霜疫霉侵染對不同荔枝品種果皮苯丙烷類代謝的影響

陳浩 孫進(jìn)華 王樹軍 李煥苓 王果 王家保

摘? 要：荔枝霜疫霉病是荔枝生產(chǎn)過程中的主要病害之一，嚴(yán)重影響荔枝品質(zhì)和產(chǎn)量。本文以霜疫霉病抗病品種‘黑葉和感病品種‘桂味成熟果實為材料，研究霜疫霉懸浮孢子接種后果皮中苯丙烷類代謝通路相關(guān)酶活性及代謝產(chǎn)物含量的變化，分析苯丙烷代謝通路與荔枝對霜疫霉侵染抗性的關(guān)系。研究結(jié)果表明：抗、感病品種接種霜疫霉菌后，其苯丙氨酸解氨酶（PAL）和過氧化物酶（POD）活性均有不同程度的提高，且抗性品種‘黑葉的POD活性高于感病品種‘桂味。與之相反，‘桂味的β-葡萄糖苷酶（BGLU）活性高于‘黑葉。抗性品種‘黑葉的總酚、類黃酮和花色素苷含量高于感病品種‘桂味，而‘桂味的香豆素含量高于‘黑葉。接種霜疫霉菌后，總酚、類黃酮和花色素苷含量隨貯藏時間的延長而逐漸下降，香豆素含量則有一定程度的升高。相關(guān)分析表明，上述指標(biāo)與病情指數(shù)顯著相關(guān)，暗示它們與荔枝對霜疫霉侵染的抗性密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞：荔枝霜疫霉病;苯丙烷類代謝;苯丙氨酸解氨酶;過氧化物酶;β-葡萄糖苷酶;香豆素

中圖分類號：S436.67.1????? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Effects of Phenylpropanoid Metabolism in Different Litchi Varieties During the Infection of Phytophthora litchii

CHEN Hao1，2， SUN Jinhua1， WANG Shujun1， LI Huanling1， WANG Guo1， WANG Jiabao1

1. Environment and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agriculture Sciences， Haikou， Hainan 571101， China; 2. College of Plant Sciences and Technology， Huazhong Agricultural University， Wuhan， Hubei 430070， China

Abstract： Litchi downy blight is the most serious disease in litchi， which leads to the yield and quality loss of fruit. In this work， the mature fruits of the disease-resistant variety ‘Heiye and the disease-susceptible variety ‘Guiwei inoculated with Phytophthora litchii infection were used to test the changes of enzymatic activities and metabolisms involved in phenylpropanoid metabolic pathway. The results indicated that the PAL （phenylalanine ammonia lyase） and POD （peroxidase） activity of the resistant and susceptible varieties increased following the infection of P. litchii. The activity of the two enzymes was higher in the resistant variety than that in the susceptible one. In contrast， the BGLU （beta-glucosidase） activity in ‘Guiwei was higher than that in ‘Heiye. The contents of total phenols， flavonoids and anthocyanins in ‘Heiye were higher than that in ‘Guiwei， and the contents of all the three types of metabolites in the two varieties decreased gradually with the extension of storage time. However， the content of coumarin increased in both cultivars. Correlation analysis showed that the enzyme activity and the content of phenylpropanoid metabolites were significantly correlated with the disease index， which suggested that the biosynthesis of phenylpropanoid metabolites is closely related to the resistance of litchi against P. litchii.

Keywords： litchi downy blight; phenylpropanoid metabolism; phenylalanine ammonia lyase; peroxidase; beta-glucosidase; coumarin

