基于Nrf2/HO-1信號通路研究迷迭香酸對抑郁模型大鼠的保護(hù)作用*

賴根祥， 朱桂東， 何慧明

（1麗水市第二人民醫(yī)院精神科，2麗水學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康學(xué)院科研辦，浙江麗水323000）

抑郁癥作為一種嚴(yán)重的情感障礙性精神疾病，其發(fā)病率逐年增加，并逐漸成為全球性公共衛(wèi)生問題，給人們帶來了沉重的健康和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［1］，因此尋找有效的抗抑郁藥迫在眉睫。過往認(rèn)為，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）失調(diào)和神經(jīng)遞質(zhì)改變等為抑郁癥的發(fā)病基礎(chǔ)，近年來腦內(nèi)炎癥和氧化應(yīng)激被認(rèn)為與抑郁癥密切相關(guān)［2］。研究顯示，環(huán)境中的慢性壓力可引發(fā)機(jī)體的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致大腦神經(jīng)細(xì)胞損傷，而腦損傷的過程也涉及高氧化應(yīng)激反應(yīng)［3-4］。通過提高抗氧化酶活性，可降低機(jī)體活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平，減輕其誘導(dǎo)的氧化損傷，并可抑制炎癥通路活化，保護(hù)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的完整性，從而減輕抑郁癥狀［5-6］。核因子E2 相關(guān)因子 2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）/血 紅 素 加 氧 酶 1（heme oxygenase-1，HO-1）信號通路為機(jī)體主要的抗氧化信號通路之一，在氧化應(yīng)激條件下，Nrf2 從與Keap1 結(jié)合的聚合物中釋放出來并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，與HO-1等基因的啟動子序列結(jié)合，引起其轉(zhuǎn)錄和蛋白水平變化，進(jìn)而激活細(xì)胞的抗氧化保護(hù)程序［7］。研究表明，Nrf2/HO-1 信號通路蛋白含量下調(diào)及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性降低，引起機(jī)體ROS 水平增高，在氧化應(yīng)激和炎癥損傷中發(fā)揮重要作用，與抑郁癥密切相關(guān)，可能是其治療靶標(biāo)［8］。由于目前抗抑郁藥僅可減輕或消除病理性抑郁情緒，不能影響其病理過程，且存在不同程度的副作用，因此，抑郁癥發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵通路可能成為新型抗抑郁藥物的作用靶點(diǎn)。

迷迭香酸（rosmarinic acid，RA）存在于薄荷和紫蘇等唇形科藥用植物中，具有抗氧化、消炎和抗凋亡等作用［9］。研究顯示，RA 可上調(diào) Nrf2 和 HO-1 的表達(dá)，減輕氧化應(yīng)激并抑制體內(nèi)神經(jīng)元死亡，具有神經(jīng)保護(hù)作用［10］。另有研究指出［11］，RA 可通過促進(jìn)海馬組織中ERK1/2的磷酸化，誘導(dǎo)其釋放BDNF，發(fā)揮抗抑郁作用。然而中藥可通過作用于多靶點(diǎn)在多維度發(fā)揮治療作用，RA 對抑郁癥的治療作用是否涉及Nrf2/HO-1 信號通路并不清楚。本研究采用孤養(yǎng)結(jié)合慢性不可預(yù)知性輕度刺激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）法復(fù)制抑郁癥大鼠模型，并基于Nrf2/HO-1 信號通路進(jìn)一步分析RA 對抑郁癥的治療機(jī)制。

材料和方法

1 動物

60 只 SPF 級 6 周齡雄性 SD 大鼠，體重 180～200 g，由河南省實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號為SCXK（豫）2017-0001。統(tǒng)一適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2 主要試劑及儀器

