野生黃精離體快繁技術(shù)體系的優(yōu)化

曾文丹 曹升 尚小紅 陸柳英 肖亮 嚴(yán)華兵

摘? 要：以野生黃精不定芽為材料，以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6-BA、2，4-D、NAA、KT進(jìn)行3因素4水平的正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，篩選黃精增殖的最佳培養(yǎng)條件;探討不同培養(yǎng)溫度對(duì)黃精組培苗繼代增殖的影響;以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，探討不同生長(zhǎng)素及其濃度和不同培養(yǎng)容器對(duì)組培苗生根的影響。結(jié)果表明，黃精組培苗最佳繼代增殖培養(yǎng)基為MS + 2.0 mg/L 6-BA + 0.2 mg/L 2，4-D + 0.4 mg/L NAA，最佳培養(yǎng)溫度為22 ℃，平均繁殖系數(shù)達(dá)6.88;最佳生根培養(yǎng)基為1/2 MS + 0.5 mg/L NAA + 0.2 mg/L IBA，平均生根率達(dá)96.2%;接種袋是黃精工廠化育苗的首選生根培養(yǎng)容器。

關(guān)鍵詞：黃精;離體快繁;叢生芽

中圖分類號(hào)：S567.23????? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Optimization of Rapid Propagation Technology of Polygonatum

sibiricum

ZENG Wendan1，2， CAO Sheng1， SHANG Xiaohong1， LU Liuying1， XIAO Liang1， YAN Huabing1

1. Cash Crops Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning， Guangxi 530007， China; 2. Guangxi Crop Genetic Improvement and Biotechnology Key Lab， Nanning， Guangxi 530007， China

Abstract： In order to establish the optimum culture condition of Polygonatum sibiricum， the adventitious buds were used as the explants and MS as the basic medium to study the effects of different culture temperature and plant growth regulators （6-BA， 2，4-D， NAA， KT） with an orthogonal experimental design L9 （34） on multiplication and plant regeneration in vitro. 1/2 MS was used as the basic medium to study the effects of different plant growth regulators and culture vessel on rooting of tissue cultured plantlets. The optimal multiplication medium was MS + 2.0 mg/L 6-BA +? 0.2 mg/L 2，4-D + 0.4 mg/L NAA. The optimal culture temperature was 22 ℃ and the average proliferation coefficient reached 6.88. The optimal rooting medium was 1/2 MS + 0.5 mg/L NAA + 0.2 mg/L IBA， and the average frequency of shoot rooting reached 96.2%. Inoculation bag was the first choice culture vessel for large-scale production of P. sibiricum.

Keywords： Polygonatum sibiricum; rapid propagation; multiple shoots

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.06.011

黃精（Polygonatum sibiricum）為百合科黃精屬多年生草本植物，具有補(bǔ)中益氣、益腎填精、滋陰潤(rùn)肺，生津補(bǔ)脾之功效[1-2]。目前黃精的主要繁殖方式為根莖繁殖和種子繁殖。但根莖繁殖方法不僅用種量大，且繁殖系數(shù)低;種子繁殖方法雖繁殖系數(shù)較高，但成苗時(shí)間久，一般種子繁殖移栽苗需3年時(shí)間。組織培養(yǎng)技術(shù)具有繁殖系數(shù)高、不受外界環(huán)境條件限制等特點(diǎn)，因此，利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)建立黃精組培苗規(guī)模化生產(chǎn)技術(shù)體系是生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)黃精種苗的有效途徑。近年來(lái)，有關(guān)黃精離體快繁技術(shù)已開(kāi)展部分研究。周新華等[3]利用均勻設(shè)計(jì)及其分析方法篩選出黃精不定芽增殖的最佳激素組合為1.49 mg/L KT和0.29 mg/L NAA;呂煜夢(mèng)等[4]研究發(fā)現(xiàn)4.0 mg/L 6-BA和0.2 mg/L NAA激素組合對(duì)三明野生黃精不定芽的誘導(dǎo)效果最佳;張瑜等[5]認(rèn)為低濃度的TDZ對(duì)不定芽的誘導(dǎo)和生長(zhǎng)有促進(jìn)作用;徐紅梅等[6]研究發(fā)現(xiàn)TDZ雖有利于多花黃精愈傷組織的分化，但對(duì)分化芽的進(jìn)一步生長(zhǎng)有抑制作用，易形成葉片變厚和不規(guī)則彎曲的變態(tài)葉。孫駿威等[7]通過(guò)研究不同細(xì)胞分裂素對(duì)黃精不定芽誘導(dǎo)及其增殖效果的影響發(fā)現(xiàn)，ZT對(duì)不定芽誘導(dǎo)效果最優(yōu)，6-BA次之，KT對(duì)不定芽繼代增殖的作用效果最差。本研究以前期獲得的經(jīng)愈傷組織分化產(chǎn)生的不定芽為外植體材料，利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，探討不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)黃精不定芽繼代增殖的影響;通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)容器，提高繁殖系數(shù)，降低生產(chǎn)成本，以實(shí)現(xiàn)黃精組培苗規(guī)模化，產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

