ERK5對人肺成纖維細(xì)胞自噬、凋亡和增殖的調(diào)控

華曉敏，王昌明

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬桂林市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科,廣西桂林 541000)

細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶5(ERK5)是一種促分裂原活化蛋白激酶，在許多組織中普遍表達(dá)，并被多種細(xì)胞外刺激信號激活，以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化、細(xì)胞存活、抗凋亡信號傳導(dǎo)[1]。ERK5屬于促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號家族，其氨基末端激酶結(jié)構(gòu)域具有相對較大的羧基末端，由于此獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和功能使其與其他MAPK成員區(qū)分開[2]。研究表明ERK5作為不同癌癥的靶向因子，抑制ERK5活性或沉默ERK5在癌細(xì)胞中具有抗增殖活性，并在動物模型中阻斷腫瘤生長[3]。已有研究發(fā)現(xiàn)ERK5抑制劑有緩解博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化的作用[4]，但其對減輕肺纖維化的機(jī)制尚未有充足的研究。本研究通過細(xì)胞實驗探討ERK5對成纖維細(xì)胞增殖、凋亡和自噬的調(diào)控及對成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響，為研究肺纖維化的發(fā)生機(jī)制提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗細(xì)胞

人肺成纖維樣細(xì)胞系(HLFs)，細(xì)胞編號KCB200695，來源于中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫。細(xì)胞培養(yǎng)箱條件：5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱。完全培養(yǎng)基：DMEM高糖培養(yǎng)基+10%胎牛血清(美國Gibco公司)+0.5%青霉素-鏈霉素混合液。

1.2 主要實驗試劑

Recombinant Human轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)2 μg粉劑(美國PeproTech公司)，用含海藻糖溶液溶解至10 μg/mL，分裝后于-80 ℃儲存。Vector-flag空載體、ERK5-flag(吉瑪基因)各50 μg干粉分別經(jīng)短暫高速離心后溶于50 μL ddH2O，溶解為1 μg/μL的儲存液，分裝后于-20 ℃儲存。DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，胎牛血清(Gibco FBS-10099-141，美國Gibco公司)，1%青霉素及鏈霉素(美國Gibco公司)，0.25%含乙二胺四乙酸(EDTA)胰酶(美國Gibco公司)。α-SMA、Fibronectin、Bcl-2、Cleaved-Caspase3和增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)一抗(美國Abcam公司)，辣根過氧化物酶標(biāo)記過的二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。細(xì)胞增殖/毒性檢測(CCK8)試劑盒(美國MCE公司)。細(xì)胞凋亡雙染試劑盒(美國BD公司)。

1.3 方法

1.3.1實驗分組

(1)建立肺纖維化細(xì)胞模型：NC組、TGF-β1組。(2)檢測細(xì)胞增殖、凋亡：vector組、ERK5組、vector+TGF-β1組、ERK5+TGF-β1組。(3)檢測細(xì)胞自噬：vector組、ERK5組、 ERK5+TGF-β1組、vector+TGF-β1組、ERK5+TGF-β1+Rapamycin組、Rapamycin對照組。

1.3.2Western blot

建立濃度為10 ng/mL的TGF-β1作用24 h誘導(dǎo)HLFs肺纖維化模型，采用Western blot檢測各組細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化標(biāo)志性蛋白Fibronectin、α-SMA的表達(dá)水平；HLFs經(jīng)過轉(zhuǎn)染過表達(dá)ERK5基因的質(zhì)粒(ERK5)48 h后，再用TGF-β1處理，采用Western blot分別檢測各組自噬相關(guān)蛋白P62、Beclin-1和LC3Ⅱ的表達(dá)水平，凋亡相關(guān)因子Cleaved-Caspase-3和Bcl-2的蛋白表達(dá)水平，PCNA的表達(dá)水平。細(xì)胞培養(yǎng)完成后，經(jīng)RIPA裂解液裂解后提取總蛋白，蛋白定量采用BCA試劑盒定量方法，制備等質(zhì)量上樣蛋白樣品，經(jīng)過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳后使蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，封閉和孵育抗體后，在暗室中壓片，將膠片掃描到電腦后進(jìn)行條帶灰度值量化分析。

1.3.3CCK8檢測細(xì)胞增殖

HLFs在96孔板中培養(yǎng)24 h，每組設(shè)置6個復(fù)孔，經(jīng)過TGF-β1處理24 h、轉(zhuǎn)染48 h后加入用完全培養(yǎng)基稀釋10倍的CCK8試劑，設(shè)置3個空白對照組，加入CCK8試劑后孵育4 h后，用多功能酶標(biāo)儀檢測吸光度(A)值，波長取460 nm。計算：細(xì)胞增殖率(%)=[實驗組A值-空白對照組A值]/[NC組A值-空白對照組A值]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析。用單因素方差分析，先進(jìn)行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗，符合正態(tài)分布、方差齊者兩兩比較采用S-N-K法分析，方差不齊者采用Dunnett′st3檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HLFs中Fibronectin和α-SMA的表達(dá)