RA（純度≥98%；Sigma）；Nrf2 抑制劑 Nrf2-IN-1（MCE）；兔抗 HO-1、Nrf2 和 β-actin 單克隆抗體（CST）；兔抗NAD（P）H：醌氧化還原酶1［NAD（P）H：quinone oxidoreductase 1，NQO1］、核纖層蛋白B（lamin B）和離子鈣結(jié)合銜接分子1（ionized calciumbinding adapter molecule 1，Iba1）單克隆抗體、兔抗BDNF 多克隆抗體、Alexa Fluor?488 標(biāo)記的 IgG 及DAPI 試劑（Abcam）；ROS 和丙二醛（malonydialdehyde，MDA）檢測試劑盒（碧云天）；HE 染色試劑盒、SOD 檢測試劑盒及大鼠白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）、IL-1β 和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）ELISA 試劑盒（上海生工）。酶標(biāo)儀和轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（Bio-Rad）；多功能酶標(biāo)儀（BioTek）。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 抑郁癥模型的制備及分組 將大鼠隨機(jī)分為：對照（control，Cont）組、CUMS 組、CUMS+RA 組和CUMS+RA+Nrf2-IN-1 組，每組 15 只。除 Cont 組，均采用孤養(yǎng)結(jié)合CUMS 法復(fù)制大鼠抑郁癥模型［12］。3周后，大鼠活動減少、皮毛暗淡發(fā)黃、糖水偏好指數(shù)降低，表明抑郁癥模型造模成功。于第4～6 周每天固定時間，依次給予上述各組大鼠生理鹽水、生理鹽水、10 mg/kg RA［11］和10 mg/kg RA+1 mg/kg Nrf2-IN-1灌胃治療1 次，連續(xù)3 周，給藥期間繼續(xù)進(jìn)行CUMS刺激［12］。

3.2 糖水偏好實(shí)驗(yàn) 末次給藥24 h 后，在安靜環(huán)境中進(jìn)行該項實(shí)驗(yàn)。將大鼠單獨(dú)置于籠中，實(shí)驗(yàn)前2 d，放入加有1%蔗糖水溶液（200 mL）的2 個平口杯，以讓大鼠適應(yīng)糖水；第3 天禁水禁食24 h，第4 天放入分別加有純水（200 mL）和1%蔗糖水溶液（200 mL）的2 個平口杯，并稱取兩杯質(zhì)量，之后讓大鼠自由飲水，12 h 后更換兩杯位置，24 h 后再次稱取兩杯質(zhì)量。糖水偏好指數(shù)（%）=［蔗糖水消耗量（/蔗糖水消耗量+純水消耗量）］×100%。

3.3 強(qiáng)迫游泳和懸尾實(shí)驗(yàn) 強(qiáng)迫游泳和懸尾實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)［13-14］進(jìn)行，分別記錄大鼠被迫游泳和懸尾后4 min 內(nèi)的靜止時間。游泳靜止標(biāo)準(zhǔn)：四肢完全不動身體浮出水面、僅頭部浮于水面或四肢間歇性微幅劃動以保持漂浮狀態(tài)。懸尾靜止標(biāo)準(zhǔn)：四肢完全不動或間歇性微幅擺動。

3.4 樣本采集 方法3.3 完成后，每組取5 只大鼠，麻醉后用磷酸鹽緩沖液和4%多聚甲醛溶液灌注，取出大腦在4 ℃條件下浸入4%多聚甲醛固定24 h，轉(zhuǎn)移到20%蔗糖溶液中，-80 ℃儲存，進(jìn)行HE 染色和免疫熒光分析。剩余大鼠麻醉處死后，快速取出海馬組織，存儲在-80 ℃，進(jìn)行Western blot 和相應(yīng)檢測。

3.5 HE 染色和免疫熒光實(shí)驗(yàn) 將方法3.4 中冷凍的腦組織切片（10 μm），依次與蘇木素染液和伊紅染液孵育后，使用顯微鏡觀察海馬組織中受損的細(xì)胞。另外，將冷凍切片依次與Ⅰ抗［Iba1（1∶200）］、Alexa Fluor?488 標(biāo)記的Ⅱ抗（1∶500）和DAPI 避光孵育后，使用熒光顯微鏡觀察小膠質(zhì)細(xì)胞活化情況。