參考呂煜夢(mèng)等[4]對(duì)野生黃精無(wú)菌體系建立的方法，經(jīng)愈傷組織分化產(chǎn)生的不定芽為試驗(yàn)材料。

激素標(biāo)準(zhǔn)品6-BA、2，4-D、NAA、KT、IBA，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2? 方法

1.2.1? 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及其濃度對(duì)黃精組培苗繼代增殖的影響? 采用L9（34）正交設(shè)計(jì)，以MS為基本培養(yǎng)基，設(shè)置6-BA（1、2、3 mg/L）、2，4-D （0.1、0.2、0.4 mg/L）、NAA（0、0.2、0.4 mg/L）、KT（0、1.0、2.0 mg/L）作為試驗(yàn)因子，每個(gè)因子設(shè)置3個(gè)水平，具體設(shè)計(jì)方法如表1所示，試驗(yàn)共有9個(gè)處理。每個(gè)處理接種5瓶，每瓶接種6個(gè)外植體，重復(fù)3次。接種30 d后統(tǒng)計(jì)繁殖系數(shù)。

1.2.2? 不同培養(yǎng)溫度對(duì)黃精組培苗繼代增殖的影響? 將獲得的黃精不定芽置于3種不同培養(yǎng)溫度即22、25、28 ℃人工氣候箱培養(yǎng)，每個(gè)處理接種5瓶，每瓶接種6個(gè)外植體，重復(fù)3次。接種30 d后統(tǒng)計(jì)繁殖系數(shù)并觀察植株生長(zhǎng)情況。

1.2.3? 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及其濃度對(duì)黃精組培苗生根的影響? 將株高3～4 cm的組培苗接種于附加0.2～1.0 mg/L NAA和0.2～1.0 mg/L IBA的1/2 MS培養(yǎng)基中。每個(gè)處理接種5瓶，每瓶接種6個(gè)外植體，重復(fù)3次。接種30 d后統(tǒng)計(jì)生根率、根數(shù)和平均根長(zhǎng)，觀察植株生長(zhǎng)情況。

1.2.4? 不同培養(yǎng)容器對(duì)黃精組培苗生根的影響? 將株高3～4 cm的組培苗分別接種于瓶裝和袋裝培養(yǎng)基中，其培養(yǎng)基均為1/2 MS+ 0.5 mg/L NAA+ 0.2 mg/L IBA。每個(gè)處理接種5瓶，每瓶接種6個(gè)外植體，重復(fù)3次。接種30 d后統(tǒng)計(jì)生根率、根數(shù)和平均根長(zhǎng)，觀察植株生長(zhǎng)情況。

1.2.5? 培養(yǎng)條件? 除特殊說(shuō)明外，培養(yǎng)溫度均為（22±1）℃、光照強(qiáng)度1500～2000 lx、光照時(shí)間為12 h/d。培養(yǎng)基均添加30.0 g/L蔗糖和6.0 g/L瓊脂粉，pH 5.8。