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.06.026

荔枝霜疫霉?。╨itchi downy blight）由荔枝霜疫霉（Phytophthora litchii）侵染引起，是荔枝（Litchi chinensis Sonn.）主要病害之一，在荔枝生長的各階段均可發(fā)生，主要侵染荔枝的嫩葉、幼莖、花和果實，嚴(yán)重時可導(dǎo)致荔枝減產(chǎn)80%，危害極其嚴(yán)重[1]。近年來，有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)苯丙烷類代謝通路及其代謝產(chǎn)物對植物抵御病原菌的入侵發(fā)揮重要作用。植物體在受到生物因素與非生物因素脅迫時，苯丙烷類代謝中一系列中間產(chǎn)物、轉(zhuǎn)化產(chǎn)物（如木質(zhì)素、黃酮類、香豆素、綠原酸等）及關(guān)鍵性酶類（如苯丙氨酸解氨酶、過氧還物酶、肉桂醇脫氫酶等）在植物生理活動中起著重要調(diào)控作用[2-3]。植物受到生物脅迫與非生物脅迫時，其苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性一般會增加，因而，PAL通常視為植物抗性的生理標(biāo)記[4]。過氧化物酶（POD）能夠催化多種酚類和非酚類化合物發(fā)生氧化還原，與植物防御功能緊密相關(guān)。諸多植物，如玉米、大豆、檸檬在真菌和病毒侵染過程中均顯示出過氧化物酶在防御反應(yīng)中的作用[5]。植物中β-葡萄糖苷酶（BGLU）能將木質(zhì)素水解形成葡萄糖，是該過程的關(guān)鍵限速酶，關(guān)系著植物細(xì)胞壁的建構(gòu)[6]?？偡?、類黃酮和花色素苷是苯丙烷類代謝中重要的次生代謝產(chǎn)物。研究發(fā)現(xiàn)，海棠在銹斑和鄰近組織中黃酮類、花色素苷的積累使得著色加深，表征防御機(jī)制的啟動[7]。酚類植物抗毒素表現(xiàn)出抗生素和抗真菌活性，在植物生長發(fā)育中起著重要作用[8]。植物受到病蟲害脅迫會分泌香豆素參與抗性過程，一方面作為植物抗毒素，自身特殊的氣味能防止病蟲危害;另一方面香豆素作為木質(zhì)素合成前體，在植物受到外界脅迫時有利于細(xì)胞壁的木質(zhì)化，提高植物的抗性作用[9]。目前，關(guān)于荔枝的霜疫霉病發(fā)病機(jī)制尚不清楚。前期研究發(fā)現(xiàn)，不同荔枝品種果實對霜疫霉侵染表現(xiàn)出不同抗性，通過評價鑒定得出‘黑葉和‘桂味分別對霜疫霉表現(xiàn)為穩(wěn)定抗病和穩(wěn)定感病[10]。本文研究霜疫霉侵染后，‘黑葉和‘桂味果皮中苯丙烷類代謝有關(guān)酶的活性及代謝產(chǎn)物含量的變化差異，探究苯丙烷類代謝在荔枝抗霜疫霉病中的作用，為進(jìn)一步揭示荔枝對霜疫霉病的抗病機(jī)制，研發(fā)防控技術(shù)提供依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

采集‘黑葉和‘桂味八成熟果實，在1 d內(nèi)運(yùn)往實驗室進(jìn)行預(yù)處理。挑選成熟度一致、無損傷的健康果實，用蒸餾水清洗2次，室溫條件下晾干10 min，備用。

將長滿培養(yǎng)皿的霜疫霉菌（菌株HK-Ⅰ，本實驗室分離保存）輕輕刮入純水中，計算孢子濃度，配置濃度為4106個/mL孢子懸浮液。通過懸浮孢子液浸泡果實人工接種霜疫霉菌于上述果實，以不接種果實為對照。處理和對照果實置于保鮮盒中，每20個果實放置1個保鮮盒，果實之間彼此分開，均勻分布。

分別在接種后0、24、48、72、96 h時取樣，每個時間點(diǎn)3個生物學(xué)重復(fù)，每個生物學(xué)重復(fù)20個果實。用干凈的解剖刀小心剝離病健交界處果皮，使之不粘連果肉與果汁，液氮速凍，在高速研磨儀上研磨成粉，置于–80 ℃下冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2? 方法

1.2.1? 病情調(diào)查與統(tǒng)計? 以接菌0 h的果實為準(zhǔn)，每24 h觀察1次果實發(fā)病情況，依據(jù)病情分級標(biāo)準(zhǔn)（表1）統(tǒng)計果實發(fā)病嚴(yán)重程度（果實病斑面積占果實面積比例），計算病情指數(shù)，至大部分果實發(fā)病。

