麥冬皂苷B通過(guò)p38信號(hào)通路誘導(dǎo)人骨肉瘤143B細(xì)胞凋亡*

陸建紅 ， 金益軍▲， 葉孝乾， 馬 彥， 陳君鑫 ， 黃曉文，3△

（1海警醫(yī)院檢驗(yàn)與病理科，浙江嘉興314000；2浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院骨科，浙江杭州310020；3嘉興市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江嘉興314000）

骨肉瘤是常見(jiàn)的惡性骨腫瘤，病情兇險(xiǎn)，好發(fā)于兒童及青少年，多發(fā)生于肱骨與脛骨近端以及股骨遠(yuǎn)端［1］，以運(yùn)動(dòng)障礙、疼痛和患處腫脹為主要臨床癥狀，且易發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，五年生存率僅70%左右［2］。傳統(tǒng)的治療方式為手術(shù)截肢，對(duì)患者的身心造成了極大的負(fù)面影響。近年來(lái)，盡管新輔助放化療和介入治療提高了保肢手術(shù)的成功率，但總體生存率仍無(wú)顯著提高［3］。因此，臨床診療工作中亟待尋求新型有效的骨肉瘤治療方案。麥冬皂苷B 在體外能夠有效促進(jìn)肝癌細(xì)胞的自噬［4］，也可通過(guò)微小RNA-34a（microRNA-34a，miR-34a）調(diào)控靶基因Met進(jìn)而抑制非小細(xì)胞肺癌的遷移［5］，能否作用于人骨肉瘤細(xì)胞，目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)CCK-8 實(shí)驗(yàn)、集落形成實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)、Hoechst 33258 染色、細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)及Western blot 法，探討麥冬皂苷B 抑制人骨肉瘤143B 細(xì)胞增殖的作用機(jī)制，為骨肉瘤治療新藥的探索提供可參考的理論依據(jù)。

材料和方法

1 主要儀器和試劑

垂直電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀和Amersham Imager 600 多功能成像系統(tǒng)（GE）；FACScanto II 流式細(xì)胞儀（BD）；PHOmo 酶標(biāo)儀（Autobio）；倒置熒光顯微鏡（Olympus）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（Panasonic）。

麥冬皂苷B（純度＞98%）購(gòu)自南京澤朗醫(yī)療科技有限公司；CCK-8 試劑盒和Hoechst 33258 染液購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司；結(jié)晶紫染液購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒購(gòu)自BD；Transwell 小室購(gòu)自Corning；抗cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2、GAPDH、p38、p-p38、JNK、p-JNK、ERK 和p-ERK 抗體均購(gòu)自Cell Signaling Technology。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人骨肉瘤143B 細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)中科院細(xì)胞庫(kù)，細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM 高糖培養(yǎng)液（含10%胎牛血清、1×105U/L 青霉素和100 mg/L 鏈霉素），并于37 ℃、5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

2.2 CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力 取指數(shù)生長(zhǎng)期的143B 細(xì)胞，按每孔5 000 個(gè)細(xì)胞種植于96 孔板。待其完全貼壁后，分別加入 0、1、5、10、20、30 和 40 μmol/L 終濃度的麥冬皂苷B，每個(gè)濃度設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h 后，吸去上層培養(yǎng)液，再加入10%的CCK-8 檢測(cè)液，置于37 ℃孵育2 h，利用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處各孔的吸光度（A）。細(xì)胞相對(duì)活力=實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值，并結(jié)合量效關(guān)系計(jì)算半數(shù)抑制濃度（half-maximal inhibitory concentration，IC50）。

2.3 集落形成實(shí)驗(yàn) 按每孔600 個(gè)細(xì)胞鋪于6 孔板上使其成為細(xì)胞集落，待第2 天細(xì)胞貼壁后，加入相應(yīng)濃度的麥冬皂苷B 處理，6 d 后用PBS 洗滌細(xì)胞，4%多聚甲醛固定20 min 后，使用0.1%的結(jié)晶紫染液染色30 min，洗滌烘干后觀察各孔143B 細(xì)胞集落形成數(shù)量并拍照計(jì)數(shù)。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 用無(wú)EDTA 的胰酶消化并收集上述不同分組的細(xì)胞，以1 500 r/min離心5min，用 PBS 洗滌 3 次，并重懸于 500 μL 1×binding buffer 中，分別加入5μL annexin V-FITC 與5μL PI 染色，避光孵育25 min 后，上機(jī)測(cè)量細(xì)胞早期凋亡與晚期凋亡的百分比。

