ULK1啟動(dòng)子區(qū)含有抑制ULK1轉(zhuǎn)錄的G4結(jié)構(gòu)*

劉雪萍， 黃偉偉， 李曉梅

（西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌712100）

自噬（autophagy）是真核生物中廣泛存在的依賴溶酶體的細(xì)胞內(nèi)降解途徑，對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和保證細(xì)胞生命活動(dòng)有序進(jìn)行有重要作用。目前已發(fā)現(xiàn)超過30 種自噬相關(guān)基因（autophagy-related genes，ATG），ATG 蛋白及多條上游信號(hào)在各個(gè)階段參與調(diào)控自噬。UNC-51 樣激酶 1（ULK-51-like kinase 1，ULK1）作為酵母Atg1基因在哺乳動(dòng)物中的同源基因，其蛋白是自噬起始步驟的主要調(diào)控子［1］。ULK1參與形成的ULK1 復(fù)合物是細(xì)胞自噬起始所必需的［2］。另外，ULK1 參與形成前自噬體的核心結(jié)構(gòu)［3］。因此，ULK1是自噬起始過程中不可缺少的成分。

ULK1 參與調(diào)控大量下游自噬相關(guān)通路。在ULK1敲除研究中，小鼠因缺乏ULK1而自噬功能受到強(qiáng)烈抑制［4］。除了參與調(diào)控經(jīng)典的自噬相關(guān)通路，ULK1 還參與一些非經(jīng)典信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，例如特殊壓力刺激導(dǎo)致的自噬，線粒體自噬等［5］。ULK1廣泛存在于人體各種組織中，與正常組織不同的是ULK1在各種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)變化很大，其參與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程并扮演不同角色［6］，Zhang等［7］發(fā)現(xiàn)，在雄激素阻斷治療后發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移的前列腺癌患者中，ULK1的高表達(dá)可作為轉(zhuǎn)移性前列腺癌的有效標(biāo)志物。目前對(duì)于ULK1 的表達(dá)調(diào)控研究國內(nèi)外僅有少量文獻(xiàn)報(bào)道。Mukesh 等［8］發(fā)現(xiàn)ULK1結(jié)構(gòu)域中超過50%的突變會(huì)影響其功能和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。此外，王煥等［9］發(fā)現(xiàn)RAD001 能顯著上調(diào)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 及HEC-1A 細(xì)胞中ULK1蛋白的表達(dá)水平。本研究擬對(duì)ULK1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控進(jìn)行研究，通過分析ULK1啟動(dòng)子序列，發(fā)現(xiàn)其中存在G 四聯(lián)體（G-quadruplex，G4）形成序列，提示ULK1啟動(dòng)子區(qū)可能形成G4并調(diào)控ULK1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。G4是一類由富含連續(xù)鳥嘌呤的DNA 序列形成的四鏈螺旋結(jié)構(gòu)，廣泛分布于基因組的許多重要區(qū)域，對(duì)DNA 復(fù)制、基因轉(zhuǎn)錄與翻譯和端粒代謝等多種細(xì)胞代謝產(chǎn)生重要影響。目前在多個(gè)基因的啟動(dòng)子區(qū)已發(fā)現(xiàn)G4，它參與轉(zhuǎn)錄激活或沉默基因表達(dá)，如c-myc［10］和c-KIT［11］等。G4 廣泛參與基因的表達(dá)調(diào)控且與細(xì)胞衰老、凋亡和腫瘤的發(fā)生發(fā)展及一些其他疾病相關(guān)。正是由于G4在細(xì)胞內(nèi)重要的生物學(xué)功能，近年來G4研究受到廣泛關(guān)注。因此，本研究對(duì)ULK1啟動(dòng)子區(qū)是否形成G4，以及G4 對(duì)ULK1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用進(jìn)行研究，為揭示ULK1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制提供新的線索。

材料和方法

1 細(xì)胞

人前列腺癌細(xì)胞系DU-145 購自北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心，用含10%胎牛血清、1×105U/L 青霉素和 100 mg/L 鏈霉素的 RPMI-1640 培養(yǎng)基置于5%二氧化碳、37 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，及時(shí)換液、傳代，保持細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好。