病情指數(shù)=∑（s×n）/（N×S）×100（注：s為各級病情級別，n為各級別病果數(shù)，N為總果數(shù)，S為最高病情級別）。

1.2.2? 提取液的制備? 研缽先用液氮預(yù)冷，果皮粉末在液氮條件下繼續(xù)研磨。取研磨后的果皮粉末樣品1.0 g于10 mL離心管，低溫條件下加入5.0 mL預(yù)冷的0.1 mol/L硼酸緩沖液（pH為8.8含0.1 g PVPP），渦旋震蕩30 s，12 000 r/min、4 ℃下離心30 min，收集上清液用于酶活性測定。

取上述研磨過的果皮粉末樣品0.5 g于5 mL離心管中，低溫條件下加入1 mL預(yù)冷80%甲醇水溶液，渦旋震蕩30 s，4 ℃條件下127 r/min搖床震蕩提取12 h，然后12 000 r/min、4 ℃下離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)入10 mL離心管中。將第一次提取殘渣重復(fù)上述步驟提取一次，收集最后提取液并定容至相同體積，最后提取液過0.22 μm濾膜，濾液用于香豆素含量測定。

1.2.3? 測定方法? 苯丙氨酸解氨酶（PAL）、過氧化物酶（POD）、β-葡萄糖苷酶（BGLU）、總酚、類黃酮、花色素苷的測定方法參照曹建康等[11]的方法;香豆素的測定方法參照馬杰等[12]的方法。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

使用DPS數(shù)據(jù)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理[13]，采用Excel軟件進(jìn)行繪制圖表。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 接種霜疫霉菌后荔枝病情指數(shù)的變化

荔枝未接種霜疫霉菌時，‘黑葉與‘桂味病情指數(shù)隨時間變化不大。接種霜疫霉菌后，‘黑葉與‘桂味的病情指數(shù)均隨時間呈逐漸上升趨勢;2個品種的病情指數(shù)均在48 h開始急劇上升，此后均顯著高于對照，96 h達(dá)到最大值?？傮w而言，接菌處理后，‘桂味病情指數(shù)的升高幅度明顯大于‘黑葉（圖1）。

2.2? 接種霜疫霉菌對荔枝果皮PAL、POD、BGLU活性的影響

2.2.1? PAL活性的變化? 未接種霜疫霉菌的對照果實中，‘黑葉與‘桂味果皮的PAL活性均隨時間平穩(wěn)上升，但‘黑葉的PAL活性高于‘桂味。接種霜疫霉菌后，‘黑葉與‘桂味的PAL活性均呈逐漸上升趨勢，且高于對照;‘桂味果皮PAL活性在24～48 h迅速上升，72 h時的PAL活性與‘黑葉相當(dāng)，此后PAL活性繼續(xù)緩慢升高;‘黑葉果皮PAL活性的變化幅度小于‘桂味（圖2A）。

2.2.2? POD活性的變化? 未接種霜疫霉菌的對照果實中，‘黑葉與‘桂味果皮的POD活性均隨時間平穩(wěn)上升，但‘黑葉的POD活性高于‘桂味。接種霜疫霉菌后，‘黑葉與‘桂味的POD活性均呈逐漸上升趨勢，且高于對照;‘桂味果皮的POD活性在0～24 h迅速升高，96 h時的POD活性與‘黑葉接近;‘黑葉果皮POD活性的變化幅度小于‘桂味（圖2B）。POD與病情指數(shù)呈正相關(guān)（r=0.425*，P<0.05）。

2.2.3? BGLU活性的變化? 未接種霜疫霉菌的對照果實中，‘黑葉與‘桂味果皮的BGLU活性均隨時間平穩(wěn)上升，但‘桂味的BGLU活性高于‘黑葉。接種霜疫霉菌后，‘黑葉與‘桂味的BGLU活性均呈逐漸上升趨勢，且高于對照;‘桂味果皮的BGLU活性在24～48 h迅速升高，此后BGLU活性繼續(xù)緩慢上升，‘桂味的BGLU活性明顯高于‘黑葉;‘桂味果皮BGLU活性的變化幅度大于‘黑葉（圖2C）。

