復(fù)合工藝制備表面分級(jí)多孔的鈦合金及生物相容性研究*

吳麗煌，金明江，劉劍楠，韓 婧，金學(xué)軍，2

(1. 上海交通大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200240； 2.上海交通大學(xué) 醫(yī)療機(jī)器人研究中心，上海 200240；3. 上海交通大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 上海第九人民醫(yī)院，上海 200011)

0 引 言

純鈦及鈦合金是生物植入假體的首選材料之一。全異質(zhì)純鈦假體雖然具有良好的生物相容性，但由于純鈦的彈性模量遠(yuǎn)高于自然骨的彈性模量，純鈦假體植入在臨床上的失敗率仍然高達(dá)60%～70%，這也制約著全異質(zhì)種植體種植技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用[1]。近年來，高強(qiáng)低模的β鈦合金成為純鈦的主要替代材料，受到越來越多的關(guān)注[2-3]。有研究表明，全異質(zhì)種植體只有與自體骨整合才能與口腔軟組織有機(jī)結(jié)合，在種植體表面引入微納分級(jí)的多孔粗糙結(jié)構(gòu)，將為種植體的表面帶來更大的比表面積，同時(shí)增加種植體表面的粗糙層厚度并改善表面潤(rùn)濕性，這會(huì)有利于靶蛋白的接觸、成骨細(xì)胞的粘附，從而有利于新生骨組織長(zhǎng)入種植體，促進(jìn)種植體與新生骨組織牢固地結(jié)合，最終實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定、快速的骨整合[4-5]。

表面改性技術(shù)能使鈦合金材料在具備優(yōu)良力學(xué)性能的同時(shí)，具有更好的生物活性和生物相容性[6-7]。鈦合金種植體表面的開放、連通的微納分級(jí)結(jié)構(gòu)模擬了骨小梁的層次復(fù)雜性，微米結(jié)構(gòu)和納米孔的結(jié)合會(huì)對(duì)細(xì)胞增殖和分化產(chǎn)生復(fù)合效應(yīng)，進(jìn)而在植入愈合過程中促進(jìn)成骨組織的生長(zhǎng)[8-10]。鈦合金種植體的親水性對(duì)于其生物相容性能有著關(guān)鍵的作用，更高的親水性具有更利于蛋白質(zhì)和細(xì)胞粘附的特性，進(jìn)而也能提高細(xì)胞在材料表面增殖分化的能力[11]。種植體表面潤(rùn)濕性提升后，將更利于其周圍體液的擴(kuò)散，促進(jìn)周圍堿性環(huán)境的形成，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的黏附、增殖與分化[12]。

最常見的引入多孔結(jié)構(gòu)的表面改性方法包括陽極氧化、去合金化、堿熱處理、3D打印[13-15]，而去合金化、3D打印的成本相對(duì)較高。經(jīng)噴丸、雙酸酸蝕、堿熱反應(yīng)復(fù)合工藝處理得到的微納分級(jí)多孔結(jié)構(gòu)，比用陽極氧化處理得到的的納米管陣列形貌的潤(rùn)濕性更好[16]。本文的研究采用了在噴丸后，用HCl和H2SO4混合溶液進(jìn)行雙酸酸蝕，并用NaOH溶液進(jìn)行堿熱處理的工藝方法，這種復(fù)合工藝的成本較低，并且可以穩(wěn)定地在種植體表面形成具有超親水性的微納分級(jí)多孔結(jié)構(gòu)。通過表面改性的方法，可以在鈦合金材料表面引入微納分級(jí)多孔結(jié)構(gòu)，從而改善種植體材料表面的潤(rùn)濕性、CaP沉積能力等生物相容性能。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 鈦合金樣品的制備