1.2.6? 煉苗和移栽? 參考曾文丹等[8]煉苗及移栽方法進(jìn)行黃精組培苗移栽。移栽基質(zhì)為珍珠巖︰草炭土（體積比3︰1）。

1.3? 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0和Excel 2010軟件進(jìn)行整理、統(tǒng)計(jì)和分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 黃精組培苗繼代增殖的適宜培養(yǎng)基

將帶愈傷組織的不定芽轉(zhuǎn)入繼代增殖培養(yǎng)基，10 d后切口邊緣開(kāi)展形成新的愈傷組織，20 d后愈傷組織出現(xiàn)芽點(diǎn)，形成新的不定芽。隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移，不定芽葉片逐漸展開(kāi)，形成植株（圖1A、圖1B、圖1C）。9種不同培養(yǎng)基誘導(dǎo)不定芽的繁殖系數(shù)見(jiàn)表1，其中以處理5獲得的繁殖系數(shù)最高（6.32），且植株長(zhǎng)勢(shì)旺盛，葉片生長(zhǎng)正常。根據(jù)正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明， 4因素的極差值大小順序?yàn)?-BA>NAA>2，4-D> KT，即6-BA對(duì)不定芽繼代增殖的影響最大，其次為NAA，而KT對(duì)不定芽繼代增殖的影響最?。ū?）。表2方差分析結(jié)果表明，僅6-BA與不定芽繁殖系數(shù)顯著相關(guān)（P<0.05），其F值最高，為3.029。說(shuō)明黃精組培苗在繼代增殖過(guò)程中，6-BA是影響黃精組培苗繁殖系數(shù)的最關(guān)鍵因素。

2.2? 黃精組培苗繼代增殖的適宜溫度

不同培養(yǎng)溫度對(duì)黃精組培苗繼代增殖的影響如表3所示，當(dāng)培養(yǎng)溫度為22 ℃，繁殖系數(shù)最高，為6.88，且不定芽生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，植株生長(zhǎng)茂盛，葉片濃綠。隨著培養(yǎng)溫度的升高，繁殖系數(shù)降低，生長(zhǎng)勢(shì)變?nèi)?，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移，葉片逐漸變黃。當(dāng)培養(yǎng)溫度為30 ℃時(shí)，繁殖系數(shù)極顯著降低，僅為4.27，且不定芽葉片黃化現(xiàn)象嚴(yán)重。由試驗(yàn)結(jié)果得知，黃精組培苗繼代增殖的最佳培養(yǎng)溫度為22 ℃。

2.3? 黃精組培苗生根適宜培養(yǎng)基

由表4可知，添加不同濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，黃精組培苗均可生根。當(dāng)培養(yǎng)基中單獨(dú)添加NAA時(shí)，隨著其濃度的增加，組培苗的生根率呈先增加后降低的趨勢(shì)，添加0.5 mg/L NAA時(shí)，組培苗生根率最高，為81.7%。但添加1.0 mg/L NAA時(shí)，組培苗的根數(shù)和平均根長(zhǎng)最長(zhǎng)，分別為5.37和1.99 cm。當(dāng)培養(yǎng)基中單獨(dú)添加IBA時(shí)，組培苗也均可生根，但生根率、根數(shù)、平均根長(zhǎng)等均小于單獨(dú)添加NAA誘導(dǎo)的組培苗。以培養(yǎng)基中添加0.5 mg/L NAA和0.2 mg/L IBA 2種生長(zhǎng)素時(shí)，組培苗的生根率最高，且根數(shù)最多（圖1D、圖1E），分別為96.2%和5.53。

2.4? 黃精組培苗生根的適宜培養(yǎng)容器

由表5可知，采用組培瓶作為生根培養(yǎng)容器時(shí)，黃精組培苗的生根率、根數(shù)和平均根長(zhǎng)雖均高于以接種袋為培養(yǎng)容器，但二者差異不顯著。接種袋具有成本低、操作簡(jiǎn)單、空間利用率高的優(yōu)點(diǎn)，是工廠化育苗的首選容器。