2.3? 接種霜疫霉菌對荔枝果皮總酚、類黃酮、花色素苷含量的影響

2.3.1? 總酚含量變化? 未接種霜疫霉菌的對照果實中，‘黑葉與‘桂味果皮的總酚含量均隨時間逐漸降低，但‘黑葉的總酚含量高于‘桂味。接種霜疫霉菌后，‘黑葉與‘桂味的總酚含量均呈逐漸下降趨勢，且低于對照;96 h時2個品種果皮的總酚含量均達(dá)最低值;‘黑葉的總酚含量總體高于‘桂味（圖3A）。總酚含量與病情指數(shù)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.720**，P<0.01）。

2.3.2? 類黃酮含量變化? 未接種霜疫霉菌的對照果實中，‘黑葉與‘桂味果皮的類黃酮含量

隨時間變化不大，但‘黑葉的類黃酮含量高于‘桂味。接種霜疫霉菌后，‘黑葉與‘桂味的類黃酮含量均呈逐漸下降趨勢，且低于

對照;‘黑葉果皮的類黃酮含量在0～24 h迅速下降，此后，2個品種的果皮類黃酮含量均緩慢下降;‘黑葉果皮類黃酮含量均高于‘桂味（圖

3B）。類黃酮含量與病情指數(shù)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.698**，P<0.01）。

2.3.3? 花色素苷含量變化? 未接種霜疫霉菌的對照果實中，‘黑葉與‘桂味果皮中花色素苷含量均隨時間逐漸下降，但‘黑葉的花色素苷含量高于‘桂味。接種霜疫霉菌后，‘黑葉與‘桂味的花色素苷含量均呈逐漸下降趨勢;在接種霜疫霉菌48 h后，2個品種的果皮花色素苷含量均開始急劇下降，且低于對照，96 h時2個品種的果皮花色素苷含量均達(dá)最低值;‘黑葉的花色素苷含量高于‘桂味（圖3C）?；ㄉ剀蘸颗c病情指數(shù)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.633**，P<0.01）。

2.4? 接種霜疫霉菌對荔枝果皮香豆素含量的影響

未接種霜疫霉菌的對照果實中，‘桂味果皮的香豆素隨時間平穩(wěn)上升，而‘黑葉的香豆素含量則無明顯變化，但‘桂味的香豆素含量高于‘黑葉。接種霜疫霉菌后，‘黑葉與‘桂味的香豆素含量均呈上升趨勢;在接種霜疫霉菌24～48 h，‘黑葉果皮的香豆素含量迅速上升;48 h時，2個品種的香豆素含量相當(dāng)，此后，黑葉的香豆素含量呈緩慢下降趨勢，而‘桂味的香豆素含量則持續(xù)上升，96 h時達(dá)最大值?？傮w而言，接種霜疫霉后，2個品種果皮香豆素含量均高于對照，‘桂味的香豆素含量高于‘黑葉（圖4）。香豆素含量與病情指數(shù)呈正相關(guān)（r=0.637**，P<0.01）。

3? 討論

PAL、POD、BGLU是苯丙烷類代謝中的關(guān)鍵性酶類。PAL和POD與植物抗病性聯(lián)系緊密，可以作為反映植物抗性水平的重要指標(biāo)[14]。植物抗病性研究中植物細(xì)胞壁是抵御外來生物與非生物因子脅迫的第一道防護(hù)屏障，BGLU在其中起重要作用：一方面，參與植物細(xì)胞壁木質(zhì)化的過程，從而影響植物對外界病蟲生物的防御;另一方面，它使得植物中的激素和芳香化合物得以釋放[15-16]。植物中的BGLU活性高有利于植物形成木質(zhì)素和香豆素共同構(gòu)建防御病原菌的結(jié)構(gòu)與物質(zhì)安全防護(hù)層，有效抑制病原菌在植株中的擴(kuò)展和為害[17]。接種霜疫霉菌后，抗病品種‘黑葉的POD、PAL、BGLU活性隨發(fā)病程度的加深而逐漸升高，而感病品種‘桂味的PAL、POD、BGLU酶活性則快速上升，酶活性的變化幅度較大，由于自身物質(zhì)代謝基礎(chǔ)弱，需要合成具有殺菌或抑菌活性的香豆素，因此對病原菌的侵染表現(xiàn)敏感。