將純度≥99.95%的鈦片、純度≥99.95%的鈮顆粒、純度≥99.95%的鋯塊以及純度≥99.95%的錫顆粒，按表 1質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行配比后熔煉得到合金錠。本文采用的冷坩堝懸浮熔煉技術(shù)是將多種金屬逐一添加至熔爐中，確保每次熔煉都能將固體金屬和液體合金熔勻；另外，在熔煉過程中，金屬全部融化后，將合金溶液在高功率下停留2 min，以確保合金成分?jǐn)U散得足夠均勻；最后，在合金錠出爐后，將合金錠翻轉(zhuǎn)重熔2遍，以確保最終得到的合金錠成分分布均勻。合金熔煉完成后，將合金錠在1 173 K下反復(fù)軋制至厚度為2 mm的薄板，然后在真空石英管中1 173 K下固溶處理30 min，然后將合金薄板常溫儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

表1 本研究采用的合金配比參數(shù)

1.2 鈦合金樣品的表面處理

本研究采用的復(fù)合工藝包括：噴丸、雙酸酸蝕、堿熱處理。所有待噴丸的樣品都采用統(tǒng)一的實(shí)驗(yàn)參數(shù)：噴丸壓力為0.5 MPa，噴丸角度為45°，噴丸距離為10 mm，噴砂選用直徑為400 μm的SiO2顆粒，噴丸時(shí)間為30 s；雙酸酸蝕采用的混合溶液包含濃度為6.10 mol/L HCl和濃度為8.86 mol/L H2SO4，反應(yīng)溫度為80 ℃，反應(yīng)時(shí)間為30 min，酸蝕過程中保持噴丸表面朝上；酸蝕處理后分別將樣品放入80 ℃的4 mol/L的NaOH溶液中堿熱處理4 h，堿熱處理過程中保持噴丸表面朝上。將進(jìn)行了噴丸和酸蝕處理的鈦合金樣品標(biāo)記為SLA Ti38Nb、SLA Ti40Nb、SLA Ti32Nb4Sn、SLA Ti2448；將進(jìn)行了堿熱處理的鈦合金樣品標(biāo)記為SLA+AT Ti38Nb、SLA+AT Ti40Nb、SLA+AT Ti32Nb4Sn、SLA+AT Ti2448。噴丸設(shè)備型號(hào)為Tb-6050的工業(yè)噴砂機(jī)，酸蝕和堿熱處理均在恒溫水浴鍋中進(jìn)行。

1.3 鈦合金表面的Ca/P沉積實(shí)驗(yàn)

本研究采用羥基磷灰石沉積實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)樣品表面的生物相容性能。Ca/P沉積實(shí)驗(yàn)采用的培養(yǎng)液是在37 ℃、pH 7.4～7.5、低溫2～8 ℃保存的改性模擬體液，改性模擬體液(m-SBF)、傳統(tǒng)模擬體液及血漿的各類成分含量對(duì)比如表 2所示。羥基磷灰石沉積實(shí)驗(yàn)過程中，將經(jīng)過無菌處理的每組2個(gè)Smooth Ti38Nb、Smooth Ti40Nb、Smooth Ti32Nb4Sn、Smooth Ti2448、SLA+AT Ti38Nb、SLA+AT Ti40Nb、SLA+AT Ti32Nb4Sn、SLA+AT Ti2448樣品置于16孔板培養(yǎng)皿中，并在放置樣品的每個(gè)孔內(nèi)滴入約2 mL的m-SBF培養(yǎng)液，然后將16孔板培養(yǎng)皿密封。將裝有純鈦樣品的16孔板培養(yǎng)皿放置在恒溫箱中保持37 ℃浸泡7天，培養(yǎng)期間每2天將培養(yǎng)液更新一次。培養(yǎng)7天后將樣品取出，用去離子水和乙醇依次漂洗樣品，并在37℃真空環(huán)境中干燥2天，取樣密封保存。將進(jìn)行了羥基磷灰石沉積實(shí)驗(yàn)的鈦合金樣品分別標(biāo)記為：SBF Smooth Ti38Nb、SBF Smooth Ti40Nb、SBF Smooth Ti32Nb4Sn、SBF Smooth Ti2448、SBF SLA+AT Ti38Nb、SBF SLA+AT Ti40Nb、SBF SLA+AT Ti32Nb4Sn、SBF SLA+AT Ti2448。改良模擬體液由Phygene公司提供，恒溫箱型號(hào)為DZF-6020真空烘箱。