2 主要試劑

DNA 寡核苷酸和引物由Invitrogen 合成；RPMI-1640 培養(yǎng)基和Opti-MEM 購自Gibco；胎牛血清（900108）購自Gemini；限制性核酸內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶購自NEB；Lipofectamine? 2000 Reagent 購自Invitrogen；RNAex Pro RNA 提取試劑（AG21102）、Evo M-MLV 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（AG11705）和SYBR Green Pro Taq HS 預(yù)混型PCR 試劑盒（AG11701）均購自艾科瑞生物公司；β-actin 抗體（AA128）、RIPA 裂解液（P0013B）、胰酶（C0201）和青霉素-鏈霉素溶液（C0222）均購自碧云天生物技術(shù)公司；ULK1 抗體（8054S）購自CST；HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠（L3032）和山羊抗兔（L3012）Ⅱ抗購自SAB；ECL 顯色液（170-5061）購自Bio-Rad；質(zhì)粒小提試劑盒（D6943-01）和膠回收試劑盒（D2500-01）購自O(shè)mega；BCA 試劑盒（CW0014S）購自北京康為世紀(jì)；TMPyP4（A5014-100MG）購自梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；PDS（A3742）購自上海偉寰生物科技有限公司。

3 方法

3.1 質(zhì)粒構(gòu)建 設(shè)計(jì)合成特異性ULK1啟動(dòng)子PCR引物（見表1），分別引入EcoR I 和Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)，以HeLa 細(xì)胞基因組DNA 為模板，擴(kuò)增ULK1啟動(dòng)子序列，插入經(jīng)EcoR I和Hind Ⅲ雙酶切的pGLuc-Basic載體中，以構(gòu)建野生型ULK1啟動(dòng)子報(bào)告基因質(zhì)粒。

表1 PCR引物序列Table 1.The sequences of the primers for PCR

3.2 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（native-PAGE） 用含有 100 mmol/L LiCl 或 KCl 的 Tris-HCl（10 mmol/L，pH 8.0）將寡核苷酸稀釋至50 μmol/L，沸水浴退火5 min，緩慢冷卻至室溫。退火樣品經(jīng)12%非變性聚丙烯酰胺凝膠在0.5×TBE 中以100 V 恒壓電泳1.5 h。對(duì)凝膠進(jìn)行DNA 銀染，每次更換溶液時(shí)佩戴一次性PE 手套，避免接觸凝膠，最后用掃描儀掃描拍照。

3.3 圓二色譜（circular dichroism，CD）分析 取20 μL 合成的寡核苷酸（100 μmol/L）和180 μL Tris-HCl（10 mmol/L，pH 8.0），混勻后置于PCR 儀按照Huang等［12］報(bào)道的程序退火，退火后的寡核苷酸用含有同等濃度陽離子的 Tris-HCl 稀釋至 500 μL，獲得 CD 樣品，用0.5 mm 的石英杯進(jìn)行檢測(cè)，程序設(shè)置：波長(zhǎng)200～350 nm，溫度25 ℃。以被證實(shí)能夠形成G4 的人c-Myc 啟動(dòng)子區(qū)序列Pu27（5'-TGGGGAGGGTGGGGAGGGTGGGGAAGG-3'）為陽性對(duì)照，以突變后不能形成G4 的端粒3’端簡(jiǎn)單序列Tel-MUT（5'-AGAGTTTAGAGTTTAGAGTTTAGAG-3'）為 陰 性 對(duì)照［13］。以摩爾橢圓度為縱坐標(biāo)，波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)做圖，減去背景值繪制光譜圖，根據(jù)不同波長(zhǎng)下的摩爾橢圓率來鑒定各序列是否形成G4。

