慢性腦低灌注通過NF-κB通路致大鼠腸黏膜屏障損傷及辛伐他汀的保護作用*

藺陽剛， 陳 長， 劉 輝， 王慶松

（中國人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川成都610500）

慢性腦低灌注（chronic cerebral hypoperfusion，CCH）是各種缺血性腦損害的病理生理基礎，隨著社會老齡化進程的加劇，腦卒中已經(jīng)成為中國腦血管病患者的首位死亡原因［1］。缺血性腦卒中除了導致卒中后認知障礙外，遠隔器官的損傷也很常見，腸道作為全身應激反應的主要器官之一，腸道黏膜屏障功能的損害是其常見的繼發(fā)反應［2］。腸道黏膜屏障的破壞會導致菌群失調(diào)，內(nèi)毒素移位等誘發(fā)炎癥反應，這也將進一步加重神經(jīng)系統(tǒng)的損傷［3］，因此腸道黏膜屏障在機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)維持與炎癥反應調(diào)控等功能中都有重要作用。核因子κB（nuclear factorκB，NF-κB）通路是與炎癥反應相關(guān)的信號通路，研究證實其參與細胞凋亡，炎癥等病理生理過程［4］。骨橋蛋白（osteopontin，OPN）又被稱為早期T 細胞活化因子，當機體處于應激、炎癥和低氧等環(huán)境時，OPN 會激活 αvβ3 和 NF-κB 等途徑導致炎癥反應［5］。辛伐他?。╯imvastatin，SV）是神經(jīng)內(nèi)科的常用藥物之一，其在調(diào)節(jié)血脂和抗炎等方面都有很好的效果［6］，研究表明［7］，辛伐他汀可通過抑制腸道上皮NF-κB 通路改善小鼠的急性結(jié)腸炎。我們的前期研究揭示了，通過建立CCH 模型來模擬大鼠慢性腦缺血狀態(tài)，會導致大鼠長達24 周的認知行為受損［8］并伴隨回腸黏膜屏障的損傷［9］，并且在4 周時，認知行為受損最嚴重。在使用SV 作為干預后，大鼠的認知行為有了明顯的改善［10］，但CCH 致大鼠腸黏膜屏障損傷的可能機制及SV 對于腸黏膜屏障是否有改善作用未探討亦未見相應研究報導。本項工作擬在前期研究基礎上，通過觀察大鼠回腸黏膜屏障變化以及檢測大鼠回腸組織NF-κB 通路相關(guān)蛋白和血清炎性因子含量變化，研究CCH 致大鼠回腸黏膜屏障損傷的可能機制；通過SV 作為干預，觀察其對大鼠腸黏膜屏障的保護作用。

材料和方法

1 實驗動物、主要試劑及儀器

雄性 SPF 級 SD 大鼠 40 只，7 周齡，體重（250±20）g，由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供，許可證編號為SLXK（渝）2018-0003。購置后于動物房飼養(yǎng)，保持通風良好，12 h明暗交替，大鼠自由進食飲水。

辛伐他?。ù筮B美侖生物技術(shù)有限公司）；兔抗大鼠 OPN 抗體（Abcam）；兔抗大鼠 claudin-1 抗體（Abcam）；兔抗大鼠NF-κB p65 和p-p65 抗體（CST）；兔抗大鼠GAPDH 抗體和山羊抗兔II 抗（Proteintech）；大鼠腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（上海江萊生物有限公司）。熒光顯微鏡（Olympus）；電泳槽及轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（Bio-Rad）。其他所用藥品試劑均為市售分析純。

2 主要方法

2.1 動物模型建立及給藥 40只SD 大鼠按照隨機數(shù)表法分為 CCH 組（n=10）、假手術(shù)（sham）組（n=10）、溶劑對照（solvent control，SC）組（n=10）和SV 組（n=10）。按照課題組前期的文獻［8］，采用永久性雙側(cè)頸總動脈閉塞（bilateral common carotid artery occlusion，BCCAO）法進行 CCH 模型的制備，SC 組和SV 組大鼠與CCH 組大鼠模型制備方法相同。具體方法為：實驗大鼠適應性飼養(yǎng)1 周后，開始進行模型制備；術(shù)前8 h 禁食，1.5%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，頸部備皮，取頸部正中縱切口，分離一側(cè)頸總動脈血管與周圍組織，結(jié)扎并離斷血管，縫合組織和皮膚后，青霉素注射抗感染；7 d 后，同法結(jié)扎離斷另一側(cè)頸總動脈。sham 組除不離斷血管外，其余操作與CCH 組相同。以10 mg 辛伐他汀∶1 mL 0.5%羧甲基纖維素鈉溶液的比例配制混懸液，術(shù)后第1 天開始，SV 組大鼠按照2 mL/kg 用混懸液灌胃，SC 組按照2 mL/kg 用0.5%羧甲基纖維素鈉灌胃，連續(xù)4 周。CCH組和sham組大鼠不做給藥處理。