2.5 Hoechst 33258 染色 將 143B 細(xì)胞種植于 6 孔板內(nèi)，待其貼壁后用不同濃度麥冬皂苷B 處理48 h，吸去培養(yǎng)液，PBS 輕輕洗滌2 次，加入Hoechst 33258染液染色30 min，棄去染色液，再次以PBS 洗滌后，置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.6 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 按每孔20 000 個(gè)的數(shù)量將143B 細(xì)胞鋪于Transwell 小室內(nèi)，同時(shí)加入不同濃度的麥冬皂苷B處理。培養(yǎng)板小室內(nèi)加入200 μL不含血清的DMEM 高糖培養(yǎng)液，下室內(nèi)加入500 μL 含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基，并放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。48 h 后用PBS 洗滌培養(yǎng)板，加入0.1%的結(jié)晶紫染液染色30 min，用PBS 洗滌后在顯微鏡下觀察并拍照。

2.7 Western blot 檢測(cè)蛋白水平 143B 細(xì)胞經(jīng)不同濃度麥冬皂苷B 和相應(yīng)抑制劑處理后，加入RIPA 裂解液（含有1%蛋白酶抑制劑和1%磷酸酶抑制劑），并于超聲波儀中裂解，定量后調(diào)齊內(nèi)參上樣。采用80 V 恒壓電泳20 min，后加大電壓至130 V 恒壓電泳，使得蛋白移動(dòng)至SDS-PAGE膠底部。取合適大小的PVDF膜甲醇激活，260 mA恒流轉(zhuǎn)膜120 min，隨后在5% BSA 封閉1 h，4 ℃冰箱孵育Ⅰ抗（1∶1 000）過(guò)夜。第 2 天取出對(duì)應(yīng) PVDF 膜，使用 TBST 洗滌 3 次，每次10 min。再加入Ⅱ抗（1∶5 000）室溫孵育90 min，用TBST 重復(fù)以上步驟洗滌3 次，進(jìn)行曝光并對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行灰度分析定量。

2.8 裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn) 取4 周齡的雌性裸鼠，于裸鼠背部接種5×106個(gè)143B 骨肉瘤細(xì)胞株。一周后，將小鼠隨機(jī)分成兩組，藥物組8 只以麥冬皂苷B（50 mg/kg）灌胃，對(duì)照組8 只以等體積生理鹽水灌胃，共21 d。1 月后，裸鼠實(shí)施安樂(lè)死，取下腫瘤，測(cè)量并計(jì)算腫瘤的重量與體積（腫瘤體積=腫瘤短徑2×腫瘤長(zhǎng)徑×1/2）。同時(shí)取下裸鼠心、肝、脾、肺與腎組織，4%多聚甲醛固定后，切片，行HE 染色，同時(shí)腫瘤組織行免疫組化實(shí)驗(yàn)，顯微鏡下拍照。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。CCK-8 實(shí)驗(yàn)、集落形成實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)凋亡檢測(cè)、蛋白灰度分析等單變量不同濃度間的比較采用單因素方差分析及Bonferroni 檢驗(yàn)；其他處理組與對(duì)照組之間的兩兩比較采用成組設(shè)計(jì)資料t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 麥冬皂苷B對(duì)143B細(xì)胞活力和增殖能力的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示麥冬皂苷B 對(duì)骨肉瘤143B 細(xì)胞的活力有顯著抑制作用，呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性，48 h 的IC50為（19.17±2.71）μmol/L，與對(duì)照組相比，各處理組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（F=132.4，P＜0.05），見(jiàn)圖1A；而麥冬皂苷B 對(duì)正常皮膚成纖維細(xì)胞毒性較低，僅在高濃度（40 μmol/L）時(shí)有輕微生長(zhǎng)抑制作用，見(jiàn)圖1B。

Figure 1.The inhibitory effect of ophiopogonin B on 143B cells.A：the results of CCK-8 assay showed the inhibitory effect of ophiopogonin B on the viability of 143B cells at 48 h；B：CCK-8 assay showed little inhibitory effect of ophiopogonin B on the viability of human primary skin fibroblasts（FB）at 48 h.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs 0 μmol/L group.圖1 麥冬皂苷B對(duì)143B細(xì)胞活力的抑制作用

此外，集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，麥冬皂苷B 能顯著抑制骨肉瘤143B 細(xì)胞的增殖能力，與對(duì)照組相比，各處理組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=69.9，P＜0.05），見(jiàn)圖2。