植物通過分泌植物抗毒素——香豆素，散發(fā)出一種特殊氣味，能有效防止病蟲的危害，生物合成香豆素對植物抵御真菌病害發(fā)揮著重要作

用[18]。受到霜疫霉菌侵染后，感病品種‘桂味的抗性關(guān)鍵酶活性大幅提升，加快合成發(fā)揮主要抗菌作用的物質(zhì)——香豆素;抗病品種‘黑葉受到霜疫霉菌侵染后抗性關(guān)鍵酶活性上升，但變化幅度不大。抗病品種‘黑葉植株體內(nèi)原始積累的總酚、類黃酮、花色素苷高于感病品種‘桂味，這類物質(zhì)對霜疫霉有很好的抗性，因此在抗病品種‘黑葉中香豆素并不是發(fā)揮主導(dǎo)作用的抗菌物質(zhì)。

總酚、花色素苷等酚類物質(zhì)在植物果皮中大量存在，且具有較高的生物活性和抑菌作用[19]。通過研究發(fā)現(xiàn)，荔枝及龍眼果實中活性氧及酚類代謝中POD活性增加，總酚和花色素苷含量明顯下降[20-21]。本研究發(fā)現(xiàn)，接種霜疫霉菌后，抗、感病荔枝品種果皮的總酚、花色素苷、花色素苷含量均呈遞減趨勢，且低于對照，抗病品種的總酚、類黃酮、花色素苷含量高于感病品種。由此表明，酚酸類物質(zhì)對植物抗病性的作用主要體現(xiàn)在荔枝品種本身的酚酸類物質(zhì)含量有關(guān)，而與荔枝接菌后酚酸類物質(zhì)含量的變化關(guān)系不緊密。

相關(guān)性分析顯示，病情指數(shù)與PAL、POD、BGLU活性呈極顯著正相關(guān)，與類黃酮、花色素苷、總酚含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，而與香豆素含量呈極顯著正相關(guān)。說明這些酶活性和物質(zhì)含量的變化顯著影響了荔枝果實的發(fā)病進(jìn)程，2個品種接種霜疫霉菌后發(fā)病進(jìn)程不同，與這些物質(zhì)含量和酶活性在成熟果皮中的本底大小及接種后的變化有關(guān)。

綜上分析，感病品種‘桂味接種霜疫霉菌后，隨著發(fā)病程度加深，抗性關(guān)鍵酶迅速調(diào)控香豆素的生物合成，并與總酚、類黃酮、花色素苷迅速聯(lián)合作用參與對病原菌的防御，表現(xiàn)出對病原菌侵染較敏感;抗病品種‘黑葉主要依靠自身原始積累的高含量總酚、類黃酮、花色素苷進(jìn)行積極防御，表現(xiàn)出較強(qiáng)抗性?？埂⒏胁±笾ζ贩N受到霜疫霉菌侵染后，果實發(fā)病越嚴(yán)重，苯丙烷類代謝中關(guān)鍵性酶變化和代謝產(chǎn)物生物合成趨向抵御不良生物因素方向發(fā)展，不同荔枝品種苯丙烷類代謝產(chǎn)物生物合成側(cè)重點(diǎn)因品種抗性差異而不同。

參考文獻(xiàn)

[675]?? Liu J， Liu A， Chen W. Studies on the biological characteristics of lychee downy blight[J]. Acta Horticulturae， 2005（665）： 415-420.

[676]?? Ngadze E， Icishahayo D， Coutinho T A， et al. Role of polyphenol oxidase， perodase， phenylalanine ammonia lyase， chlorogenic acid and total soluble phennols in ressistance of potatoes to soft rot[J]. Plant Disease， 2012， 96（2）： 186-192.

[677]?? Kamila K. The role of phenolic compounds in plant resistance[J]. Biotechnology and Food Sciences， 2016， 80（2）： 97-108.