表2 改性模擬體液、傳統(tǒng)模擬體液及血漿的成分對(duì)比

1.4 鈦合金表面的性能表征

用JEOL JSM-7800F Prime超級(jí)分辨率場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM)觀察Smooth、SLA和SLA+AT鈦合金樣品的表面微觀結(jié)構(gòu)，并用Mitutoyo SJ-201粗糙度測(cè)試儀測(cè)定樣品表面的粗糙度。SLA和SLA+AT鈦合金樣品表面的化學(xué)成分是用D8 ADVANCE Da Vinci多功能X射線衍射儀(XRD)檢測(cè)的。Smooth、SLA和SLA+AT鈦合金樣品表面的潤(rùn)濕性是用DSA 100接觸角分析儀測(cè)定的。SBF鈦合金樣品表面的微觀結(jié)構(gòu)、元素表觀濃度和表面成分是用Mira3分析型高分表掃描電鏡(SEM)、MIRA3 X射線能譜儀(EDS)和AXIS UltraDLD X射線光電子能譜(XPS)檢測(cè)的。

2 結(jié)果與討論

2.1 鈦合金的表面形貌

如圖1所示，通過噴丸、雙酸酸蝕和堿熱處理復(fù)合工藝處理后，所有鈦合金樣品表面都形成了與人皮質(zhì)骨結(jié)構(gòu)相似的微納分級(jí)多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)能夠在骨整合過程中為成骨細(xì)胞提供更大的表面積，有利于存儲(chǔ)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和液體，進(jìn)而有利于成骨細(xì)胞的粘附、增殖和分化[17-18]。對(duì)鈦合金樣品表面的微米結(jié)構(gòu)和納米孔尺寸進(jìn)行測(cè)量后發(fā)現(xiàn)，微米結(jié)構(gòu)和納米孔都呈現(xiàn)了雙峰結(jié)構(gòu)，即微米結(jié)構(gòu)和納米孔的尺寸都集中分布在某一個(gè)范圍附近。鈦合金表面微結(jié)構(gòu)的尺寸是用Nano Measurement軟件測(cè)量的，為了保證尺寸分布結(jié)果的準(zhǔn)確性，我們?cè)诿總€(gè)圖像上都采集了100余個(gè)數(shù)據(jù)，并根據(jù)微結(jié)構(gòu)的尺寸分布作了如圖 2所示的柱狀圖。如圖 2所示，Ti2448表面微米結(jié)構(gòu)的平均尺寸最大，約為2.21 μm；Ti40Nb表面納米孔的平均尺寸最大，約為88.2 nm。

圖1 經(jīng)復(fù)合工藝處理后的SLA+AT鈦合金表面形貌Fig 1 Surface morphology of SLA+AT Ti-alloy after multi-processes treatment

結(jié)合SEM圖像(圖1)和微納米結(jié)構(gòu)尺寸測(cè)量結(jié)果(圖2)，SLA Ti32Nb4Sn和SLA Ti2448表面在經(jīng)過噴丸和雙酸酸蝕處理后，形成了更加均勻的、尺寸更大的雙級(jí)微米結(jié)構(gòu)；而SLA Ti38Nb和SLA Ti40Nb表面則形成了包含大量微米結(jié)構(gòu)和亞微米結(jié)構(gòu)的無規(guī)則形貌。SLA Ti32Nb4Sn和SLA Ti2448樣品中，都含有熔點(diǎn)較低的Sn元素，這說明在合金中添加Sn元素有助于在合金樣品表面形成更加均勻、尺寸更大的微米結(jié)構(gòu)。同理，含有Zr元素的SLA Ti2448的表面形貌相比于不含Zr元素的SLA Ti32Nb4Sn，微米結(jié)構(gòu)分布更加均勻，這說明在合金中添加Zr元素有助于在合金樣品表面形成更加均勻、尺寸更大的微米結(jié)構(gòu)。