Figure 2.The effect of ophiopogonin B on colony formation ability of 143B cells.The cells were treated with ophiopogonin B at 0，10 and 30 μmol/L for 48 h.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs 0 μmol/L group.圖2 麥冬皂苷B抑制143B細(xì)胞的集落形成能力

2 麥冬皂苷B能促進(jìn)143B細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，麥冬皂苷B 能夠促進(jìn)143B 細(xì)胞凋亡，隨著藥物濃度增加，凋亡細(xì)胞比例逐漸上升，與對(duì)照組相比，各處理組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=94.49，P＜0.05），見(jiàn)圖3A。Hoechst 33258染色顯示，在熒光顯微鏡下，藥物處理后部分細(xì)胞的細(xì)胞核呈現(xiàn)致密濃染的高亮藍(lán)色熒光，且隨著藥物濃度的增加，高亮濃染細(xì)胞核的比例逐漸上升，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=69.96，P＜0.05），見(jiàn)圖3B。Westernblot 結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的上升，cleaved caspase-3 和Bax 的蛋白水平逐漸上升，而凋亡抑制蛋白Bcl-2 的水平逐漸下降，蛋白灰度分析結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，各處理組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖3C。

Figure 3.Ophiopogonin B induced apoptosis of 143B cells.A：annexin V-FITC/PI staining and flow cytometric analysis of the apoptosis of 143B cells treated with ophiopogonin B at 0，10 and 30 μmol/L for 48 h；B：Hoechst 33258 staining for evaluating the morphological changes of apoptotic cells；C：Western blot for determining the protein levels of cleaved-caspase-3，Bcl-2 and Bax.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs 0 μmol/L group.圖3 麥冬皂苷B誘導(dǎo)143B細(xì)胞凋亡發(fā)生

3 麥冬皂苷B對(duì)143B細(xì)胞遷移的抑制作用

Transwell 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，麥冬皂苷B能夠抑制骨肉瘤143B 細(xì)胞的遷移，且抑制作用隨濃度的增加而加強(qiáng)，與對(duì)照組相比，各處理組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=81.45，P＜0.05），見(jiàn)圖4。

Figure 4.Ophiopogonin B inhibited 143B cell migration.The cells were treated with ophiopogonin B at 0，10 and 30 μmol/L for 48 h.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs 0 μmol/L group.圖4 麥冬皂苷B抑制143B細(xì)胞遷移

4 麥冬皂苷B可激活p38通路

Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，麥冬皂苷B 可以激活p38 信號(hào)通路，p38 蛋白磷酸化程度隨著藥物的作用加強(qiáng)而上調(diào)，與對(duì)照相比，各藥物處理組p-p38/p38蛋白水平的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=58.18，P＜0.05）；而麥冬皂苷B 對(duì)JNK 信號(hào)通路與ERK 信號(hào)通路無(wú)顯著激活作用，見(jiàn)圖5。

Figure 5.Ophiopogonin B induced the activation of p38 signaling.Western blot was used to determine the protein levels of p-p38，p38，p-JNK，JNK，p-ERK and ERK in the 143B cells treated with ophiopogonin B at 0，10 and 30 μmol/L for 48 h.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs 0 μmol/L group.圖5 麥冬皂苷B激活p38信號(hào)通路

5 麥冬皂苷B通過(guò)p38信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞凋亡

為了進(jìn)一步研究p38 通路在麥冬皂苷B 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中所發(fā)揮的作用，我們將p38 通路抑制劑SB203580與麥冬皂苷B共處理48 h。

CCK-8 實(shí)驗(yàn)顯示，與藥物單獨(dú)處理組相比，共處理組在藥物低濃度時(shí)細(xì)胞活力無(wú)顯著差異，藥物中、高濃度時(shí)細(xì)胞活力顯著上升（48 h 藥物濃度為20 μmol/L 時(shí)，F(xiàn)=2.392，P＜0.05；48 h 藥物濃度為 30 μmol/L 時(shí)，F(xiàn)=2.333，P＜0.05；48 h 藥物濃度為 40 μmol/L時(shí)，F(xiàn)=6.404，P＜0.05），見(jiàn)圖6。

Figure 6.p38 inhibitor SB203580 reversed the drug-induced viability suppression in 143B cells treated with ophiopogonin B for 48 h.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs ophiopogonin B group.圖6 p38抑制劑SB203580可緩解麥冬皂苷B對(duì)143B細(xì)胞活力的抑制作用

Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與單藥物處理組相比，SB203580 與麥冬皂苷B 共處理組的p-p38/p38、cleaved caspase-3、Bcl-2 和 Bax 蛋白水平變化幅度顯著減少（p-p38/p38，F(xiàn)=6.482，P＜0.05；cleaved caspase-3，F(xiàn)=2.61，P＜0.05；Bcl-2，F(xiàn)=5.84，P＜0.05；Bax，F(xiàn)=1.187，P＜0.05），見(jiàn)圖7。因此，麥冬皂苷B可通過(guò)激活人骨肉瘤143B 細(xì)胞的p38 信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)凋亡的發(fā)生。

Figure 7.SB203580 reversed ophiopogonin B-induced 143B cell apoptosis.The cells were treated with ophiopogonin B at 30 μmol/L after pre-incubation of p38 inhibitor SB203580 at 10 μmol/L for 2 h.Western blot was used to determine the protein levels of p-p38，p38 cleaved caspase-3，Bcl-2 and Bax.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs ophiopogonin B group.圖7 SB203580能緩解麥冬皂苷B介導(dǎo)的143B細(xì)胞凋亡

6 麥冬皂苷B能抑制裸鼠皮下成瘤

裸鼠皮下成瘤結(jié)果顯示，麥冬皂苷B 能抑制裸鼠皮下腫瘤的生長(zhǎng)。麥冬皂苷B 灌胃21 d 后，藥物處理組腫瘤重量（0.525±0.235）g，對(duì)照組腫瘤重量為（0.983±0.307）g，與對(duì)照組相比，藥物處理組差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.71，P＜0.05）；藥物組腫瘤體積為（672.5±219.4）mm3，對(duì)照組腫瘤體積為（1207±362.9）mm3，與對(duì)照組相比，藥物處理組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2.736，P＜0.05），見(jiàn)圖8A。免疫組化結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，藥物處理組腫瘤組織中凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3 的蛋白水平顯著上升，而凋亡抑制蛋白Bcl-2 蛋白水平顯著下降，同時(shí)腫瘤組織中磷酸化p38 蛋白被顯著激活，與體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，見(jiàn)圖8B。此外，藥物處理后裸鼠的心、肝、脾、肺與腎組織并未發(fā)生損害，提示藥物在治療劑量?jī)?nèi)有較好的安全性，見(jiàn)圖8C。

Figure 8.Ophiopogonin B inhibited osteosarcoma xenograft growth in vivo.A：image of the xenograft tumors dissected from nude mice（n=8 in each group）was shown，and the ultimate weight and volume of the tumors were evaluated；B：HE staining and immunohistochemical staining（cleaved caspase-3，Bcl-2 and p-p38）of the tumors；C：HE staining of heart，liver，spleen，lung and kidney of the mice.Mean±SD. n=8.*P＜0.05 vs control group.圖8 麥冬皂苷B能抑制裸鼠皮下成瘤

討 論

骨肉瘤目前指南推薦的標(biāo)準(zhǔn)治療方案是術(shù)前（新輔助）化療、術(shù)中切除病灶和術(shù)后（輔助）化療，其中化療藥物主要包括甲氨蝶呤，異環(huán)磷酰胺，阿霉素和順鉑等［6-7］。盡管化療藥物對(duì)骨肉瘤在一定程度上起到了抑制作用，然而其對(duì)于細(xì)胞的非選擇性與高毒性給患者帶來(lái)了嚴(yán)重的不良反應(yīng)，譬如惡心嘔吐，脫發(fā)、頭暈和感染風(fēng)險(xiǎn)加劇等［8］。本研究表明，麥冬皂苷B在體外與體內(nèi)能有效抑制骨肉瘤143B細(xì)胞的增殖與遷移，通過(guò)激活p38 信號(hào)通路，促進(jìn)凋亡發(fā)生，從而起到抗腫瘤作用。

麥冬類(lèi)植物的主要成分為皂苷類(lèi)化合物，以螺旋甾烷為主要結(jié)構(gòu)，含有A、B、B'、C、C'、D 和D'七種甾體皂苷，而麥冬皂苷B 是從麥冬中提取的重要單體。Gao 等［9］此前報(bào)道麥冬皂苷 B 能夠通過(guò) JNK/c-Jun 信號(hào)通路抑制結(jié)腸癌的進(jìn)展。周志紅等［4］研究發(fā)現(xiàn)麥冬皂苷B 在體外能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞HepG2 自噬的發(fā)生，從而抑制肝癌細(xì)胞的增殖。此外，吳德芹等［10］報(bào)道在小鼠肺癌體內(nèi)模型中，麥冬皂苷B 能夠抑制非小細(xì)胞肺癌體內(nèi)的遷移。但有關(guān)麥冬皂苷B在人骨肉瘤細(xì)胞發(fā)生、進(jìn)展及凋亡中的作用機(jī)制研究尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