2.2 標本取材 造模結(jié)束4 周后進行大鼠回腸組織取材。1.5%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，將大鼠固定，打開胸腔充分暴露心臟，心尖取血4 mL。血液樣本4 ℃、1 000×g離心15 min，取上層血清-80 ℃保存待測。沿腹正中線打開腹腔，于距回盲部5 cm 處取回腸組織約1 cm，生理鹽水沖洗后，-80 ℃保存用于進行免疫蛋白印跡實驗。另取回腸組織1 cm，沖洗干凈后4%多聚甲醛固定，石蠟包埋用于HE 染色及免疫熒光染色。

2.3 回腸組織組織形態(tài)學檢測 回腸石蠟標本切片后脫蠟，蘇木精染色，分色后伊紅染色。光鏡下觀察回腸組織的形態(tài)學變化，截取十個隨機視野使用Chiu腸黏膜損傷評分［11］進行評估，評分標準：1分，腸道絨毛正常；2分，絨毛頂端黏膜下出現(xiàn)間隙，毛細血管充血；3 分，間隙擴大，腸黏膜也黏膜下層分離；4分，腸道絨毛兩側(cè)出現(xiàn)間隙；5 分，腸道絨毛變鈍，固有層暴露，炎癥組織浸潤；6 分，固有層消失，有出血或潰瘍）。取平均值為該標本的最終損傷評分。

2.4 回腸組織免疫熒光檢測大鼠回腸組織claudin-1 表達量 回腸石蠟標本切片脫蠟，用0.01 mol/L 枸櫞酸鈉緩沖液進行抗原修復，PBST 洗3 次，每次5 min，室溫封閉30 min，滴加claudin-1 Ⅰ抗，37 ℃孵育1 h，PBST 洗3 次，每次5min，滴加Ⅱ抗，室溫避光孵育 1 h，PBST 洗 3 次，每次5min，DAPI 染色 10 min，PBST洗3次，每次5 min后封片，用熒光顯微鏡觀察，截取3 個隨機視野Image-Pro Plus 6.0 測量積分吸光度（IA），取平均值為標本的最終IA值。

2.5 Western blot 檢測大鼠回腸組織 OPN、NF-κB p65及p-p65蛋白水平 取回腸組織解凍后用全蛋白提取試劑盒提取蛋白，BCA 蛋白定量后，用10%SDS-PAGE 分離。PVDF 膜轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉和BSA 封閉 1 h，OPN 抗體（1∶1 000）、NF-κB p65 抗體（1∶2 000）和p-p65 抗體（1∶2 000）4 ℃孵育過夜。次日搖床復溫1 h 后，TBST 洗滌條帶3 次，每次10 min，室溫下加入Ⅱ抗（1∶5 000）孵育1 h，洗滌條等3次后進行化學發(fā)光顯影。

2.6 ELISA檢測大鼠血清TNF-α和IL-6水平 將試劑盒和樣本平衡至室溫后，嚴格按照試劑盒說明書進行實驗操作。檢測重復3次。

3 統(tǒng)計學處理

使用SPSS 20.0 對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。正態(tài)分布的計數(shù)資料采用均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），多重比較采用LSD 法。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 回腸組織病理學改變

與sham組比較，CCH組與SC組大鼠回腸黏膜絨毛結(jié)構(gòu)破壞更加嚴重，絨毛變粗變鈍變短，基底層失去完整性，Chiu病理評分顯著升高（P＜0.05）；與CCH組和SC組比較，SV組大鼠回腸黏膜絨毛結(jié)構(gòu)有一定程度的恢復，絨毛呈指狀排列，Chiu 病理評分顯著降低（P＜0.05）；sham組與SV組、CCH組與SC組間Chiu病理評分未見顯著差異（P＞0.05），見圖1及表1。

Figure 1.HE staining results of ileum tissue（scale bar=100 μm）.A：sham group；B：CCH group；C：SC group；D：SV group.圖1 回腸組織HE染色結(jié)果