TGF-β1處理后，Western blot檢測結(jié)果顯示TGF-β1組中Fibronectin和α-SMA蛋白相對表達(dá)較NC組明顯增加，見圖1。

圖1 Western blot檢測HLFs中Fibronectin和α-SMA的表達(dá)

2.2 過表達(dá)ERK5促進(jìn)HLFs中α-SMA的表達(dá)

Western blot檢測結(jié)果顯示：過表達(dá)ERK5組ERK5表達(dá)水平較vector組明顯增加(圖2)。過表達(dá)ERK5后，TGF-β1處理細(xì)胞24 h，Western blot檢測α-SMA蛋白相對表達(dá)水平。結(jié)果顯示：與vector+TGF-β1組相比，ERK5+TGF-β1組α-SMA蛋白相對表達(dá)水平增加(圖3)。

圖2 Western blot檢測過表達(dá)ERK5效果

A：vector組；B：vector+TGF-β1組；C：ERK5組；D：ERK5+TGF-β1組。

2.3 過表達(dá)ERK5促進(jìn)HLFs增殖

過表達(dá)ERK5基因后，TGF-β1處理細(xì)胞24 h，Western blot檢測PCNA的表達(dá)，CCK8檢測細(xì)胞增殖率。結(jié)果顯示：與vector+TGF-β1 組相比，ERK5+TGF-β1組PCNA相對表達(dá)水平，見圖4；vector+TGF-β1組較vector組細(xì)胞增值能力增強(qiáng)，ERK5+TGF-β1組較vector+TGF-β1 組細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖5。

A：vector組；B：vector+TGF-β1組；C：ERK5組；D：ERK5+TGF-β1組。

A：vector組；B：vector+TGF-β1組；C：ERK5組；D：ERK5+TGF-β1組。a:P<0.05。

2.4 過表達(dá)ERK5抑制HLFs凋亡

過表達(dá)ERK5基因后，TGF-β1處理細(xì)胞24 h，Western blot檢測Bcl-2和Cleaved-Caspase-3的表達(dá)。與vector+TGF-β1組比較，ERK5+TGF-β1組Cleaved-Caspase-3蛋白相對表達(dá)水平降低，Bcl-2蛋白增加，見圖6。

A：vector組；B：vector+TGF-β1組；C：ERK5組；D：ERK5+TGF-β1組。

2.5 過表達(dá)ERK5抑制HLFs自噬

ERK5+TGF-β1組較vector+TGF-β1組P62蛋白相對表達(dá)水平增加，LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白相對表達(dá)水平降低，表明細(xì)胞自噬受到抑制；α-SMA蛋白相對表達(dá)水平增加，表明細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化增加。應(yīng)用自噬激活劑后的ERK5+TGF-β1+Rapamycin組較ERK5+TGF-β1組α-SMA、P62蛋白相對表達(dá)水平均降低，LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白相對表達(dá)水平增加，表明自噬受到激活后抑制了細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，見圖7。

A：vector組；B：vector+TGF-β1組；C：ERK5組；D：ERK5+TGF-β1組；E：ERK5+TGF-β1+Rapamycin組；F：Rapamycin對照組。

3 討 論

肺纖維化是一種以持續(xù)上皮細(xì)胞損傷和過量細(xì)胞外基質(zhì)沉積為主要病理特征的慢性纖維增生性疾病。在疾病的發(fā)展過程中，成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞(MF)的轉(zhuǎn)化，進(jìn)而分泌膠原、促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的沉積[5]。TGF-β1是致肺纖維化關(guān)鍵性的細(xì)胞因子，其在促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化和細(xì)胞外基質(zhì)沉積過程發(fā)揮著重要作用。已有研究表明在肺纖維化中 TGF-β1 mRNA 水平高表達(dá)[6]。Fibronectin、α-SMA、Collagen-Ⅰ等是成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志因子，在肌成纖維細(xì)胞中，此類因子的表達(dá)水平明顯高于在成纖維細(xì)胞[7]。在本研究中，以Fibronectin和α-SMA的蛋白表達(dá)水平反映HLFs向肌成纖維細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化情況。經(jīng)TGF-β1處理HLFs后，Western blot檢測結(jié)果顯示α-SMA和Fibronectin的蛋白表達(dá)水平明顯增加，證明實驗中TGF-β1成功誘導(dǎo)HLFs的表型轉(zhuǎn)化。過表達(dá)ERK5后，Western blot檢測結(jié)果顯示α-SMA蛋白表達(dá)量增加，說明ERK5可促進(jìn)TGF-β1誘導(dǎo)的HLFs表型轉(zhuǎn)化過程。