3.6 Western blot 實(shí)驗(yàn) 取方法3.4 凍存的部分海馬組織，裂解后提取總蛋白并采用試劑盒分別提取胞漿蛋白和核蛋白，均用BCA 法測定蛋白濃度。取30 μg 上述蛋白煮沸后上樣，電泳分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜并封閉，加入Ⅰ抗［HO-1（1∶1 000）、NQO1（1∶250）、BDNF（1∶500）、Nrf2（1∶500）、β-actin（1∶1 000）和lamin B（1∶500）］，4 ℃過夜孵育，洗膜，加入Ⅱ抗（1∶1 000）孵育1 h，顯影后使用Tanon 凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照并進(jìn)行灰度分析。

3.7 試劑盒檢測 取方法3.4 中凍存的海馬組織，稱重后制備勻漿液，取上清按照說明分別加入ROS、MDA、SOD、IL-6、IL-1β 和TNF-α 試劑盒中的相應(yīng)試劑。ROS 水平使用熒光酶標(biāo)儀檢測熒光強(qiáng)度表示；MDA 濃度使用酶標(biāo)儀在波長530 nm 處檢測吸光度；SOD 活性使用酶標(biāo)儀在波長560 nm 處檢測吸光度；IL-6、IL-1β 和 TNF-α 使用酶標(biāo)儀檢測波長 450 nm 處吸光度。對照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算上述指標(biāo)水平。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 25.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示計量數(shù)據(jù)。采用單因素方差分析行多組間比較，SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)一步兩兩比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 RA對CUMS大鼠抑郁樣行為的影響

與Cont 組相比，CUMS 組大鼠強(qiáng)迫游泳和懸尾靜止時間延長（P＜0.05），糖水偏好指數(shù)降低（P＜0.05）；與 CUMS 組相比，CUMS+RA 組大鼠強(qiáng)迫游泳和懸尾靜止時間縮短（P＜0.05），糖水偏好指數(shù)增高（P＜0.05）；與 CUMS+RA 組相比，CUMS+RA+Nrf2-IN-1 組強(qiáng)迫游泳和懸尾靜止時間延長（P＜0.05），糖水偏好指數(shù)降低（P＜0.05）。見表1。

表1 4組大鼠抑郁樣行為的比較Table 1.Comparison of depression-like behaviors in the 4 groups（Mean±SD. n=15）

2 RA對CUMS大鼠海馬神經(jīng)元的影響

HE 染色結(jié)果顯示，Cont 組海馬區(qū)神經(jīng)元排列致密，細(xì)胞邊界清楚，染色均勻；而CUMS 組海馬神經(jīng)元排列疏松紊亂，邊界模糊，胞核皺縮染色較深；給予RA 治療后，上述細(xì)胞損傷明顯改善，而Nrf2 抑制劑可逆轉(zhuǎn)這種改善作用。見圖1。

Figure 1.Morphological changes of hippocampal neurons in the 4 groups（HE staining）.The arrows showed degenerative neurons.A：Cont group；B：CUMS group；C：CUMS+RA group；D：CUMS+RA+Nrf2-IN-1 group.圖1 4組大鼠海馬神經(jīng)元的形態(tài)改變

3 RA對CUMS大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞浸潤的影響

Cont組Iba1+小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量較少，體積較??；而CUMS 組Iba1+小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量和突起較多，體積較大；與 CUMS 組相比，CUMS+RA 組 Iba1+小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量和突起減少，體積變??；與CUMS+RA 組相比，CUMS+RA+Nrf2-IN-1組Iba1+小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量和突起增多，體積增大。見圖2。

Figure 2.Infiltration of microglia in the 4 groups（Iba1 immunofluorescence staining）.A：Cont group；B：CUMS group；C：CUMS+RA group；D：CUMS+RA+Nrf2-IN-1 group.圖2 4組大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞浸潤情況

4 RA 對 CUMS 大鼠海馬組織中 IL-6、IL-1β 和TNF-α水平的影響

與 Cont 組相比，CUMS 組海馬組織中 IL-6、IL-1β和 TNF-α 水平上升（P＜0.05）；與 CUMS 組相比，CUMS+RA 組 IL-6、IL-1β 和 TNF-α 水 平下 降（P＜0.05）；與CUMS+RA組相比，CUMS+RA+Nrf2-IN-1組IL-6、IL-1β和TNF-α水平增高（P＜0.05）。見表2。