圖2 SLA+AT鈦合金表面的微米結(jié)構(gòu)和納米孔尺寸分布圖Fig 2 Size distribution of microstructures and nanopores on SLA+AT Ti alloys surface

2.2 鈦合金的表面粗糙度

根據(jù)粗糙度測(cè)試結(jié)果(圖3和表3)，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的4種鈦合金在經(jīng)復(fù)合工藝處理后，表面粗糙度有了明顯的增加。如圖 3和表3所示，光滑的Smooth Ti38Nb樣品表面的粗糙結(jié)構(gòu)相對(duì)平坦，經(jīng)過噴丸、雙酸酸蝕和堿熱反應(yīng)復(fù)合工藝處理后的SLA+AT Ti38Nb樣品表面的粗糙結(jié)構(gòu)相對(duì)明顯，粗糙度Ra也有了明顯的提升，達(dá)到了約2.40 μm。Ti40Nb、Ti32Nb4Sn和Ti2448樣品在經(jīng)過復(fù)合工藝處理后，表面粗糙度也有了明顯的增加：SLA+AT Ti40Nb樣品表面的粗糙度Ra達(dá)到了約2.14 μm；SLA+AT Ti32Nb4Sn樣品表面的粗糙度Ra達(dá)到了約2.17 μm；SLA+AT Ti2448樣品表面的粗糙度Ra達(dá)到了約2.41 μm。

圖3 Smooth、SLA+AT鈦合金表面的粗糙度輪廓圖像Fig 3 Roughness profile on the Smooth and SLA+AT Ti alloys surface

另外，根據(jù)表3數(shù)據(jù)，經(jīng)過復(fù)合工藝處理后，鈦合金樣品表面的粗糙層厚度也有了明顯的增加：在SLA+AT 鈦合金樣品中，SLA+AT Ti38Nb和SLA+AT Ti2448樣品表面的粗糙層厚度達(dá)到最大，約為平均3.30 μm；而SLA+AT Ti40Nb和SLA+AT Ti32Nb4Sn鈦合金樣品的表面粗糙層平均厚度則較小，分別為2.63和2.76 μm。這些結(jié)果也證實(shí)了復(fù)合工藝對(duì)于表面形貌的改善是有益的。由于隨著種植體表面粗糙層厚度的增加，骨細(xì)胞與種植體之間的接觸也會(huì)增加，我們認(rèn)為SLA+AT Ti38Nb和SLA+AT Ti2448表面是生物相容性更好的[19-20]。

表3 Control和SLA+AT鈦合金樣品表面的平均粗糙度和微米結(jié)構(gòu)平均尺寸

2.3 鈦合金的表面成分

對(duì)元素組成最復(fù)雜的SLA Ti2448和SLA+AT Ti2448樣品表面進(jìn)行成分分析，結(jié)果如圖4所示，對(duì)XRD圖譜中譜峰進(jìn)行JCPDS/ICDD對(duì)比分析后，確定了SLA Ti2448和SLA+AT Ti2448表面混合氧化層的化學(xué)狀態(tài)：SLA Ti2448和SLA+AT Ti2448表面的鈦氧化物是金紅石相的TiO2，除了金紅石型的TiO2以外，Ti2448樣品表面還有其他氧化物：SLA Ti2448表面上的主要成分還有Ti2ZrO，ZrTiO4，Nb2O5，Ti2O3和SnO2；SLA+AT Ti2448表面上的主要成分還有Ti2ZrO，ZrTiO4，Nb2O5，Ti2O3和ZrO2。經(jīng)過堿熱處理后，SLA+AT Ti2448表面出現(xiàn)了ZrO2，而成分Ti2ZrO和ZrTiO4依然存在；SLA Ti2448表面存在的SnO2在堿熱處理后消失了，其他氧化物的化學(xué)狀態(tài)則保持不變。