表1 回腸組織Chiu病理評分Table 1.Chiu pathological score of ileum（Mean±SD. n=10）

2 大鼠回腸組織claudin-1表達量的變化

與sham組比較，CCH組與SC組大鼠回腸黏膜絨毛細胞間 claudin-1 表達量顯著降低（P＜0.05）；與CCH組和SC組比較，SV組大鼠回腸黏膜絨毛細胞間claudin-1 表達量顯著升高（P＜0.05）；sham 組與 SV組、CCH 組與SC 組間回腸黏膜絨毛細胞間claudin-1表達量未見顯著差異（P＞0.05），見圖2及表2。

Figure 2.Immunofluorescence staining of claudin-1 in the ileum tissue.A：sham group；B：CCH group；C：SC group；D：SV group.圖2 回腸組織claudin-1免疫熒光染色結(jié)果

表2 大鼠回腸組織claudin-1免疫熒光IA值Table 2. IA value of claudin-1 immunofluorescence in rat ileum tissues（Mean±SD. n=10）

3 回腸組織OPN 和NF-κB 通路相關(guān)蛋白表達的變化

與sham 組比較，CCH 組和SC 組大鼠回腸組織OPN 表達量顯著增加（P＜0.05），p-p65/p65 比值顯著升高（P＜0.05）；與CCH 組和SC 組比較，SV 組大鼠回腸組織OPN 表達量顯著降低（P＜0.05），p-p65/p65 比值顯著降低（P＜0.05）；sham 組與SV 組、CCH 組與SC組間OPN 表達量及p-p65/p65 比值的差異無統(tǒng)計學顯著性（P＞0.05）；各組大鼠回腸組織NF-κB 表達量的差異無統(tǒng)計學顯著性（P＞0.05），見圖3及表3。

Figure 3.Changes in the expression of OPN and NF-κB pathway-related proteins in ileum.圖3 回腸組織OPN和NF-κB通路相關(guān)蛋白表達的變化

表3 各組大鼠回腸組織OPN及NF-κB通路相關(guān)蛋白表達Table 3.The expression of OPN and NF-κB pathway-related proteins in rat ileum tissues（Mean±SD. n=10）

4 大鼠血清TNF-α及IL-6含量的變化

與 sham 組比較，CCH 組和 SC 組大鼠血清 TNF-α與IL-6含量顯著增加（P＜0.05）；與CCH組和SC組大鼠比較，SV 組大鼠血清 TNF-α 與 IL-6 含量顯著降低（P＜0.05）；sham 組與 SV 組、CCH 組與 SC 組間血清TNF-α 和 IL-6 含量的差異無統(tǒng)計學顯著性（P＞0.05），見表4。

表4 各組大鼠血清TNF-α及IL-6含量Table 4.Serum TNF-α and IL-6 levels of the rats in each group（ng/L.Mean±SD. n=10）

討 論

隨著人口老齡化等因素的影響，腦卒中已經(jīng)成為全球第二、中國首位的死亡原因［12］。CCH 導致的慢性腦缺血狀態(tài)是缺血性腦卒中的病理生理基礎，也是各種血管性癡呆的重要發(fā)病原因。有研究發(fā)現(xiàn)［13］，缺血性腦卒中后，機體會因處于應激狀態(tài)出現(xiàn)腹瀉，便秘，潰瘍和胃腸道出血等一系列的消化系統(tǒng)并發(fā)癥。Tascilar 等［14］的實驗表明，當缺血性卒中發(fā)生后，機體的腸道黏膜組織受損，導致菌群移位，細菌內(nèi)毒素進入機體，導致消化系統(tǒng)的防御能力變得脆弱，也使其他系統(tǒng)的病變更加嚴重。課題組前期實驗說明［9］，CCH 會導致大鼠長達 24 周的回腸黏膜屏障受損以及腸黏膜細胞間緊密連接蛋白claudin-3的表達降低。腸黏膜屏障分為化學屏障，生物屏障，免疫屏障和機械屏障，其中機械屏障是腸黏膜屏障發(fā)揮防御功能的基礎［15］。緊密連接蛋白以黏附方式存在于細胞之間，是組成機械屏障的分子基礎。作為緊密連接蛋白家族中最具有代表性的亞型之一，claudin-1 在人和大鼠的腸道上皮中均有表達。Iraha等［16］的研究結(jié)果表明，使用藥物增加claudin-1 的表達后，腸道黏膜的屏障功能明顯增強，因此可以通過claudin-1 的表達量作為評價腸道黏膜屏障功能的指標。本研究結(jié)果揭示，與sham 組比較，CCH 組大鼠回腸組織形態(tài)學結(jié)構(gòu)顯著受損，回腸黏膜上皮間claudin-1 表達量顯著降低。這與課題組前期實驗結(jié)果相符，說明CCH會導致大鼠腸黏膜屏障的損傷。