體內(nèi)細(xì)胞增殖的測量通常通過檢查靜態(tài)方法來進(jìn)行，比如檢測標(biāo)記物指數(shù)，包括DNA合成標(biāo)記物如溴脫氧尿苷，或固有標(biāo)記物如Ki67和增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)[8]。PCNA是存在于真核細(xì)胞核中的一種多功能蛋白質(zhì)，它作為DNA復(fù)制和修復(fù)的組成部分發(fā)揮重要作用[9]。通過Western blot檢測PCNA的表達(dá)水平，結(jié)果表明過表達(dá)ERK5 后，PCNA表達(dá)水平升高，CCK8細(xì)胞增殖檢測到過表達(dá)ERK5后細(xì)胞增殖率上升，說明ERK5促進(jìn)HLFs增殖。但在HLFs表型轉(zhuǎn)化過程中，ERK5調(diào)控細(xì)胞增殖的分子機(jī)制及其與在表型轉(zhuǎn)化中發(fā)揮的作用需要進(jìn)一步探討。

細(xì)胞凋亡是指機(jī)體細(xì)胞在發(fā)育過程中或在某些因素作用下通過細(xì)胞內(nèi)基因及其產(chǎn)物的調(diào)控而發(fā)生的程序性細(xì)胞死亡過程[10]。細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是各種過程的重要組成部分，細(xì)胞凋亡對組織內(nèi)正常細(xì)胞群的穩(wěn)定、機(jī)體的防御和免疫反應(yīng)、疾病或中毒時引起的細(xì)胞損傷、老化、腫瘤的發(fā)生進(jìn)展起著重要作用[11]。非正常的細(xì)胞凋亡(太少或太多)是許多人類疾病的一個重要因素，包括自身免疫性疾病和許多類型的癌癥。Bcl-2是凋亡調(diào)節(jié)蛋白家族的創(chuàng)始成員，破壞Bcl-2會導(dǎo)致細(xì)胞死亡，抗凋亡的Bcl-2被歸為致癌基因，研究表明Bcl-2基因的損傷會引起多種癌癥，包括淋巴瘤等[12]。Caspase-3是一種凋亡效應(yīng)類蛋白，Caspase-3的活化(Cleaved-Caspase-3即Caspase-3的活化形式)可直接促使細(xì)胞發(fā)生凋亡，因此，檢測Cleaved-Caspase-3的蛋白表達(dá)水平可直觀地反映HLFs凋亡情況。而Bcl-2的過度表達(dá)可抑制Caspase-3的活化，阻斷凋亡進(jìn)程[13]。所以Bcl-2的表達(dá)水平，可在一定程度上反映細(xì)胞凋亡抑制情況。在本研究中，過表達(dá)ERK5后，Cleaved-Caspase-3的蛋白表達(dá)水平明顯降低，而Bcl-2的蛋白表達(dá)水平增加，說明在TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化過程中，ERK5起到抑制凋亡的作用。

細(xì)胞自噬導(dǎo)致真核細(xì)胞內(nèi)一部分受損、多余的或老化的細(xì)胞器及大分子蛋白質(zhì)被吞噬和降解，從而更利于細(xì)胞的存活，該過程的功能障礙導(dǎo)致許多疾病的發(fā)生[14]。Beclin-1、LC3、P62是目前研究相對較成熟的自噬相關(guān)蛋白。Beclin-1介導(dǎo)細(xì)胞自噬起始過程，在啟動階段發(fā)揮了重要作用，研究表明在哺乳動物中Beclin-1的過表達(dá)可刺激自噬[15]；LC3是自噬標(biāo)志物，自噬形成時，胞漿型LC3(即LC3-Ⅰ)酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)槟ば蚅C3(即LC3-Ⅱ)，LC3Ⅱ參與自噬溶酶體的形成，所以LC3-Ⅱ的蛋白表達(dá)水平可反映細(xì)胞自噬水平的高低[16]；P62 可作為將要被自噬作用降解的小泡的受體，在自噬形成的過程中不斷被消耗，所以其表達(dá)水平可間接反映細(xì)胞自噬情況[17]。在TGF-β1誘導(dǎo)HLFs表型轉(zhuǎn)化過程中，過表達(dá)ERK5后，Western blot檢測結(jié)果顯示LC3Ⅱ與Beclin-1的表達(dá)水平降低，P62表達(dá)水平升高，說明ERK5抑制HLFs自噬；過表達(dá)ERK5后，表型轉(zhuǎn)化的標(biāo)志性蛋白α-SMA表達(dá)水平升高，說明ERK5參與了TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化。應(yīng)用自噬激活劑后，與未激活自噬組相比，α-SMA組的表達(dá)水平下降，說明ERK5有可能通過抑制自噬來促進(jìn)α-SMA的表達(dá)。這為進(jìn)一步研究ERK5、自噬、肺成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化過程的相互關(guān)系提供了一定的基礎(chǔ)依據(jù)，但細(xì)胞自噬是一個復(fù)雜的動態(tài)過程，若要明確ERK5是否通過在細(xì)胞自噬過程中發(fā)揮作用，進(jìn)而影響表型轉(zhuǎn)化過程，需要更深入的研究。