表2 4組大鼠海馬組織中IL-6、IL-1β和TNF-α水平的比較Table 2.Comparison of IL-6，IL-1β and TNF-α levels in the 4 groups（ng/L.Mean±SD. n=10）

5 RA對CUMS大鼠海馬組織中氧化應(yīng)激的影響

與 Cont 組相比，CUMS 組 ROS 和 MDA 水平升高（P＜0.05），SOD 活性降低（P＜0.05）；與 CUMS 組相比，CUMS+RA 組 ROS 和 MDA 水平下降（P＜0.05），SOD 活性升高（P＜0.05）；與 CUMS+RA 組相比，CUMS+RA+Nrf2-IN-1 組 ROS 和 MDA 水平升高（P＜0.05），SOD活性下降（P＜0.05）。見表3。

表3 4組大鼠ROS、MDA和SOD水平的比較Table 3.Comparison of ROS，MDA and SOD levels in the 4 groups（Mean±SD. n=10）

6 RA對CUMS大鼠海馬組織中Nrf2/HO-1信號通路相關(guān)蛋白的影響

與Cont 組相比，CUMS 組海馬組織中HO-1、NQO1、BDNF 及核/質(zhì) Nrf2 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；與 CUMS 組相比，CUMS+RA 組 HO-1、NQO1、BDNF及核/質(zhì)Nrf2 蛋白表達(dá)增高（P＜0.05）；與CUMS+RA組相比，CUMS+RA+Nrf2-IN-1 組HO-1、NQO1、BDNF及核/質(zhì)Nrf2蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），見圖3、表4。

Figure 3.The expression of Nrf2/HO-1 signaling pathway-related proteins in the 4 groups.A：Cont group；B：CUMS group；C：CUMS+RA group；D：CUMS+RA+Nrf2-IN-1 group.圖3 4 組大鼠海馬組織中Nrf2/HO-1 信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況

表4 4組大鼠海馬組織中Nrf2/HO-1信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的比較Table 4.The expression of Nrf2/HO-1 signaling pathway-related proteins in the 4 groups（Mean±SD. n=10）

討 論

抑郁癥為危害全球人類身心健康的常見精神疾病之一，臨床實(shí)踐中通常采用氟西汀等抗抑郁藥來治療抑郁癥，但只可減輕部分患者的抑郁情緒［15］，而不能從發(fā)病機(jī)制上實(shí)現(xiàn)治愈。大鼠等嚙齒類動物和人類之間的社交行為相似，因此常用來制備抑郁癥模型［16］。采用CUMS 法誘導(dǎo)的大鼠抑郁癥模型最明顯的特征是快感減退，這也是抑郁癥患者的基本癥狀，因此該模型可用于選擇理想的抗抑郁藥物及抑郁癥病理機(jī)制的進(jìn)一步研究［17］。

CUMS 暴露導(dǎo)致的抑郁癥伴隨有小膠質(zhì)細(xì)胞病變等神經(jīng)損傷，正常情況下，小膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中以靜息狀態(tài)存在，當(dāng)出現(xiàn)炎癥和創(chuàng)傷等異常刺激時被活化為具有巨噬細(xì)胞功能的狀態(tài)，介導(dǎo)神經(jīng)炎癥和神經(jīng)變性［18］，并分泌 IL-6、IL-1β 和 TNF-α等，在神經(jīng)炎癥損傷中起重要作用。因此，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥可能是減少抑郁樣行為的有效策略。本研究中，我們在CUMS 誘導(dǎo)的抑郁癥大鼠海馬組織中觀察到神經(jīng)元損傷和小膠質(zhì)細(xì)胞浸潤程度均顯著加重，且 IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平增高，證實(shí)了小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的海馬神經(jīng)炎癥損傷參與抑郁癥的病理過程，一方面，活化后的小膠質(zhì)細(xì)胞向損傷部位遷移，并分泌TNF-α 和ROS等因子，這些因子具有細(xì)胞毒性，會損傷或殺死神經(jīng)細(xì)胞，引起神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥［19］；另一方面，上述因子可進(jìn)一步加劇小膠質(zhì)細(xì)胞活化，加速神經(jīng)系統(tǒng)病變進(jìn)展，引起或加重神經(jīng)損傷［20］。