3.4 螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè) 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的DU-145細(xì)胞以適當(dāng)比例接種至24孔板過夜培養(yǎng)，次日用Lipofectamine 2000 按照使用說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染，報(bào)告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量為每孔200 ng，參照質(zhì)粒pCMV-SEAP的量為每孔5 ng，轉(zhuǎn)染前將RPMI-1640完全培養(yǎng)基更換為Opti-MEM，轉(zhuǎn)染6～8 h 后更換為完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染48 h 后收集培養(yǎng)基，分別測(cè)定GLuc 和SEAP 活性，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3 次，計(jì)算相對(duì)GLuc 活性，結(jié)果取平均值。

3.5 RT-qPCR 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的DU-145 細(xì)胞以適當(dāng)比例接種至3.5 cm 培養(yǎng)皿過夜培養(yǎng)，次日用不同終濃度的 TMPyP4 處理，48 h 后棄培養(yǎng)液，PBS 洗滌2 次，加入1 mL Trizol 反復(fù)吹打，待溶液變粘稠透明將其轉(zhuǎn)移至無菌無酶的離心管。參照提取試劑說明提取總 RNA。取1 μg 總RNA 反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，按照試劑說明配制25 μL反應(yīng)體系，所用引物序列見表1。每個(gè)樣品設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，β-actin 為內(nèi)參照，按照試劑盒說明程序進(jìn)行。使用Bio-Rad CFX Manager V1.1.308.1111 軟件采用 2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算靶基因的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次，結(jié)果取平均值。

3.6 Western blot 實(shí)驗(yàn) 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的DU-145細(xì)胞以適當(dāng)比例接種至12 孔板過夜培養(yǎng)，次日用不同終濃度的TMPyP4 處理細(xì)胞，48 h 后收集細(xì)胞。根據(jù)收集細(xì)胞量的大小加入適量含有PMSF 和蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液，用超聲破碎儀裂解細(xì)胞，4 ℃，14 000 r/min離心15 min，取總蛋白上清液，測(cè)定蛋白濃度，將所有蛋白樣品調(diào)至同一濃度，加入5×SDS Loading Buffer，混勻后沸水浴5 min。獲得的蛋白樣品直接用于SDS-PAGE 或-20 ℃凍存。分離膠濃度為8%，采用濕轉(zhuǎn)法，350 mA 恒流模式下轉(zhuǎn)NC膜2 h，用TBST 配制的5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，Ⅰ抗用Ⅰ抗稀釋液以1∶1 000 的比例稀釋，4 ℃過夜孵育，次日用TBST 洗膜洗膜3 次，每次6 min，Ⅱ抗用5%脫脂牛奶以1∶5 000 的比例稀釋，室溫孵育1 h，再次洗膜后用ECL 發(fā)光液均勻覆蓋NC 膜上目的蛋白所在區(qū)域，利用化學(xué)發(fā)光成像儀曝光，β-actin 為內(nèi)參照，用Image Lab軟件處理分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用Graph Pad Prism 8.0.1 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和制圖。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，利用Student-T Test 檢測(cè)數(shù)據(jù)之間的差異顯著性，P＜0.05為差異有顯著性。

結(jié) 果

1 ULK1啟動(dòng)子區(qū)含有富G/C區(qū)并形成G4結(jié)構(gòu)

分析ULK1 啟動(dòng)子序列，發(fā)現(xiàn)ULK1轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游1 000 bp 的G/C 含量較高，轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游276～120 bp 的 C 含量為 61.5%，626 bp～358 bp 的 G 含量為63.6%，見圖1A，ULK1 啟動(dòng)子富G/C 的區(qū)域可能形成G4。設(shè)計(jì)引物（見表1）分別擴(kuò)增富G 序列（UGS）和富C 序列（UCS），在不同離子環(huán)境下退火處理，利用PAGE 檢測(cè)富G/C 的序列是否形成G4，見圖1B，富G/C 的序列在氯化鉀溶液中，形成緩慢遷移的G4 條帶，然而在沒有金屬陽離子存在或鋰離子存在的情況下，未形成G4 條帶。接下來我們研究了G4 DNA 配體 PDS（Pyridostatin）對(duì) G4 的影響。在 DNA退火前加入不同濃度的PDS，然后檢測(cè)G4 的形成，令人驚奇的是僅在 1 μmol/L PDS 存在時(shí)，G4DNA 占總DNA 的比例達(dá)到100%，表明PDS 在DNA 退火期間促進(jìn)了G4的形成，見圖1C。