NF-κB 是細胞內(nèi)重要的核轉(zhuǎn)錄因子，它參與機體的免疫應答，炎癥反應，應激反應和細胞凋亡等病理生理過程［17］。NF-κB 通路激活后，會導致下游細胞產(chǎn)生大量炎癥因子，如TNF-α 和IL-6 等，這些炎癥因子的增加會活化NF-κB 導致炎癥級聯(lián)反應，加重炎癥的損害［18］。p65作為NF-κB的一個亞基，細胞在靜息狀態(tài)下，由于抑制性蛋白 IκB 的存在，NF-κB 蛋白二聚體處于失活狀態(tài)，在氧化應激或者炎癥反應條件下，會被磷酸化激活，NF-κB p65活化為p-p65并移至細胞核內(nèi)，激活通路下游一系列生理反應，導致白細胞浸潤，進一步調(diào)節(jié)炎性細胞釋放TNF-α 和IL-6 等炎癥因子［19］，因此 p-p65/p65 比值可以用來判斷NF-κB 信號通路的活化程度。OPN 作為一種機體反應性蛋白，在一般情況下表達量非常低。Ito 等［20］的研究表明，OPN 會激活 αvβ3 和 NF-κB 途徑上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶9 的含量，引發(fā)機體的炎癥反應。研究表明，敲除OPN 后大鼠的炎癥介質(zhì)和細胞因子形成受到抑制，與使用NF-κB 抑制劑的作用相似［21］，并且OPN 可能通過NF-κB 信號轉(zhuǎn)導通路參與了骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生與發(fā)展［22］。有研究表明［23］，在 IBD 動物模型下，通過促進NF-κB p65 的核轉(zhuǎn)位，實驗者觀察到通路下游炎癥因子IL-6 表達量升高，并且引起腸黏膜上皮緊密連接蛋白ZO-1 表達量降低，加重實驗動物炎癥性腸病的發(fā)生和發(fā)展。本研究結(jié)果表明，與SHAM 組比較，CCH 組大鼠回腸組織結(jié)構(gòu)顯著受損，腸黏膜上皮claudin-1 表達量降低，回腸組織OPN 表達量和 p-p65/p65 比值升高，血清 TNF-α 和 IL-6 含量升高。p-p65/p65 比值升高說明NF-κB 通路被激活，導致下游的炎性細胞釋放大量炎癥因子，而這些炎癥因子又可以正反饋增強NF-κB 的活化，出現(xiàn)炎癥因子“瀑布樣”效應，從而加重回腸黏膜屏障的損傷。

SV 作為 3-羥基-3-甲基-戊二酰輔酶 A 還原酶抑制劑，對心腦血管系統(tǒng)有多種有益作用。本課題組前期實驗表明，SV 可以減輕CCH 大鼠的認知行為障礙［10］；Zhao 等［24］的研究說明，在燒傷模型中，SV 可通過抑制NF-κB通路減少實驗動物的脾細胞凋亡；Han等［25］的實驗研究表明，SV 可通過抑制 NF-κB 通路來抑制糖尿病大鼠的心肌肥大；Lee 等［7］的研究表明，SV 可以通過抑制腸道上皮NF-κB 通路減輕小鼠急性結(jié)腸炎。以上研究結(jié)果表明，SV 可以通過抑制NF-κB 信號通路的激活來調(diào)控細胞凋亡和炎癥反應。本研究結(jié)果表明，與CCH 組和SC 組比較，SV 組大鼠回腸組織結(jié)構(gòu)損傷顯著減輕，腸黏膜上皮claudin-1表達量升高，回腸組織OPN 表達量和p-p65/p65比值降低，血清TNF-α 和IL-6 含量降低，說明辛伐他汀對CCH 損傷的大鼠腸黏膜屏障有保護作用，并且進一步說明CCH致大鼠腸黏膜屏障損傷可能是由于NF-κB通路激活所致。

綜上所述，CCH 會導致大鼠腸黏膜屏障損傷，可能與通過激活腸道NF-κB 通路導致炎癥因子TNF-α和IL-6 表達含量升高有關(guān)；SV 對CCH 損傷的腸黏膜屏障有保護作用。這可能為研究慢性腦缺血相關(guān)腸道功能損傷提供新的切入點，并且為CCH 所致的認知功能障礙及腸道功能損傷的預防和治療提供參考資料。