2.5? 組培苗移栽

將所獲生根組培苗移栽至珍珠巖︰草炭土（3∶1）混合基質(zhì)中，30 d后組培苗移栽成活率達(dá)81%，其生長(zhǎng)良好（圖1F）。

3? 討論

在植物組織培養(yǎng)工作中，激素的種類組合及其濃度是影響植物愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生的關(guān)鍵性因素之一，在激素種類較多時(shí)，需選用高效快速的方法找出最佳激素組合及其濃度。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法是進(jìn)行植物離體快繁技術(shù)研究較簡(jiǎn)便、快捷且行之有效的方法[9-11]。孫英坤等[12]利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)成功建立了瀕危物種堇葉紫金牛高效組培快繁技術(shù)體系，推測(cè)基本培養(yǎng)基類型是叢生芽誘導(dǎo)和壯苗培養(yǎng)的關(guān)鍵影響因子，同時(shí)也是影響組培苗生根率的決定性因子;而IBA的濃度是影響根系數(shù)量和根系長(zhǎng)度的決定性因子。彭斯文等[13]利用正交試驗(yàn)方法篩選出杜鵑蘭組培快繁的適宜培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基配方。陳雨露等[14]采用4因素4水平的正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，篩選出康乃馨試管開(kāi)花的最佳培養(yǎng)條件，開(kāi)花率可達(dá)87%。本研究通過(guò)正交試驗(yàn)探討6-BA、2，4-D、NAA和KT對(duì)黃精不定芽繼代增殖的影響發(fā)現(xiàn)，6-BA與不定芽繁殖系數(shù)呈現(xiàn)顯著相關(guān)，其F值最高，說(shuō)明6-BA對(duì)不定芽繼代增殖的影響最大，NAA影響次之，KT影響最小。繼代增殖培養(yǎng)基中不添加KT有利于黃精不定芽的增殖，這與吳宇函等[15]的研究結(jié)果不同，這可能與外植體來(lái)源不同、誘導(dǎo)組培苗的狀態(tài)不同或黃精種源等不同有關(guān)。葉雨心等[16]研究發(fā)現(xiàn)KT和2，4-D對(duì)多花黃精愈傷組織的誘導(dǎo)起主要作用，說(shuō)明不同植物激素在植物不同誘導(dǎo)階段起著主要作用。

適宜的培養(yǎng)溫度是植物在離體培養(yǎng)條件下獲得較優(yōu)分化能力的一個(gè)重要因素。不同植物適宜的培養(yǎng)溫度不同，如海三棱藨草[17]繼代增殖的適宜溫度為30 ℃，番茄[18]的為28 ℃，而馬尾松[19]、西藏虎頭蘭[20]適宜溫度為20 ℃。本研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)溫度高于22 ℃時(shí)，隨培養(yǎng)時(shí)間的推移，黃精組培苗葉片易衰老黃化，生長(zhǎng)勢(shì)變?nèi)酰a(chǎn)生的愈傷組織易褐化，繁殖系數(shù)降低。這一研究結(jié)果與蘇娟等[21]的研究結(jié)果一致。研究結(jié)果表明野生黃精組培苗適宜培養(yǎng)溫度與在自然條件下喜蔭涼的自然屬性一致。

組培苗生根率的高低是能否規(guī)?；a(chǎn)的關(guān)鍵因素之一，生長(zhǎng)素IBA和NAA在植物分化不定根的過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。研究人員[22-24]通過(guò)探討不同生長(zhǎng)素對(duì)黃精組培苗生根的影響發(fā)現(xiàn)，IBA比2， 4-D、NAA更適合誘導(dǎo)黃精組培苗生根。本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的NAA和IBA均能誘導(dǎo)黃精組培苗的生根，且NAA對(duì)不定根的誘導(dǎo)能力較IBA強(qiáng)，這與周新華等[25]的研究結(jié)果一致。當(dāng)培養(yǎng)基添加0.5 mg/L NAA和0.02 mg/L IBA時(shí)，組培苗生根率最高，為96.2%。

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責(zé)任編輯：崔麗虹