Figure 1.The ULK1 promoter region contained rich G/C regions and formed a G4 structure.A：analysis of GC content of 1 000 bp sequence upstream of the transcription start point of ULK1 promoter；B：non-denaturing gel electrophoresis was used to detect whether G- and C-rich sequences form G4 structure.Using non-denaturing gel electrophoresis to detect whether G- and C-rich sequences form G4 structures，and G- or C-rich sequences form slow-moving G4 bands in potassium chloride solution；C：PDS promoted the formation of G4 during DNA annealing.圖1 ULK1啟動(dòng)子區(qū)含有富G/C區(qū)并形成G4結(jié)構(gòu)

2 ULK1啟動(dòng)子區(qū)富G/C區(qū)G4形成序列的預(yù)測(cè)

利用QGRS Mapper 對(duì)ULK1 轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游1 000 bp 序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)10 條可能形成G4 的序列，見圖2A，分別命名為 UPG-626、UPG-596、UPG-574、UPG-539、UPG-495、UPG-400、UPC-265、UPC-240、UPC-210 和 UPC-141，其中 6 條位于正義鏈，4 條位于反義鏈，大多長(zhǎng)度為20個(gè)堿基左右，均含有4個(gè)及以上的“GGG”，間隔少于7 個(gè)堿基且G-Score 均為65 以 上 ，其 中 UPG-400 和 UPC-210 的 G-Score 高 達(dá)106 和 107，見圖 2B），提示這些序列形成 G4 的可能性極高。因此，ULK1啟動(dòng)子區(qū)富G/C 區(qū)極有可能形成G4。

Figure 2.Sequence prediction of G4 formation in the G/C-rich region of ULK1 promoter region.A：the online software QGRS Mapper was used to analyze the 1 000 bp promoter sequence upstream of the ULK1 transcription start point and 10 sequences that may form the G4 structure were found；B：among the 10 G4 forming sequences，6 were in the sense strand and 4 were in the antisense strand，and the G-Score scores are all above 65.圖2 ULK1啟動(dòng)子區(qū)富G/C區(qū)G4形成序列預(yù)測(cè)

3 圓二色譜鑒定ULK1啟動(dòng)子區(qū)G4形成序列結(jié)構(gòu)

預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)ULK1啟動(dòng)子區(qū)存在10 條G4 形成序列，能否形成G4 需要進(jìn)一步鑒定。圓二色譜可通過檢測(cè)核酸分子的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)鑒定是否形成G4。結(jié)果顯示，Tel-MUT 在何種情況下都未形成G4 特征峰。UPG-596、UPG-539、UPG-495、UPC-265、UPC-240 在K+存在的情況下，光吸收曲線趨勢(shì)與Pu27 極度相似，即在240 nm 處有一負(fù)峰，在262 nm 處有一正峰，這是典型的平行G4 的偏振光吸收特征，UPG-626、UPG-574、UPG-400、UPC-210、UPC-141 的光吸收曲線顯示在262 nm 處的正峰值略低于Pu27，表明上述序列在體外形成平行G4。UPG-574 除了在262 nm處出現(xiàn)一正峰，在295 nm 處出現(xiàn)第二個(gè)正峰，表明UPG-574 還可能形成反平行G4。上述結(jié)果說明ULK1啟動(dòng)子G4 形成序列能夠在體外形成G4。見圖3。

Figure 3.Circular dichroism analysis of ULK1 promoter G4 formation sequence.In any case，Tel-MUT did not form a G4 characteristic peak.In the presence of K+，the curve trends of UPG-596，UPG-539，UPG-495，UPC-265 and UPC-240 were extremely similar to Pu27，with a negative molar ellipticity peak at 240 nm and a peak at 262 nm positive molar ellipticity peak.The curves of UPG-626，UPG-574，UPG-400，UPC-210 and UPC-141 showed that the positive molar ellipticity peak at 262 nm was slightly lower than Pu27，except for UPG-574 at 262 nm a positive molar ellipticity peak appeared at，and a second positive molar ellipticity peak appeared at 295 nm.圖3 圓二色譜分析ULK1啟動(dòng)子區(qū)G4形成序列