圖 4結(jié)果表明，在堿熱反應(yīng)過程中，Ti2448表面發(fā)生了如下的變化：在加熱的堿溶液中，SnO2被溶解了；含Zr的氧化物從Ti2ZrO或ZrTiO4部分轉(zhuǎn)變?yōu)榱薢rO2；Nb2O5在熱堿溶液中沒有發(fā)生變化；堿熱處理不會(huì)導(dǎo)致TiO2的晶體結(jié)構(gòu)發(fā)生相變。有研究表明，種植體表面Nb2O5和金紅石型TiO2的存在有利于細(xì)胞的粘附和ECM的形成，進(jìn)而提高材料表面的生物活性，這說明本研究所得的SLA+AT Ti38Nb、SLA+AT Ti40Nb和SLA+AT Ti32Nb4Sn樣品表面的生物活性也是良好的[21-23]。然而，目前對(duì)于含Zr氧化物的生物學(xué)作用尚不清楚，SLA+AT Ti2448樣品表面的生物相容性需要進(jìn)一步研究。

圖4 SLA Ti2448和SLA+AT Ti2448表面的XRD圖譜Fig 4 XRD patterns of the SLA and SLA+AT Ti2448 surface

2.4 鈦合金表面的潤(rùn)濕性

如圖5所示，經(jīng)過復(fù)合工藝處理后，SLA+AT鈦合金表面均變得超親水，這表明復(fù)合工藝處理能使鈦合金樣品表面的親水性由疏水變?yōu)槌H水。如表4所示，所有Smooth樣品表面均呈現(xiàn)了疏水性，其中Ti38Nb的親水性最差，這可能與合金成分有關(guān)。在經(jīng)過噴丸和雙酸酸蝕處理后，SLA鈦合金樣品表面都表現(xiàn)出了更好的親水性，其中Ti2448樣品表面的親水性發(fā)生了最大的變化，這說明噴丸、雙酸酸蝕工藝能最大程度地增加Ti2448表面的親水性。在經(jīng)過堿熱處理后，SLA+AT鈦合金樣品表面都表現(xiàn)出了超親水性，結(jié)合前文的SEM結(jié)果(圖1)，堿熱處理工藝能為材料表面帶來大量緊密的、細(xì)致的納米孔，也給材料表面帶了復(fù)雜的化學(xué)成分，這種結(jié)構(gòu)可能是導(dǎo)致SLA+AT鈦合金表main呈現(xiàn)超親水性的重要原因。

圖5 鈦合金樣品表面的潤(rùn)濕性演變圖Fig 5 Surface wettability evolution of Ti alloy samples

表4 經(jīng)過復(fù)合工藝工藝處理后鈦及鈦合金表面的靜態(tài)水接觸角對(duì)比

良好的親水性對(duì)于細(xì)胞粘附、增殖和分化至關(guān)重要，經(jīng)復(fù)合工藝處理后的純鈦材料具有很好的親水性，親水性良好的純鈦表面可以有效改善表面的生物相容性。SLA+AT鈦合金樣品表現(xiàn)出的超高潤(rùn)濕性，比用陽極氧化方式處理形成的納米管陣列形貌的潤(rùn)濕性更好，這些結(jié)果說明我們研究所得的鈦合金樣品的生物相容性可能非常優(yōu)異[16]。同時(shí)，這些結(jié)果也能說明，噴砂、雙酸蝕和堿熱處理的復(fù)合工藝是一種更合適的表面改性方法，對(duì)于鈦合金表面的生物相容性能提升也是更為顯著的。