腦部氧化應(yīng)激和炎癥是相互影響的兩種病理過程，在抑郁癥［21］等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中共同發(fā)揮致病作用，Nrf2/HO-1 信號通路在其中發(fā)揮重要作用。當(dāng)腦部處于應(yīng)激狀態(tài)時，過量ROS 等刺激可使Nrf2與其阻遏蛋白Keap1 解離并誘導(dǎo)Nrf2 轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合，調(diào)節(jié)HO-1等抗氧化基因或BDNF 等表達(dá)，提高抗氧化和神經(jīng)保護(hù)能力［22］。本研究檢測顯示，CUMS 組大鼠海馬組織中HO-1 和NQO1 及核/質(zhì) Nrf2 蛋白表達(dá)較 Cont 組降低，表明海馬組織中Nrf2/HO-1 信號通路參與CUMS 大鼠抑郁癥的病理進(jìn)程。推測其機(jī)制可能為：（1）在CUMS 組大鼠中Nrf2/HO-1通路活化受抑，HO-1和NQO1等的表達(dá)較低，導(dǎo)致機(jī)體抗氧化能力較低，引起ROS 和MDA等水平升高，機(jī)體處于高氧化應(yīng)激狀態(tài)，損傷神經(jīng)系統(tǒng)［23］；（2）Nrf2/HO-1通路活化受抑引起B(yǎng)DNF等神經(jīng)保護(hù)因子水平降低，導(dǎo)致其對小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥和ROS 等氧化損傷的保護(hù)作用不足，從而加重抑郁癥的病理過程中神經(jīng)炎癥和腦氧化損傷［24］。

RA 具有抗氧化、抗焦慮和抗抑郁等藥理活性，可通過減少活性氧反應(yīng)性物質(zhì)的產(chǎn)生，降低脂多糖誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞壞死［25］，還可減輕脂多糖誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥和氧化應(yīng)激，改善小鼠記憶力和行為障礙［26］。本研究檢測到，給予 RA 治療后，CUMS 大鼠快感增加，抑郁樣行為和小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥減輕，IL-6、IL-1β、TNF-α、ROS 和 MDA 水平降低，HO-1、NQO1、BDNF 和核/質(zhì) Nrf2 蛋白表達(dá)及 SOD 水平均升高，表明RA 可活化Nrf2/HO-1 信號通路，減輕小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，改善CUMS 所致抑郁樣行為。分析其作用機(jī)制可能為：（1）RA 可促進(jìn) Nrf2/HO-1 信號通路活化來上調(diào)HO-1 和NQO1 等表達(dá)，增強(qiáng)清除ROS 的能力，減輕其造成的氧化損傷并阻斷其對炎癥反應(yīng)的激活，減少對神經(jīng)的損傷［27］；（2）RA 可減少小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥和炎癥因子產(chǎn)生，從而減輕神經(jīng)炎癥［28］；（3）RA 可增加BDNF 等表達(dá)，從而提高機(jī)體的神經(jīng)保護(hù)能力［29］。同時，本研究結(jié)果還顯示，RA 對CUMS 大鼠抑郁樣行為的改善作用及對氧化應(yīng)激和小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥的抑制作用可被Nrf2 抑制劑阻斷，進(jìn)一步佐證上述推測。

綜上所述，RA 可通過活化海馬組織中Nrf2/HO-1 信號通路，降低ROS 水平，抑制其造成的氧化應(yīng)激和炎癥損傷，減輕CUMS 大鼠抑郁癥狀，進(jìn)一步豐富了RA 的藥理機(jī)制。然而抑郁癥涉及機(jī)制復(fù)雜，且RA 可能作用于多通路進(jìn)而減輕抑郁癥狀，其作用機(jī)制有待繼續(xù)完善。