4 Native-PAGE 電泳鑒定 ULK1 啟動(dòng)子區(qū) G4 形成序列結(jié)構(gòu)

Native-PAGE 結(jié)果顯示，除了明顯的寡核苷酸單鏈線性條帶（ssDNA），在不同陽離子條件下退火后，10 條序列形成了多條不同程度遷移滯后帶，見圖4?？拷黶sDNA 條帶的是分子內(nèi)G4，而遷移更加滯后的是分子間G4。在50 mmol/L KCl 的退火條件下，UPG-596 和 UPG-574 沒有形成靠近 ssDNA 的滯后帶，說明這兩條序列只能形成分子間G4，除此之外的8條序列可以形成分子間和分子內(nèi)兩種G4。

Figure 4.Analysis of G4 formation sequence by non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis.Near the singlestranded linear band was intramolecular G4，and the more lagging migration was intermolecular G4.Under the annealing condition of 50 mmol/L KCl，UPG-596 and UPG-574 did not form a hysteresis band close to ssDNA.The other eight oligonucleotides not only formed hysteresis bands close to ssDNA but also formed a more hysteretic band.圖4 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析G4形成序列

5 G4配體對(duì)ULK1轉(zhuǎn)錄的影響

TMPyP4 和 PDS 是常用的 G4 配體，能夠特異結(jié)合并穩(wěn)定G4。因此，借助二者研究啟動(dòng)子G4 對(duì)ULK1轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響。首先將ULK1啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 DU-145 細(xì)胞，24 h 后用不同濃度 TMPyP4 處理，利用報(bào)告基因檢測(cè)TMPyP4 對(duì)ULK1的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)受ULK1啟動(dòng)子調(diào)控的螢光素酶GLuc活性顯著降低，且呈現(xiàn)濃度依賴性，見圖5A。然后用不同濃度 TMPyP4 處理 DU-145 細(xì)胞 48 h，利用 qPCR 檢測(cè)ULK1 mRNA 的水平變化。結(jié)果顯示ULK1 的mRNA水平顯著降低，并呈現(xiàn)濃度依賴性，見圖5B。最后分別用不同濃度TMPyP4 和PDS 處理DU-145 細(xì)胞48 h，利用Wstern blot 檢測(cè)ULK1 蛋白水平變化。結(jié)果表明二者均導(dǎo)致ULK1蛋白水平顯著降低，并呈現(xiàn)濃度依賴性，見圖5C。上述結(jié)果證實(shí)ULK1啟動(dòng)子G4對(duì)ULK1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)起負(fù)調(diào)控作用。

Figure 5.The effect of G4 ligand on ULK1 transcription.A：reporter gene was used to detect the effect of TMPyP4 on ULK1 gene transcription；B：the qPCR experiment was used to detect the level of ULK1 mRNA in DU-145 cells after TMPyP4 treatment；C：Western blot was used to detect the changes of ULK1 protein levels in DU-145 cells after TMPyP4 or PDS treatment.Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs 0 μmol/L.圖5 G4配體對(duì)ULK1轉(zhuǎn)錄的影響