2.5 鈦合金表面的Ca/P沉積能力

如圖6，我們?cè)赟LA+AT鈦合金表面發(fā)現(xiàn)了大量羥基磷灰石連續(xù)覆蓋的形貌，而Smooth鈦合金表面只發(fā)現(xiàn)了極少的羥基磷灰石晶體沉積。根據(jù)表5，Smooth鈦合金樣品在經(jīng)過7天的羥基磷灰石沉積試驗(yàn)后，表面幾乎沒有Ca、P元素的沉積；而SLA+AT鈦合金樣品表面的Ca、P元素的質(zhì)量百分含量則有了明顯的提升，這說明噴丸、雙酸酸蝕和堿熱處理復(fù)合工藝對(duì)于鈦合金材料表面生物相容性能的提升是顯著的。

圖6 在m-SBF中沉積7天后的SLA+AT鈦合金樣品表面形貌Fig 6 SEM diagram of the SLA+AT Ti alloys surface after 7 days’ deposition in m-SBF

對(duì)比表5數(shù)據(jù)，經(jīng)SBF培養(yǎng)處理后，SLA+AT Ti38Nb和SLA+AT Ti2448表面的Ca、P含量提升最為明顯，這說明SLA+AT Ti38Nb和SLA+AT Ti2448表面的生物相容性能最好。結(jié)合前文的SEM(圖1，圖2)和粗糙度檢測(cè)結(jié)果(圖3，表2)，SLA+AT Ti38Nb樣品和SLA+AT Ti2448樣品表面具有更大的微米結(jié)構(gòu)、更大的納米孔以及更厚的粗糙層，我們認(rèn)為粗糙層厚度更大、微納米結(jié)構(gòu)更大的SLA+AT Ti38Nb和SLA+AT Ti2448樣品的表面生物相容性更好，因?yàn)檫@樣的表面能夠吸附、存貯更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

表5 m-SBF沉降7天后鈦合金樣品表面的Ca/P元素含量組成

除了測(cè)量SLA+AT樣品表面Ca、P元素的表觀濃度，我們還用X射線光電子能譜(XPS)來檢測(cè)樣品表面的化學(xué)成分，結(jié)果如圖7所示。SBF樣品表面不僅存在著基礎(chǔ)金屬氧化物，還出現(xiàn)了成骨細(xì)胞的重要組成成分：羥基磷灰石(化學(xué)式Ca10(PO4)6(OH)2)。表明SLA+AT鈦合金樣品在經(jīng)過SBF沉積7天后，表面沉積了較多的Ca10(PO4)6(OH)2。

圖7 鈦合金樣品表面沉積的羥基磷灰石XPS圖譜Fig 7 XPS spectra recorded for hydroxylapatite deposition on Ti alloy surfaces

3 結(jié) 論

(1)經(jīng)過復(fù)合工藝表面改性后，SLA+AT鈦合金表面微納分級(jí)多孔結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出了雙峰形態(tài)；Ti40Nb和Ti2448樣品表面分別表現(xiàn)出了平均尺寸最大的納米孔徑(88.2 nm)和微米結(jié)構(gòu)(2.21 μm)；而SLA+AT Ti38Nb和SLA+AT Ti2448樣品表面的粗糙層平均厚度最大(3.30 μm)。

(2)復(fù)合工藝在Ti38Nb、Ti40Nb和Ti32Nb4Sn樣品表面形成了金紅石型TiO2和Nb2O5；而在Ti2448樣品表面則形成了較為復(fù)雜的成分，包含：金紅石型TiO2，Ti2ZrO，ZrTiO4，Nb2O5，Ti2O3和ZrO2。

(3)復(fù)合工藝處理后所有鈦合金表面的潤(rùn)濕角均<5°，呈現(xiàn)出超親水特性。此外，SLA+AT Ti38Nb和SLA+AT Ti2448樣品表面的羥基磷灰石沉積能力最強(qiáng)、生物相容性能最好，這是因?yàn)镾LA+AT Ti38Nb和SLA+AT Ti2448表面的微納分級(jí)結(jié)構(gòu)更有利于吸附、存貯營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。