雪膽多酚混合液作對照組和空白組。

(4)

(4)超氧陰離子清除率的測定。雪膽多酚提取液、組氨酸、纈氨酸、甘氨酸、Vc(分別取2 mL于試管中)→鄰苯三酚溶液(1 mL)→Tris-HCl溶液(4.5 mL)→25℃水浴(10 min)→HCl溶液(1.5 mL)→測定吸光值A(chǔ)2(360 nm)→以水代替待測溶液測定吸光值A(chǔ)1，以同等梯度濃度抗壞血酸溶液作對照→計算超氧陰離子清除率[14]。

聯(lián)合抗氧化測定中，氨基酸與雪膽多酚提取液各1 mL，將鄰苯三酚溶液和雪膽多酚溶液、氨基酸、氨基酸與雪膽多酚混合液用等量蒸餾水置換作對照組和空白組。

(5)

(5)還原能力的測定。雪膽多酚提取液、組氨酸、纈氨酸、甘氨酸、Vc(分別取2 mL于離心管中)→磷酸緩沖溶液(2.5 mL)→K[Fe(CN)]6溶液(2.5 mL)→室溫反應(yīng)(20 min)→三氯乙酸溶液(2.5 mL)→離心取上清液(5 mL)→三氯化鐵(0.5 mL)→蒸餾水(5 mL)→室溫反應(yīng)(20 min)→測定吸光值(700 nm)[15]。

聯(lián)合抗氧化測定中，氨基酸與雪膽多酚提取液各1 mL。

1.2.5 α-葡萄糖苷酶活性抑制實驗 (1)pNP標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。配制pNP標(biāo)準(zhǔn)溶液，在405 nm處測定吸光值，以pNP濃度和吸光值為橫縱坐標(biāo)，繪制pNP標(biāo)準(zhǔn)曲線[16-17]。

(2)適宜酶量的確定。pNPG溶液(1 mL)→α-葡萄糖苷酶液(同濃度不同量)→磷酸緩沖溶液(補(bǔ)充至同體積)→37 ℃水浴→每隔10 min Na2CO3溶液終止反應(yīng)(2 mL)→測定吸光值(405 nm)[18-19]。

(3)酶反應(yīng)動力學(xué)方程的建立。pNPG溶液(同量不同濃度)→α-葡萄糖苷酶液(0.4 mL)→磷酸緩沖溶液(補(bǔ)充至同體積)→37 ℃水浴(0.5 h)→Na2CO3溶液終止反應(yīng)(2 mL)→測定吸光值(405 nm)[18-19]。對照組用磷酸緩沖溶液置換α-葡萄糖苷酶液。

(4)對α-葡萄糖苷酶抑制作用的動力學(xué)實驗。10支試管(分為兩組)→α-葡萄糖苷酶液(同量不同濃度)→雪膽多酚提取液(1 mL)→磷酸緩沖溶液(補(bǔ)充至同體積)→37 ℃水浴(預(yù)反應(yīng)30 min)→pNPG溶液(1 mL) →37 ℃水浴(30 min)→Na2CO3溶液終止反應(yīng)(2 mL)→測定吸光值(405 nm)。

(5)對α-葡萄糖苷酶抑制類型的確定。8支試管(分為兩組)→α-葡萄糖苷酶溶液(0.4 mL)→磷酸緩沖溶液(1組為1、0.8、0.6、0.4 mL，2組為2、1.8、1.6、1.4 mL)→37 ℃水浴(預(yù)反應(yīng)30 min)→pNPG溶液(1 mL) →37 ℃水浴(30 min)→Na2CO3溶液終止反應(yīng)(2 mL)→測定吸光值(405 nm)。用磷酸緩沖溶液代替α-葡萄糖苷酶液做對照組。

1.3 數(shù)據(jù)分析與作圖

采用Microsoft Excel 2013整理數(shù)據(jù)作圖，以SPSS 20.0中的LSD法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以沒食子酸濃度與吸光值為橫縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到?jīng)]食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程：Y=67.23X+0.0046，R2=0. 9997。由圖1表明，在0～0.009 mg·mL-1沒食子酸濃度與吸光值線性關(guān)系良好。

2.2 雪膽多酚與氨基酸的聯(lián)合體外抗氧化實驗

2.2.1 清除DPPH自由基能力分析 由圖2可知，隨著雪膽多酚提取液、組氨酸、組氨酸與雪膽多酚混合液、纈氨酸、纈氨酸與雪膽多酚混合液、甘氨酸、甘氨酸與雪膽多酚混合液濃度的不斷提高，DPPH自由基清除率也呈現(xiàn)增加的趨勢。結(jié)果表明其IC50值分別為0.0018、0.0068、0.0056、0.0036、0.0094、0.0076、0.0066、0.0005 mg·mL-1。通過IC50數(shù)值的大小，可以發(fā)現(xiàn)抗氧化能力的差異，總體趨勢為IC50數(shù)值越小，對應(yīng)物質(zhì)的抗氧化能力越強(qiáng)。結(jié)果表明，雪膽多酚、3種氨基酸、3種氨基酸和雪膽多酚聯(lián)合使用對DPPH有一定的清除能力，但清除能力略弱于Vc。