[678]?? Pandey V P， Bhagat P K， Prajapati R， et al. A defense associated peroxidase from lemon having dye decolorizing ability and offering resistance to heat， heavy metals and organic solvents[J]. Biochemistry & Analytical Biochemistry， 2016， 5（3）： 1-10.

[679]?? Minaevaa O M， Akimovaa E E， Tereshchenkoa N N， et al. Effect of Pseudomonas bacteria on peroxidase activity in wheat plants when infected with Bipolaris sorokiniana[J]. Russian Journal of Plant Physiology， 2018， 65（5）： 717-725.

[680]?? Lu Y F， Chen Q， Bu Y F， et al. Flavonoid accumulation plays an important role in the rust resistance of malus plant leaves[J]. Front Plant Science， 2017， 8（5）： 1286.

[681]?? 孫明霞， 王寶增， 范? 海， 等. 葉片中的花色素苷及其對植物適應(yīng)環(huán)境的意義[J]. 植物生理學(xué)通訊， 2003（6）： 688-694.

[682]?? 丁? 銳. 國外花色素苷的研究現(xiàn)狀與進(jìn)展[J]. 漢中師范學(xué)院學(xué)報（自然科學(xué)）， 2004（6）： 73-78.

[683]?? 王富剛， 陳? 花， 艾銀婷， 等. 香豆素在植物Priming過程中的作用[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)， 2017， 36（5）： 2094-2096.

[684]? 曹璐璐， 孫進(jìn)華， 王家保. 荔枝果實對霜疫霉侵染抗性評價體系建立及初步應(yīng)用[J]. 熱帶作物學(xué)報， 2017， 38（1）： 126-130.

[685]?? 曹建康， 姜微波， 趙玉梅. 果蔬采后生理生化試驗指導(dǎo)[M]. 北京： 中國輕工業(yè)出版社， 2007： 123-135.

[686]?? 馬? 杰， 胡文忠， 畢? 陽， 等. 鮮切果蔬苯丙烷代謝的研究進(jìn)展[J]. 食品工業(yè)科技， 2012， 33（15）： 391-393.

[687]?? Tang Q Y， Zhang C X. Data Processing System （DPS） software with experimental design， statistical analysis and data mining developed for use in entomological research[J]. Insect Science， 2013， 20（2）： 254-260.

[688]?? Zhang C Z， Wang X， Zhang F， et al. Phenylalanine ammonia-lyase2.1 contributes to the soybean response towards Phytophthora sojae infection[J]. Scientific Reports， 2017， 7（6）： 323-329.

[689]?? Vaiyapuri Balasubramanian， Divya V， Jean C， et al. Plant β-1，3-glucanases： Their biological functionsand transgenic expression against phytopathogenic fungi[J]. Biotechnology Letters， 2012， 34（11）： 1983-1990.

[690]?? James R， Asim E. β-Glucosidases[J]. Cellular and Molecular Life Sciences， 2010， 67（20）： 3389-3405.

[691]?? 李慶亮， 李? 捷， 李夏鳴， 等. 細(xì)胞壁降解酶在蘋果霉心病菌致病過程中的作用研究[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報， 2015， 31（31）： 90-95.

[692]? 張珊珊， 翟偉卜， 郭慧敏， 等. 香豆素合成途徑關(guān)鍵酶基因Ghpal、Ghc4h和Gh4cl在棉花抗鏈格孢菌中的作用[J]. 植物病理學(xué)報， 2017， 47（2）： 214-223.

[693]?? 呂澤芳， 江? 東， 于? 杰. 若干錦橙品種果皮酚類物質(zhì)及其抗氧化與抑菌作用[J]. 果樹學(xué)報， 2017， 34（2）： 215-223.

[694]?? Wang J B， Wang X S， Xu B Y， et al. Physiological changes during the process of pericarp browning in the postharvest lithchi[J]. Agricultural Science & Technology， 2010， 11（5）： 10-16.

[695]?? 林河通， 席玙芳， 陳紹軍. 龍眼果實采后失水果皮褐變與活性氧及酚類代謝的關(guān)系[J]. 植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報， 2005， 31（3）： 287-297.

責(zé)任編輯：謝龍蓮