討 論

自噬在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中顯示兩面性作用，ULK1作為自噬核心通路中的關(guān)鍵調(diào)控基因，其表達(dá)的變化與腫瘤的關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜。我們前期研究發(fā)現(xiàn)ULK1在前列腺腫瘤中顯著高水平表達(dá)，且與腫瘤的病理分級(jí)呈正相關(guān)。因此，ULK1是一個(gè)極具吸引力的腫瘤治療靶點(diǎn)，研究其表達(dá)調(diào)控有助于揭示ULK1在生理和病理過程中的作用機(jī)制。本研究首先分析了ULK1轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游1 000 bp 序列，發(fā)現(xiàn)富G/C區(qū)，克隆G/C 的序列后通過PAGE 和DNA 銀染證明了這些序列可以形成G4；隨后分析ULK1啟動(dòng)子富G/C 序列，預(yù)測(cè)并合成 10 條序列，通過 CD、PAGE 和DNA 銀染證明在體外一定條件下ULK1啟動(dòng)子富G/C 區(qū)能形成G4；最后細(xì)胞試驗(yàn)證實(shí)啟動(dòng)子G4 對(duì)ULK1轉(zhuǎn)錄表達(dá)具有負(fù)調(diào)控作用。

大量證據(jù)表明ULK1在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有調(diào)節(jié)作用，但關(guān)于ULK1自身的表達(dá)調(diào)控相對(duì)被忽略。目前有關(guān)ULK1的調(diào)控研究?jī)A向于轉(zhuǎn)錄后調(diào)控以及翻譯后修飾，腺苷單磷酸依賴型蛋白激酶（AMPK）磷酸化ULK1的多個(gè)位點(diǎn)激活其活性［14］，泛素特異性肽酶24（USP24）通過影響ULK1的泛素化和蛋白穩(wěn)定性調(diào)控自噬［15］，另外，轉(zhuǎn)錄激活因子4（activating transcription factor 4，ATF4）直 接 靶 向ULK1上調(diào)其 mRNA 和蛋白表達(dá)水平而激活自噬［16］。關(guān)于ULK1啟動(dòng)子區(qū)的研究較為少見，目前也沒有關(guān)于G4 調(diào)節(jié)ULK1表達(dá)的報(bào)道，本研究針對(duì)ULK1啟動(dòng)子區(qū)探討G4 對(duì)ULK1的表達(dá)調(diào)控作用，為揭示ULK1表達(dá)調(diào)控的機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

G4 在調(diào)控基因表達(dá)方面，其作用之大不可忽視。人類基因組含有超過30 萬個(gè)具有G4 形成潛力的序列［17］。著名的Wnt 信號(hào)通路控制細(xì)胞增殖、遷移及發(fā)育，Wnt 1 陽性的癌細(xì)胞具有很高的增殖能力，研究者對(duì)Wnt 1 的近端啟動(dòng)子進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其啟動(dòng)子上游277 bp 便足以控制基因表達(dá)，該277 bp包含一段富G 區(qū)，此富G 區(qū)序列能夠在體外一定條件下形成 G4 并抑制 Wnt 1 表達(dá)［18］。本研究發(fā)現(xiàn)ULK1 啟動(dòng)子也可以形成G4 并負(fù)調(diào)控其表達(dá)。這些不斷被發(fā)現(xiàn)的G4 可能是腫腫瘤發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，是新興的治療靶點(diǎn)。如何調(diào)控G4 使其穩(wěn)定或降解是當(dāng)前的熱點(diǎn)，能夠直接靶向G4 的小分子引發(fā)了非常有前途的潛在療法。一些關(guān)于使用G4 配體靶向端粒和致癌基因來治療癌癥的報(bào)道也已經(jīng)出現(xiàn)［19］?？紤]到啟動(dòng)子序列中的任何突變都可能改變轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)從而影響基因表達(dá)，我們用TMPyP4 和PDS 處理細(xì)胞以穩(wěn)定G4 的方法研究G4對(duì)ULK1轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響，結(jié)果證實(shí)啟動(dòng)子G4 抑制ULK1表達(dá)。

總之，本研究首次發(fā)現(xiàn)ULK1啟動(dòng)子富G/C 區(qū)存在G4，細(xì)胞學(xué)檢測(cè)證實(shí)G4 對(duì)ULK1轉(zhuǎn)錄表達(dá)有負(fù)調(diào)控作用。啟動(dòng)子G4 的發(fā)現(xiàn)為ULK1的表達(dá)和功能研究提供新的線索，為開發(fā)靶向ULK1的腫瘤治療方案提供新的研究方向。