2.2.2 清除ABTS自由基能力分析 由圖3可知，隨著各溶液濃度的增加，ABTS自由基的清除率也在逐漸增大。研究結(jié)果表明，各溶液IC50的數(shù)值分別為雪膽多酚提取液0.0058 mg·mL-1、組氨酸0.01 mg·mL-1、組氨酸與多酚混合液0.0016 mg·mL-1、纈氨酸0.0082 mg·mL-1、纈氨酸與多酚混合液0.0017 mg·mL-1、甘氨酸0.15 mg·mL-1、甘氨酸與多酚混合液0.0017 mg·mL-1、Vc溶液0.0007 mg·mL-1。結(jié)果表明，雪膽多酚、3種氨基酸、3種氨基酸和雪膽多酚聯(lián)合使用對ABTS自由基有一定的清除能力，但清除能力略弱于Vc。

2.2.3 清除羥基自由基能力分析 雪膽多酚、3種氨基酸、3種氨基酸和雪膽多酚聯(lián)合使用對羥基自由基均具有清除能力，但清除能力弱于Vc(圖4)。隨著各個溶液濃度增加，羥基自由基的清除率增強(qiáng)，結(jié)果表明IC50的數(shù)值分別為雪膽多酚提取液0.0032 mg·mL-1、組氨酸0.0017 mg·mL-1、組氨酸與多酚混合液0.0018 mg·mL-1、纈氨酸0.0017 mg·mL-1、纈氨酸與多酚混合液0.0018 mg·mL-1、甘氨酸0.0028 mg·mL-1、甘氨酸與多酚混合液0.0018 mg·mL-1和Vc 0.0012 mg·mL-1。

2.2.4 清除超氧陰離子能力分析 由圖5可知，與Vc清除超氧陰離子能力比較，雪膽多酚、3種氨基酸、3種氨基酸與雪膽多酚聯(lián)合使用對超氧陰離子均具有一定的清除能力。結(jié)果表明，IC50的數(shù)值分別為雪膽多酚提取液0.0075 mg·mL-1、組氨酸0.011 mg·mL-1、組氨酸與多酚混合液0.0044 mg·mL-1、纈氨酸0.016 mg·mL-1、纈氨酸與多酚混合液0.0027 mg·mL-1、甘氨酸0.017 mg·mL-1、甘氨酸與多酚混合液0.008 mg·mL-1和Vc 0.0018 mg·mL-1。

2.2.5 還原能力分析 由圖6可知，雪膽多酚、氨基酸均具有一定的還原能力，隨著雪膽多酚提取液、組氨酸、組氨酸與多酚混合液、纈氨酸、纈氨酸與多酚混合液、甘氨酸、甘氨酸與多酚混合液和Vc濃度的增加，還原能力也逐漸增大，但還原能力較Vc稍弱。

2.3 雪膽多酚對α-葡萄糖苷酶的抑制實驗

2.3.1 建立pNP標(biāo)準(zhǔn)曲線 以pNP濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制pNP標(biāo)準(zhǔn)曲線。Y=64.179X+0.0001為線性回歸方程(R2=0.9997)。從圖7可知，pNP濃度在0～0.004 mmol·L-1內(nèi)pNP濃度與吸光值線性關(guān)系良好。

2.3.2 α-葡萄糖苷酶反應(yīng)動力學(xué)中最適酶量的測定 由圖8可知，α-葡萄糖苷酶溶液用量越大，線性反應(yīng)期的時間縮短。根據(jù)初始反應(yīng)速率的數(shù)值，確定酶的用量為0.4 mL，選取0.5 h作為反應(yīng)時間，進(jìn)行酶反應(yīng)動力學(xué)測定。

2.3.3 酶反應(yīng)動力學(xué)方程的確定 由圖9可知，直線的X軸截距為=-0.18，Y軸的截距為3.08。因為X軸的截距=-1/Km，Y軸截距=1/Vmax。

米氏常數(shù)Km=5.56 mg·mL-1

最大反應(yīng)速率Vmax=0.32 nM·min-1

將米氏常數(shù)與最大反應(yīng)速率代入酶反應(yīng)動力學(xué)方程，可得到米氏方程。

V=Vmax[S]/ ([S]+Km) =0.32 nmol/L·min-1[S]/([S]+5.56 mg·mL-1)