凋亡是一種以有序清除損傷細(xì)胞為目的的程序性死亡過(guò)程，形態(tài)學(xué)上以細(xì)胞皺縮和染色質(zhì)濃聚為最顯著特征［11］。凋亡不僅可被細(xì)胞內(nèi)信號(hào)激發(fā)，如基因毒性應(yīng)激反應(yīng)；也可以被細(xì)胞外信號(hào)激發(fā)，如細(xì)胞表面死亡受體的激活［12］。在腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展過(guò)程中，凋亡相關(guān)的信號(hào)失調(diào)是一個(gè)重要表現(xiàn)。因此，靶向調(diào)控凋亡相關(guān)信號(hào)通路的藥物成為了腫瘤治療的重中之重。我們通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和Hoechst 33258染色發(fā)現(xiàn)，在麥冬皂苷B 作用下的骨肉瘤細(xì)胞增殖顯著減弱，細(xì)胞存活率明顯下降，且出現(xiàn)染色質(zhì)濃聚、細(xì)胞皺縮、核碎裂等形態(tài)學(xué)表現(xiàn)。藥物作用下，裸鼠腫瘤組織的凋亡水平同樣上升，腫瘤生長(zhǎng)減慢，與體外細(xì)胞結(jié)果一致。為進(jìn)一步從分子水平探究凋亡的發(fā)生，我們檢測(cè)了典型的凋亡相關(guān)蛋白，結(jié)果顯示，麥冬皂苷B可促使凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3 和Bax 顯著上升，凋亡抑制因子Bcl-2 顯著下調(diào)，且呈現(xiàn)一定濃度相關(guān)性，這與流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果相佐證。此外，我們發(fā)現(xiàn)在治療劑量?jī)?nèi)，麥冬皂苷B 對(duì)正常細(xì)胞的毒性較低。在體外裸鼠成瘤模型中，麥冬皂苷B 有效的抑制了腫瘤的生長(zhǎng)，促進(jìn)了腫瘤的凋亡，且對(duì)各個(gè)主要器官均未造成明顯的毒副作用，體現(xiàn)了其良好的安全性。

目前研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多條與凋亡相關(guān)的信號(hào)通路，如p38 MAPK 信號(hào)通路、IL-6/STAT3通路等。p38信號(hào)通路作為經(jīng)典的MAPK 信號(hào)通路之一，與生物體內(nèi)多種病理生理過(guò)程密切相關(guān)。當(dāng)體內(nèi)的p38 蛋白異?；罨傲姿峄?，能與多種細(xì)胞因子、蛋白以及基因相互作用，激活凋亡信號(hào)IL-6/STAT3 通路。此前，有文章報(bào)道p38 MAPK在順鉑誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡中發(fā)揮了重要作用［13］。也有相關(guān)研究指出積雪草苷可以通過(guò)抑制NF-κB 與p38 通路減輕小鼠低氧性肺動(dòng)脈高壓［14］。本課題研究發(fā)現(xiàn)麥冬皂苷B 能特異性激活p38信號(hào)通路，但不影響JNK 和ERK通路。在此基礎(chǔ)上，我們添加了一種特異性的p38通路的抑制劑SB203580 與麥冬皂苷B 共處理48 h，發(fā)現(xiàn)中高濃度即能顯著逆轉(zhuǎn)麥冬皂苷B 對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的增殖抑制作用，隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)效果越明顯。

綜上所述，本課題通過(guò)細(xì)胞分子生物學(xué)檢測(cè)手段，探究了麥冬皂苷B 對(duì)骨肉瘤143B 細(xì)胞的抑制作用及相關(guān)分子機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)，一定量的麥冬皂苷B 能通過(guò)p38 MAPK 通路顯著抑制人骨肉瘤143B細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，且抑制作用與藥物劑量和作用時(shí)間呈正相關(guān)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果為麥冬皂苷B 未來(lái)是否可用于臨床骨肉瘤治療提供了實(shí)驗(yàn)與理論基礎(chǔ)。