2.3.4 雪膽多酚對α-葡萄糖苷酶的抑制類型 有無抑制劑的體系速率直線均經(jīng)過原點(diǎn)，從動力學(xué)曲線可以看出，當(dāng)有抑制劑時，速率直線的斜率較小，從圖10可以判斷雪膽多酚提取液對α-葡萄糖苷酶的抑制作用屬于可逆性抑制類型。

競爭性抑制、非競爭性抑制和反競爭性抑制屬于可逆性抑制中的3種類型。當(dāng)最大反應(yīng)速率不變、米氏常數(shù)增大時為競爭性抑制類型；當(dāng)最大反應(yīng)速率減小、米氏常數(shù)不變時為非競爭性抑制類型；當(dāng)最大反應(yīng)速率和米氏常數(shù)的數(shù)值都減小時屬于反競爭抑制類型。由圖11可知，添加抑制劑后，體系的最大反應(yīng)速率和米氏常數(shù)均呈現(xiàn)減小的趨勢，由此可知雪膽多酚對α-葡萄糖苷酶是可逆性抑制中的反競爭性抑制類型。

3 討 論

酚類抗氧劑一般含有一個或多個酚羥基，羥基能提供氫質(zhì)子與自由基反應(yīng)，起到清除自由基的作用[20]。雪膽多酚提取液清除DPPH的能力較強(qiáng)，其 IC50為0.0018 mg·mL-1；并有一定的羥基自由基、ABTS、超氧陰離子清除作用。組氨酸、纈氨酸與甘氨酸清除羥基自由基的能力較強(qiáng)，其IC50分別為

0.0017、0.0017、0.0028 mg·mL-1；并具有一定的DPPH、ABTS、超氧陰離子清除作用。雪膽多酚提取液分別與組氨酸、纈氨酸、甘氨酸聯(lián)合使用清除ABTS的能力較強(qiáng)，其IC50分別為0.0016、 0.0017、0.0017 mg·mL-1；并具有一定的DPPH、羥基自由基、超氧陰離子清除作用。

天然抗氧化劑間可能存在協(xié)同作用，常將兩種以上的天然抗氧劑聯(lián)合使用。氨基酸具有一定的抗氧化活性，但與酚類、黃酮類、維生素類強(qiáng)氧化劑相比，氨基酸的抗氧化活性相對較小，而氨基酸能發(fā)揮其抗氧化活性的作用的機(jī)制之一，是與其他抗氧化劑發(fā)揮協(xié)同抗氧化的作用[21]。李新[22]研究了20種氨基酸與9種酚類及維生素抗氧化劑的聯(lián)合作用效果，發(fā)現(xiàn)組氨酸等氨基酸與9種酚類及維生素抗氧化劑之間存在較為明顯的ABTS自由基清除活性的協(xié)同作用。

α-葡萄糖苷酶可水解α-1,4糖苷鍵，把機(jī)體攝入的碳水化合物生成利于吸收的葡萄糖，在人體糖類化合物代謝中有著重要的作用，α-葡萄糖苷酶抑制劑可以競爭性抑制α-葡萄糖苷酶，從而減弱及減緩葡萄糖在腸道中的吸收。通過雪膽多酚對α-葡萄糖苷酶的抑制動力學(xué)曲線類型研究，發(fā)現(xiàn)雪膽多酚對α-葡萄糖苷酶有一定的抑制作用，屬于可逆性抑制中的反競爭性抑制類型。不同多酚化合物的抑制類型有所不同，伍城穎等[23]研究發(fā)現(xiàn)芡種皮多酚對α-葡萄糖苷酶的抑制作用為競爭性抑制。宋菲等[24]研究了檳榔提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用，結(jié)果表明檳榔殼及檳榔籽提取物對酶活性的抑制作用類型為競爭與非競爭的混合型抑制，而檳榔花提取物對酶活性的抑制作用類型為競爭與反競爭的混合型抑制。

4 結(jié) 論

利用體外抗氧化評價方法，分析了雪膽多酚與組氨酸、纈氨酸、甘氨酸單獨(dú)抗氧化和組合抗氧化效應(yīng)實驗結(jié)果表明，雪膽多酚、組氨酸、纈氨酸、甘氨酸、組氨酸與雪膽多酚聯(lián)合、纈氨酸與雪膽多酚聯(lián)合、甘氨酸與雪膽多酚聯(lián)合均具有清除DPPH自由基、ABTS自由基、羥基自由基、超氧陰離子清除活性的能力，并具有一定的還原能力。通過動力學(xué)實驗發(fā)現(xiàn)，雪膽多酚對α-葡萄糖苷酶有抑制作用，對酶活性的抑制作用類型為可逆性抑制中的反競爭性抑制類型。本研究結(jié)果表明，雪膽多酚提取物具有良好的開發(fā)潛力，為提高雪膽產(chǎn)品的附加值和雪膽資源的高效利用提供了理論依據(jù)。